טכניקת זמן דיפרנציאלי מכתים יחד עם גיל דו-צדדי מלא denervation ללמוד Ionocytes בדגים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את התפשטות הציטים הברכיאליים בזימים של דגי זהב, חסרי עצבוב חיצוני. זה מושג על ידי הנחת הדג תחילה באמבט צבע ספציפי למיטוכונדריון כדי להכתים את המיטוכונדריה הקיימת, ציטים ברכיאליים עשירים. השלב השני הוא ביצוע ניתוק עצבים דו-צדדי מלא של הזימים.

לאחר מכן, הדגים מורדמים. הזימים נקצרים. ציטים מסומנים באמצעות נוגדן נגד נתרן אשלגן ב-TPAs.

לאחר מכן השלב האחרון הוא לדמות ולספור ציטים קיימים וחדשים. בסופו של דבר, הפעם נעשה שימוש בטכניקת צביעה דיפרנציאלית עם ניתוק עצבים של גילדה דו-צדדית כדי להראות את התפשטותם והתפלגותם של ציטי זימים בדגי זהב ללא כל קלט עצבי ממערכת העצבים המרכזית. אז היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי להבין את הספיגה הדינמית של יונים ולבחון את ההתפלגות מחדש של ציטים באפיתל מערכת העיכול של דגים.

ראשית, הכינו תמיסת מלאי אדומה של גשש מיטרלי מילי-מולרי על ידי המסת 50 מיקרוגרם ב-94 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד, והגנו מפני אור. לאחר מכן, הכינו שלוש עד שש קופסאות כהות בנפח מרבי של 600 מיליליטר. מלאו כל קופסה ב-400 מיליליטר מי מערכת והניחו אבן אוויר בכל אחת כדי לספק מקור חמצן.

הכניסו לקופסאות דגי זהב במשקל 30 עד 40 גרם. לאחר 30 דקות, הוסף את תמיסת Mitre Tracker כדי להניב ריכוז מלא של 0.1 צבע מיקרו-מולרי ו-0.01% DMSO. רחצו את הדג במשך ארבע שעות.

לאחר ארבע שעות, הפעל את זרימת המים לקופסאות ואפשר לצבע להישטף החוצה. אם מדובר בחיות ביקורת, יש לשחזר את הדגים למשך שלושה עד חמישה ימים, ואז להמשיך לאימונוהיסטוכימיה, אחרת להמשיך להליך ניתוק עצבים דו-צדדי מלא. ראשית, יש להרדים את הדגים על ידי הנחת הדג באמבט מים בנזוקאין מוגז.

לאחר הפסקת הנשימה, הניחו את הדג על שולחן ניתוחים והכניסו צינור לחלל הבוקאלי כדי להשקות את הזימים בתמיסת הרדמה מאווררת, מקם את הדג כך שהראש מוטה מעט כלפי מטה כדי לאפשר גישה טובה יותר לאזור שמאחורי קשת הזימים הרביעית. הרם בעדינות את האופרקולום בעזרת מלקחיים בתבנית סטנדרטית ישרה, ואז למקם מחזירי רקמות בין האופרקולום לחלק הפנימי של הראש. פתח בזהירות את מחזירי הרקמות כדי להרחיק את האופרקולום מהראש ולהשאיר את הזימים חשופים.

הנח את ידיות הנסיגה ליד הראש כדי לספק גישה לכל ארבע קשתות הזימים. בדוק שתמיסת ההרדמה משקה את הזימים והנח מלקחיים מעוקלים או ישרים בין קשת הזימים הרביעית לחלק האחורי של הראש. פתח בעדינות את המלקחיים כדי ליצור מתח ברצועה.

הצמדת קשת הזימים הרביעית לראש עם זוג מלקחיים מספר חמש. צור פתח של שניים עד שלושה מילימטרים על ידי ניקוב האפיתל, חיבור הקצה הגבי של קשתות הזימים לחלל האפרכסת. היזהר לא להיכנס עמוק מדי מכיוון שיש סיכון לפגיעה בכלי דם גדול.

לאחר מכן, החזיקו צמר גפן קטן עם מלקחיים מספר חמש, והשתמשו בו כדי להרחיב בזהירות את החתך כדי לחשוף את העצבים התשיעי והעשירי. שחרר את העצבים מכל רקמת חיבור באמצעות מלקחיים מספר חמש. שוב, הקפדה לא לפגוע בכלי הדם.

לאחר שהעצבים נחשפו וזוהו, השתמש במספריים הקפיציים המעוקלים כדי לחתוך בזהירות את העצבים תוך כדי החזקת החתך. פתח עם המלקחיים הישרים. לאחר ניתוק העצבים, יש למשוך בעדינות את המלקחיים המעוקלים ולהסיר את הרקמה.

אין צורך בתפרי מחזיר מכיוון שהחתך אמור להיסגר מעצמו תוך 24 עד 48 שעות. לאחר חזרה על ההליך בצד השני של הראש, העבירו את השקיית הזימים מהרדמה למים מאווררים טריים ואפשרו לדגים להתאושש מההרדמה. לאחר חידוש תנועות האפרכסת, העבירו את הדגים למכלי ניסוי כדי להתאושש למשך 24 שעות לפחות.

לבסוף, בצע הליך דמה על קבוצה נפרדת של דגים על ידי ניקוב האפיתל מאחורי קשת הזימים הרביעית מבלי לנתק את העצבים לפני המתת החסד של הדג. יש להניח שלושה עד ארבעה מיליליטר של 4% PFA לתוך בקבוקון נצנוץ. השתמש בבקבוקון אחד לכל קשת זימים.

בנוסף, קחו סירת מי גבינה קטנה ומלאו אותה ב-XPBS אחד. זה ישמש לשטיפת הרקמה לאחר כריתתה. שמור את כל הפתרונות על הקרח.

לאחר המתת חסד של הדג עם מנת יתר של בנזוקאין, השתמש במלקחיים קהים כדי להרים את הסלסול בצד אחד של הראש ובמספריים מעוקלים כדי לחתוך כל קצה של סל הזימים הברכיאלי. לאחר מכן, השתמש במלקחיים קהים כדי להרים בזהירות את הזימים על ידי המתלים ולהרים אותו מחלל האפרכסת. שטפו מיד את הזימים בקור קרח אחד XPBS כדי להסיר עודפי בנזן ודם והניחו את הזימים שנכרתו בבקבוקון מלא ב-4% PFA תקן את כל הזימים שנכרתו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס לאחר הקיבוע.

שטפו את ה-X-S-P-F-A ב-XPBS אחד, והניחו את הטישו בצינור כדורים של שני מיליליטר מלא ב-1.5 מיליליטר של 1% טריטון x. הניחו את צינורות הכדורים על שייקר למשך שש שעות בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. כדי לחלחל את הרקמה, הכינו דילול של 1 עד 250 של כל נוגדן ראשוני על ידי הוספת ארבעה מיקרוליטרים של הנוגדנים הראשוניים NKA ו-ZN 12 ל-992 מיקרוליטר של XPBS אחד.

ודא ששני הנוגדנים העיקריים הועלו באותו מארח. יש לשאוב את תמיסת הטריטון X ומבלי לשטוף תחילה את הרקמה ואת תמיסת הנוגדנים העיקרית ולדגור על שייקר במשך שש שעות בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, יש לשאוב את תמיסת הנוגדנים העיקרית ולשטוף את הנוגדן העיקרי שלוש פעמים למשך שלוש דקות כל אחת.

באמצעות XPBS אחד. הכן את הנוגדן המשני בדילול של 1 עד 200 על ידי ערבוב חמישה מיקרוליטר של נוגדן משני מלאי ל-995 מיקרוליטר של XPBS אחד. לאחר שאיבת PBS מהשטיפה האחרונה, יש למרוח את הנוגדן המשני ולדגור במשך שש שעות בטמפרטורת החדר או למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר.

לבסוף, הסירו את כל הנוגדנים המשניים העודפים על ידי שטיפת הרקמה שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת כמו קודם, לאחר השטיפות הרכיבו את הטישו על ידי הנחת זימים בטיפה של 200 מיקרוליטר של XPBS אחד על שקופית מיקרוסקופ שטוחה. כדי להבטיח שהרקמה לא תתייבש. הפרד את הזימים hemi ברינקס עם מספריים מיקרו מעוקלות.

לאחר מכן הנח טיפה של XPBS אחד וטיפה של אמצעי הרכבה לתוך השקע של מגלשה קעורה. הנח את ברנקי ההמי המופרדים לתוך המגלשה הקעורה כשהקצה המוביל של החוט פונה כלפי מעלה וכסה בהחלקת כיסוי, טפח את שולי החלקת הכיסוי בלק. על מנת למנוע מהחלקת הכיסוי להסתובב ולעקור את הרקמה, אפשר לרקמה להתיישב בתחתית המגלשה הקעורה למשך 10 עד 15 דקות לפני ההדמיה.

עבור כל קשת זימים, בחר שישה חוטי זימים באופן אקראי להדמיה והפק שש תמונות לכל קשת זימים. השתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית קונפוקלית כדי לדמות את הרקמה על ידי צילום פרוסות אופטיות של מיקרומטר אחד עד שלושה מיקרומטר בתמונות הבאות, ציטים המסומנים על ידי ראשי חץ נצבעו בנוגדני אלפא חמש ועצבים המסומנים על ידי חיצים נצבעו בנוגדני ZN 12. תמונה קונפוקלית זו של חוט זימים מדג ביקורת מציגה עצבוב חיצוני עם הסתעפות למלה נרחבת של צרור עצבים מרכזי, שמקורו ככל הנראה בעצבים התשיעי והעשירי כפי שניתן לראות בתמונה המוכנסת.

חלק מהציטים שצוינו הם גם עצבניים. תמונה זו מציגה חוט זימים יומיים לאחר ניתוק עצבים דו-צדדי מלא. הייתה הפחתה של צרור העצבים המרכזי בעוד שהעצבוב הלמינרי נראה שלם ברובו.

כאן, חוט זימים המוצג חמישה ימים לאחר ניתוק עצבים דו-צדדי מלא מדגים כי עצבוב חיצוני נעדר כעת במידה רבה. ניתוח איכותני מצביע על כך שניתוק עצבים דו-צדדי מלא גורם לפירוק של עצבוב הזימים החיצוני תוך שמירה על עצבים עם גופי תאים בתוך חוט הזימים, ויוצר רשת עצבים דרך החוט ולתוך הצולע. ניתן לשלב הליך זה עם שיטות אחרות כגון מדידת שטפי יונים, באמצעות יונים רדיואקטיביים כמו נתרן 22 על מנת לענות על שאלות מחקר נוספות.