Isothermal הגברה מבחני בתיווך לולאה (LAMP) לאיתור המינים ספציפי של

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאבחן את הופעתם של טפילים מסוג I myea בלהקת תרנגולות או תרנגולות. זה מושג על ידי הכנת הריאגנטים תחילה להגברה איזותרמית בתיווך לולאה או תגובת מנורה. לאחר מכן, ה-DNA הגנומי הכולל מוכן מאתר מעיים אחד או יותר לאחר המוות.

לאחר מכן מתווסף ה-DNA הגנומי לתערובת מאסטר המנורה ומודגר. לבסוף, מעריכים את תוצאת בדיקת המנורה. בסופו של דבר, LAMP משמש לקביעת הופעתם של מינים ספציפיים של I miria כדי לשפר את ניהול המלאי וככלי לאבחון מחלות.

אז היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות מסורתיות כמו מיקרוסקופיה מורפולוגית או PCR מכיוון שהיא פחות סובייקטיבית ואינה דורשת מתקני מעבדה יקרים. שימוש בגישה זו יכול לשפר את בריאות ורווחת התרנגולות על ידי שיפור האבחון של זיהום ארי. כדי להכין את התבנית למנורת Erea ase, בחר את קטע המעי לבדיקה.

השתמש בטבלה זו כמדריך לדגימת בחירת האתר ומיני האריה שסביר להניח שיהיו נוכחים. יש לכך חשיבות מרכזית מכיוון שכל מין שמדביק תרנגולות מוגדר על ידי אזור המעיים אליו הוא מכוון באמצעות מספריים סטריליים או אזמל. יש להוציא אורכים של חמישה סנטימטרים או יותר מחלקי המעיים שנבחרו לבדיקת אריה.

חותכים את הדגימה פתוחה לאורך. הסר את רוב תוכן המעיים והשתמש בקצה מיקרוסקופ זכוכית סטרילי. החלק או עקר את להב המספריים כדי לגרד לשחרר את התאים מהשכבה הרירית.

הכניסו את החומר המגורד לצינור מיקרו צנטריפוגה עליון בורג סטרילי של 1.5 מיליליטר המכיל 100 מיקרוליטר TE סטרילי עם משקל של 10%, אך תא נפח X 100 שרף והברג היטב בחלקו העליון. לנער את הדגימות במרץ למשך דקה אחת, ואז לדגור באמבט מים רותחים למשך 10 דקות. לאחר הרתיחה, הניחו לכל דגימה להתקרר בטמפרטורת הסביבה למשך דקה עד שתיים.

צנטריפוגה את הדגימות ב-10,000 פעמים G למשך דקה אחת לפני איסוף שני מיקרוליטרים של בדיקת הסופרנטנט לכל מנורה שישמשו כתבנית להכנת מלאי פריימר מנורת I miria המתאימים ל-100 בדיקות. הרכיב מחדש כל פריימר מנורת I miria ליופיליזציה על ידי הוספת מים בדרגה מולקולרית לריכוז של 100 פיפטה מיקרו-מולרית 60 מיקרוליטר של מים בדרגה מולקולרית לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה נפרד של 0.5 מיליליטר עבור כל מין איריה לבדיקה. שימוש בנפח המוצג בטבלה זו.

הוסף למים פריימרים, F-I-P-B-I-P-F שלוש B, 3 LF ו-LB ספציפיים למין המטרה. יצירת סדרה של שבעה תערובות פריימר ספציפיות למין. הפוך בקצרה את תמיסות הפריימר כדי לערבב אותן, הן דופקות מיקרו פוגה ומקפיאות עד הצורך.

באמצעות הנפחים המפורטים בטבלה זו וההנחיות בפרוטוקול הטקסט, הכינו תערובת מאסטר לתגובת מנורה עבור כל מין איריה לבדיקה לביצוע בדיקת המנורה פיפטה 23 מיקרוליטר של תערובת מאסטר של מנורת פולימראז ספציפית למיני IEA B-S-G-D-N-A לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר. הוסף שני מיקרוליטרים של תבנית DNA שהוכנה בעבר ויצר נפח תגובה סופי של 25 מיקרוליטר כבקרה חיובית. הוסף שני מיקרוליטרים של DNA גנומי ספציפי למין אריה לתגובה אחת.

הוסף שני מיקרוליטרים של מים בדרגה מולקולרית לתגובה כבקרה שלילית המדגרת אמבט מים או גוש חום ב 62 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לחלופין, השבת את הפולימראז B-S-T-D-N-A על ידי חימום ל-80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אם התגובה לא תיקרא מיד בסיום הדגירה באור פנימי, העריכו את הצבע של כל תגובה בעין.

תוצאות שליליות יופיעו בצבע ורוד עד סגול ויופיעו תוצאות חיוביות. כחול שמיים אופציונלי. כדי לאשר את תוצאת בדיקת המנורה, ערבב חמישה מיקרוליטר של מוצר תגובת מנורה עם מיקרוליטר אחד של מאגר טעינת ג'ל DNA והפעל על ג'ל prestain 2% ARO.

השתמש בסולם DNA בגודל מולקולרי של בסיס רוצח אחד כדי לקבוע את גודל השבר הבודק שלוש. ציפורים שנאספו מחוות פטם בארה"ב כחלק מתוכנית מעקב הניבו שלוש קבוצות של דגימות מעיים כפי שמוצג כאן. יישום ממוקד של מבחני המנורה הספציפיים למין ותעדוף אתרי המעיים המועדפים עבור כל I miria.

המינים אפשרו זיהוי ויזואלי של זיהום אירי בכל הציפורים שנבדקו תוך שימוש בכחול הידרוקסי כאינדיקטור. הצבע המושג בתגובת מנורה שלילית בעת שימוש בהידרוקסי יכול לנוע בין סגול לוורוד, אך הוא תמיד שונה מהכחול המושג על ידי תוצאה חיובית. אישור על ידי אלקטרופורזה של ג'ל aose סיפק תוצאות דומות כפי שמוצג כאן.

הכנת ה-DNA מדגימה אחת שנמשכה לכל ציפור המייצגת חומר שנאסף מכל אחד מאתרי המעיים הספציפיים ונבדק עם כל שבעת מבחני המנורות סיפקה את אותה תוצאה כמו כאשר כל אתר מעי עובד בנפרד לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 45 דקות אם היא נעשית כראוי לאחר הליך זה. ניתן לבצע טכניקות אחרות כמו ניקוד נגעים על מנת להעריך את בריאות המעיים הכללית.