אימונוהיסטוכימיה ותיוג מרובה עם נוגדנים ממיני Host אותו ללימוד למבוגרים בהיפוקמפוס נוירוגנזה
22 באפריל 2015
מאמר וידאו זה מדגים פרוטוקול מקיף לאיתור וכימות של כל שלבי הנוירוגנזה של ההיפוקמפוס במבוגרים באותו קטע רקמה. פיתחנו שיטה להתגבר על המגבלות של אימונופלואורסצנציה מרובה עקיפה המתעוררת כאשר נוגדנים מתאימים ממינים מארחים שונים אינם זמינים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוף את המגבלות של אימונופלואורסצנציה עקיפה כדי לחקור תאי אב עצביים. כאשר נוגדנים ראשוניים מתאימים ממינים מארחים שונים אינם זמינים. בתחילה, מוזרק אנלוגי תימידין כדי לתייג את התאים המתחלקים, ולאחר מכן הרקמה נקצרת, מעובדת ופורסת לחלקי קריו.
לאחר מכן מבוצעת אימונופלואורסצנציה מרובה ברצף כדי להתחיל. מוחל נוגדן ראשוני ללא תווית, אשר נקשר לאחר מכן על ידי נוגדן משני המסומן פלואורסצנטי. לאחר מכן, הפריקופים הפתוחים על הנוגדן המשני הראשון נחסמים בנסיוב ממין הנוגדנים הראשוני, וכל האימונוגלובולינים שניתן לזהות על ידי הנוגדן המשני השני מכוסים בשברי פאב לא מצומדים.
זה מאפשר לטפל ברקמה עם נוגדן ראשוני שני, שניתן לתייג על ידי נוגדן משני אחר. בסופו של דבר, תמונות של הקטעים משמשות לחקר ההתפתחות והוויסות של תאי אב עצביים בתגובה לגירויים ספציפיים ומעורבותם בתפקודי מוח מסוימים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו אימונופלואורסצנציה מרובה בו זמנית, הוא שהיא עוקפת בעיות הנובעות בדרך כלל מהצורך להשתמש בנוגדנים ראשוניים הגדלים באותו מין מארח.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוגנזה של מבוגרים, כגון התפשטות של תת-קבוצות אב בהיפוקמפוס בתגובה לגירויים פיזיולוגיים או פרמקולוגיים, פתולוגיות מוח או הזדקנות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהתיוג המרובה עם נוגדנים ראשוניים מאותו מין מארח עלול להוביל לפעילויות צולבות נוגדנים לא רצויות ללא חסימה מספקת. ראשית, שקלו את בעלי החיים להזרקה והכינו תמיסת מלאי אנלוגית טרייה של 10 מיליגרם למיליליטר תימידין להזרקה.
כאשר התמיסה מוכנה, הכינו מינון מותאם למשקל במזרק במינון עדין עם מחט מד 30. לאחר מכן רסנו את העכבר על ידי הקשקוש והזריקו את התימידין האנלוגי התוך-צפקי בנקודת הזמן הרצויה, הרדמו עמוק את העכבר וטרנס אירובי. החדרו אותו עם 10 מיליליטר PBS קר כקרח, ואחריו 40 מיליליטר תמיסת פורמלדהיד קרה כקרח.
לאחר מכן נתח את המוח ועמוד, תקן אותו באותו קיבוע לאחר הקיבוע. דגרו על המוחות שנאספו במשך 24 שעות בסוכרוז של 10% בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את המוח ל-30% סוכרוז ודגרו למשך 48 שעות נוספות.
כשהמוחות מוכנים להגנה מפני קריו, הקפיאו אותם בפנטן שלילי של 25 מעלות צלזיוס. מאוחר יותר, השתמש בקריוסטט כדי לחתוך קטעי עטרה של 40 מיקרון לאחסון לטווח הארוך. העבירו את החלקים לתמיסת נוזל לרדיאטור ושמרו אותם על 20 מעלות צלזיוס שליליות.
התחל בהעברת החלקים מתמיסת נוזל הקפאה ל- TBS בעזרת מברשת עדינה. שטפו היטב את החלקים, החל משטיפת לילה בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן חמש שטיפות של 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש לבצע את כל הדגירות הללו בתסיסה עדינה מתמשכת.
אם אחד האנטיגנים המעניינים הוא אנלוגי תימידין, יש ליישם שלב דנטורציה של חומצה הידרוכלורית בשלב זה, ואחריו שלב נטרול במאגר הקדח. המשך עם חדירות וחסימה של אתרי קשירת הנוגדנים הלא ספציפיים ב-TBS plus. הניחו לדגירה זו למשך שעה בטמפרטורת החדר, ואז דגרו בנוגדנים הראשוניים הראשוניים המדוללים ב-TBS פלוס לילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת.
שטפו את החלקים שלוש פעמים ב-TBS ופעם אחת ב-TBST. הניחו לכל אמבטיה למשך 10 דקות. לאחר מכן דגירה בנוגדנים משניים מצומדים פלואורוכרום ראשון למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר.
מעתה והלאה, הגן על החלקים מפני חשיפה לאור. לאחר סדרת שטיפה נוספת, העבירו את החלקים לתמיסת סרום של 10% מזן מארח שממנה נוצרו שני הנוגדנים העיקריים. דגרו את החלקים בתמיסה זו למשך שלוש שעות כדי להרוות את הפריקופות הפתוחות על הנוגדן המשני הראשון.
לאחר מכן יש לשטוף שלוש פעמים ב-TBS ופעם אחת ב-TBST כדי להסיר את הסרום. לאחר מכן הכינו תמיסה של TBS פלוס עם 50 מיקרוגרם למיליליטר של שברי פאב חד-ערכיים לא מצומדים המכוונים כנגד המין המארח של הנוגדן הראשוני. זה מכסה את האפיטופים שאחרת ניתן היה לזהות על ידי הנוגדן המשני השני.
מעבירים את החלקים לתמיסה זו ודוגרים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה יש לשטוף את החלקים לפחות שלוש פעמים ב-TBS ופעם אחת ב-TBST. במהלך ההעברות, ספוג את תוספות הרשת המכילות את החלקים על מגבת נייר כדי להסיר שאריות מדהימות שנותרו.
כעת דגרו את החלקים בנוגדנים העיקריים השני למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר סדרת שטיפה נוספת, יש למרוח את הנוגדן המשני השני למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר. לבסוף, שטפו את החלקים שלוש פעמים ב- TBS והמשיכו בהרכבת החלקים ג'לטין.
יבש את השקופיות באוויר וכסה אותן באמצעות תמונת מדיום הרכבה של ANTIFA. הקרינה מסומנת בקטעים עם מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. קח ערימות תמונות במיקומים אקראיים לאורך כל היקף הבליטה המשוננת בהגדלה של פי 400.
נתח לפחות 50 תאים מעניינים שנבחרו באקראי לכל חצי כדור לצורך תיוג משותף של הסמנים השונים. כדי לחשב מספרים מוחלטים עבור אוכלוסיות תאים יילודים ספציפיות, הכפל את אחוזי התאים המסומנים במספר הכולל של תאי יילוד כפי שהוערך מניתוח צביעת DAB. השיטות המתוארות שימשו לכימות ואפיון תאים שזה עתה נולדו בהיפוקמפוס לאחר הלידה ובוגר של מחזור חסר נוירוגנזה.
D מודל שני עכברי נוק-אאוט, צביעת DAB כנגד סמני התפשטות שונים כמו KI 67 או BRDU חשפה באופן עקבי הבדלים במספר התאים שזה עתה נולדו בין עכברי בר לעכברי נוק-אאוט. ניתן היה לפנוטיפ של תאים שזה עתה נולדו עם פרוטוקול אימונופלואורסצנטי מרובה קונבנציונאלי של יישום בו-זמנית של נוגדנים ראשוניים כנגד קן B-R-D-U-G-F-A-P ב-GFP וקורטין כפול. זה איפשר זיהוי מוצלח של תאי אב מסוג 1, 2 A, 2 B ו-3 בתוך דגימה אחת.
לחלופין, עם מרווחי זמן ארוכים יותר בין הזרקת BRDU להקרבת החיה, ניתן לנתח את המספרים הסופיים של נוירונים שזה עתה נולדו על ידי צביעה חיסונית חדשה של BRDU בו-זמנית. פרוטוקול התיוג החיסוני הרציף עבד בצורה מושלמת אם קטעים הודגרו תחילה במקביל עם נוגדנים נגד KI 67 של ארנב, אנטי GFP של עזים ונוגדנים נגד קורדון כפול של שרקנים, ושנית, עם נוגדנים נגד GFAP של ארנב, אך לא להיפך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין עד ארבעה אנטיגנים שונים בקטע הרקמה הבודדת באמצעות נוגדנים ראשוניים שגדלו באותו מארח.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכלול בקרות מתאימות כדי למנוע את האפשרות של נוגדנים, תגובתיות צולבת או תוצאות חיוביות כוזבות. שים לב שרצף הדגירה של הנוגדנים הראשוניים עשוי להשפיע מאוד על תוצאות הפרוטוקול.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר וידאו זה מדגים פרוטוקול מקיף לזיהוי ולכימות של כל שלבי הנוירוגנזה של ההיפוקמפוס במבוגרים בתוך אותו נתח רקמה. השיטה מתגברת על מגבלות של אימונופלורסצנציה מרובה עקיפה כאשר לא קיימים נוגדנים מתאימים ממיני מאכיל שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- נוירוגנזה
- אימונופלואורסצנציה
רקע
- נוירוגנזה של ההיפוקמפוס במבוגרים היא קריטית להבנת הפלסטיות של המוח.
- שיטות מסורתיות ניצבות בפני אתגרים בשל ספציפיות הנוגדנים.
- טכניקות של אימונופלורסצנציה ישירה יכולות לשפר את דיוק הזיהוי.
- מחקר זה מציג גישה חדשנית למתן מענה לאתגרים אלו.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לכימות של שלבי הנוירוגנזה.
- שיפור מהימנותן של טכניקות אימונופלורסצנציה.
- הקלה על חקר תאי אב עצביים.
שיטות בשימוש
- הזרקה של אנלוג של תימידין לסימון תאים המתחלקים.
- איסוף רקמות והכנתם כחתכים קריוגניים (cryo sections).
- יישום רצופי של מספר תגובות אימונופלואורסצנציה.
- חסימה של אתרי זיהוי של נוגדנים משניים באמצעות סרום ופרגמנטים מסוג fab.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של כל שלבי הנוירוגנזה בחתך בודד.
- סגוליות מוגברת והפחתת רעשי רקע בדימות.
- כימות משופר של תאי אב עצביים.
- הוכחת היתכנות של השיטה במגוון דגימות רקמה.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח נותן מענה יעיל למגבלות הנוגדנים.
- שיטה זו עשויה לקדם את המחקר בנוירוגנזה ובתחומים קשורים.
- מחקרים עתידיים יוכלו להשתמש בטכניקה זו להשגת תובבנות מעמיקות יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות מדויק של תתי-סוגי תאי מקור עצביים הוא קריטי להורדת סיכונים בתהליך התיקוף של מטרות בתוכניות למחלות ניווניות של מערכת העצבים. גישה זו של אימונופלואורסצנציה רב-ערוצית (multiplex) מאפשרת הערכה מקבילה של מצבי שכפול ודיפרנציאציה בתוך נתח רקמה בודד, ובכך משפרת את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים. באמצעות התגברות על מגבלות של מיני בעלי החיים המשמשים כמאכסני נוגדים, השיטה תומכת בהלימה של סממנים ביולוגיים (biomarkers) הניתנת לשכפול ולהרחבה במודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות הדינמיקה של תתי-סוגים ספציפיים של תאי פרוגניטור בתגובה לגירויים פיזיולוגיים או פרמקולוגיים.
- ערך תפעולי: מצמצם עמימות מכניסטית באמצעות זיהוי סימולטני של סממני פרוליפרציה ואנטיגנים ספציפיים לתת-סוג בתוך נתח אחד.
- ערך חזוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי אספקת נתונים כמותיים של נוירוגנזה, המומחצים לפי שלבים, עבור מחקרי מעורבות מטרה (target engagement) ומודולציית מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצר פלטי אימונופלואורסצנציה כמותיים וסטנדרטיים המתאימים לסריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של ספריות תרכובות המכוונות למסלולים נוירוגניים.
- שחזוריות: חסימה רצפית באמצעות סרום של מיני המארח ופרגמנטים של Fab ממזערת תגובתיות צולבת, מה שמבטיח זיהוי אות אמין בין חזרות.
- יכולת הרחבה: תואם לארכוב של חיתוכי קריו (cryo-section) ולזרימות עבודה של דימוג קונפוקאלי, מה שמאפשר מחקרים אורכיים במודלים של מחלות.
מחקר תרגומי ופקליני
- רלוונטיות למחלה: מקל על ניתוח מעורבותם של תתי-סוגי תאי פרוגניטור בפתולוגיות של המוח ובמדלי הגילא using סממנים מולקולריים מוגדרים.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין תצפיות פנוטיפיות משלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות כימות עקבי של תאי פרוגניטור.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק נתוני הפחתת סיכון מכניסטיים עבור מטרות המווסתות נוירוגנזה בהיפוקמפוס, ובכך תומך בקריטריונים של go/no-go בשלבים פרה-קליניים מוקדמים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף יעדים מוקדם דרך זיהוי מובילים (lead identification) והערכה פרה-קלינית, ומאפשרת קריאות של סממנים ביולוגיים ספציפיים לשלב, המנחים החלטות לגבי קידומו של התרכובת.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי כימות של סימון כפול של אנלוגים של תימידין עם סממנים של תת-סוגים של תאי דגם (למשל, GFAP, Nestin, Doublecortin) בתגובה לגירויים.
- סריקה: מספקת פלטי דימות קונפוקאלית כמותיים ומוכנים למשבצת בדיקה, המאפשרים השוואה של השפעות תרכובות על פרוליפרציה ודיפרנציאציה באזורים סוב-גרנולריים של ההיפוקמפוס.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של אחוזי תאים עם סימון כפול ומספרים מוחלטים של תאים חדשים הגזורים מצביעת DAB, ובכך תומכת בהחלטות קידום מבוססות נתונים.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם אסטרטגיות של סממנים ביולוגים על ידי מעקב אחר דינמיקה של תאי דגם ספציפיים לשלב, הרלוונטית לנקודות סיום קוגניטיביות וקשורות למצב רוח במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה של אימונופלורסצנציה שניתן להשתמש בה שוב, הישמה על פני גירויים מרובים המעודדים נוירוגנזה ומודלים גנטיים, ובכך מפחיתה פיתוח כפיל של משבצות בדיקה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את רמת הביטחון בתיקוף המטרה על ידי הפחתת תוצאות חיוביות שגויות באמצעות חסימה רצפית של אתרי זיהוי הנוגדנים המשניים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות בזיהוי אנטיגנים מרובה (multiplex), וממזער שונות במחקרי פונקציונליות מוצלבים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי אספקת תובנות מכניסטיות לגבי ויסות של תתי-סוגי תאי פרוגניטור, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות מחקר של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתיעדוף מטרות מותאם סיכון, המבוסס על נתונים כמותיים של נוירוגנזה ברזולוציית שלבים ממודלים פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באופטימיזציה של אימונופלורסצנציה, כולל טיטול של נוגדנים ותזמון של דגירה רצפית.
- תלוי בתשתית של מיקרוסקופיה קונפוקלית ובכלים לניתוח תמונות לצורך כימות קולוקליזציה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי חסימה (סרום של מין המארח ופרגמנטים מסוג Fab) כדי למנוע פעילויות צולבות של נוגדנים.
- שיקולי התאמה כוללים את יעילות השחזור של האנטיגן ואת חדירות הרקמה תחת פרדיגמות קיבוע ומערכות מודל שונות.
- מגבלות מעשיות כוללות אפשרות למיסוך של אפיטופים במהלך דגירות רצפיות ואת הצורך באופטימיזציה אמפירית של סדר הנוגדנים כדי למזער את הרקע.
שאלות נפוצות בתחומי הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
2:17
Injection of Thymidine Analogs and Tissue Preparation
3:38
Sequential Multiple-Immunofluorescence with Primary Antibodies from the Same Host Species
6:27
Imaging and Data Analysis
7:05
Newborn Hippocampal Cells in Cyclin D2 Deficient Mice
8:42
Conclusion
