Name: דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: למד לייצר שתלים וסקולריים פונקציונליים מPiPSCs וסקפולדים מופרדים תאית בעכבר. הפרוטוקול כולל זריעה כפולה בביוריאקטור והשתלה לבחינת שרידות ואינטגרציה רקמתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן הלב הבריטית וקרן אוק.

לבצע את כל הניסויים בבעלי החיים על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לשימוש וטיפול בחי מעבדה. 1. הכנת תרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תקשורת ותרבות לשורת תאי פיברובלסטים אנושית CCL-153: F-12K בינוני, 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -100 U / ml פניצילין וסטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תכנות מחדש מדיה עבור דור PiPSC: בינוני הנשר שונה של Knockout Dulbecco (DMEM) המכיל 20% החלפת סרום Knockout, 0.1 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, 0.1 מ&quot;מ המינימלי בינוני (MEM) שאינו חיוני חומצות אמינו, 10 ng Essential / בסיסי פיברובלסטים Growth Factor מיליליטר 2 / פניצילין (bFGF-2) ו- 100 מיליליטר U וסטרפטומיצין. להוסיף bFGF-2 טרי בכל פעם לפני השימוש באמצעי התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידול לעשות בידול מדיה (DM) כדי לעורר תאי שריר חלק (SMC): α-ממ מדיה המכילה 10% FBS, גורם גדילה 0.1 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, 100 U / ng פניצילין וסטרפטומיצין ו -25 מיליליטר / מיליליטר נגזר טסיות הדם(PDGF-ββ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך האנדותל בידול מדיה (EC-DM) כדי לעורר תאי אנדותל בידול (EC): צמיחת האנדותל תקשורת-2 (EGM-2) מדיה המכילה 50 ng / ml כלי דם האנדותל Growth Factor (VEGF) ו- 100 U / ml פניצילין וסטרפטומיצין. </li></ol> 2. Fibroblasts תכנות מחדש האנושי לתאי גזע pluripotent חלקית מושרים (PiPSC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורת תאי פיברובלסטים אנושית תרבות CCL-153 בצלוחיות מצופים פתרון ג&#39;לטין 0.04% במדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מעבר כל 3 ימים ביחס של 1: 6. השתמש בתאים לפני המעבר 9 ליעילות אופטימלית של דור PiPSC. תאים מוכנים transfection עם הגיע 80 - confluency 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize pCAG2LMKOSimO פלסמיד polycistronic המכיל 4 גורמי תכנות מחדש גורם שעתוק 4 (Oct4) מחייב octamer, Sox2, גורם כמו-Kruppel 4 (KLF4) ו- C-MYC (pCAG-OSKM). לעכל 5 מיקרוגרם של פלסמיד עם 5 יחידות של אנזים הגבלת PvuI במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס. לטהרפלסמיד עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect 2 x 10 6 fibroblasts אדם עם 4 מיקרוגרם של פלסמיד pCAG-OSKM לינארית על ידי electroporation עם ערכת פיברובלסטים עור האנושיים nucleofection (NHDF) על פי הפרוטוקול של היצרן. בעדינות תאי זרע transfected על 0.04% בקבוק T25 מראש ג&#39;לטין מצופה המכיל 5 מיליליטר של תכנות מחדש Media מראש חימם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, לשנות בינוני עם תוספים של 25 מיקרוגרם / מיליליטר נאומיצין כדי לבחור אוכלוסייה טהורה של תאי transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית בכל יום אחר, עד שיום 4. הערה: fibroblasts אדם הפך PiPSC לאחר 4 ימים של תכנות מחדש. </li></ol> 3. בידול של PiPSC להאנדותל ותאי שריר חלק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PiPSC זרע על מנות מצופים מראש IV קולגן המכילות DM במשך 4 ימים כדי לגרום להתמיינות לSMCs. שנה בינונית בכל יום אחר, עד שיום 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PiPSC זרע על קולגן IV ג מנות מצופים מראשontaining אנדותל-DM במשך 6 ימים כדי לגרום להתמיינות לתאי אנדותל. שנה בינונית בכל יום אחר, עד שיום 6. </li></ol> 4. decellularized אב העורקים שתל הכנה הערה: כל הפתרונות והציוד צריכים להיות סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם ולתקן את העכבר במצב שכיבה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את עצם החזה וסביב כלוב הצלעות כדי לפתוח את חלל בית החזה. הסר את הלב, ריאות והוושט כדי לחשוף את אב העורקים. הוצא בעדינות את שומן פרי אב העורקים עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את אב העורקים מהקצה הקדמי עם מספריים ובעדינות להחזיק את הקצה עם מלקחיים בוטים. לנתק את אב העורקים מעמודת עמוד השדרה מאחור על ידי נתיחה בוטה. לסגור היטב את כל העורקים מסתעפים מאב העורקים על ידי קשירה עם electrocoagulator דו קוטבי וחיתוך מהקצה הרחוק של קשירה עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק 5 מיליליטר לשטוף את לומן אב העורקים עם 3 מ &#39;l של תמיסת מלח המכילה של הפרין 100 U כדי למנוע היווצרות קרישי דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הקצה האחורי של אב העורקים לפני שהסניפים לכליות. שמירה על השלמות של אב העורקים היא מאוד חשובה במהלך ההליך כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את לומן אב העורקים עם 5 מיליליטר של תמיסת 0.075% סולפט dodecyl נתרן (SDS) בדילול מלא בופר פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את אב העורקים החזי ב0.075% SDS פתרון בצלחת פטרי 10 סנטימטרים. מניחים את צלחת פטרי על שייקר מסלולית לשעה 2 ב 150 סל&quot;ד ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את לומן אב העורקים עם 5 מיליליטר של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את אב העורקים בPBS בצלחת פטרי 10 סנטימטרים. מניחים את צלחת פטרי בייקר מסלולית לשעה 2 ב 150 סל&quot;ד ב RT. רענן PBS כל 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את לומן אב העורקים עם 5 מיליליטר של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור שתל אב העורקים decellularized PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. </li></ol> 5. Dual זריעה של PiPSC וBioreactor אוויר הערה: כל הפתרוןים וציוד צריך להיות סטרילי. לבצע את כל הפעולות בברדס בתרבית רקמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את זרימת bioreactor המעגל כפי שמודגם באיור 1. חבר תא דגירה, מאגר המדיה, משאבת peristaltic וקאמרית עמידה בצינורות. נפח מינימאלי של המדיום הדרוש למחזור הוא 40 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנאי מוקדם כלי decellularized עם מדיום תרבות על ידי שריה באב העורקים הבינוני DM בצלחת פטרי 10 סנטימטרים. מניחים את צלחת פטרי בייקר מסלולית עבור שעה 1 ב 50 סל&quot;ד ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס צינורות ניילון אורך 1 סנטימטר (0.9 מ&quot;מ OD, מ&quot;מ ID 0.75) לשני הקצוות של כלי השיט decellularized תחת מיקרוסקופ. לקשור את הכלי וצינורות עם 8-0 תפרי משי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב שתל אב העורקים decellularized בתא הדגירה על ידי חיבור צינורות ניילון עם יציאות כניסה ויציאה (1/32 &quot;צינורות) מקיר התא. לשמור על תא דגירה עם 5mls של מדיום בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize PiPSC על ידי הוספה מראש התחממתיטריפסין כדי לכסות את המנה התרבות ונער בעדינות את הצלחת 10 פעמים. מחק את טריפסין ולהשאיר את הצלחת בחממה במשך 2-3 דקות. הוסף בינוני תרבות המחוממת מראש בצלחת ומערבבים בינוניים עם התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מספר תאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה שני aliquots של השעיות תא המכילות 5 x 10 5 תאים כל אחד במשך 5 דקות ב 300 x גרם. לשאוב supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר aspirating supernatant לחלוטין, resuspend גלולה 1 של כדורי תא פיפס ב -50 μl של DM. להזריק השעיה תא זה ללומן כלי decellularized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, resuspend תא גלולה פיפס האחר בMatrigel של 100 μl. בזהירות פיפטה את התערובת על שתל אב העורקים decellularized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה במשך 10 - 15 דקות עד שהתערובת הופכת למדינה כמו ג&#39;ל ובאופן שווה עוטף את פני השטח החיצוניים הכלי. למלא את תא הדגירה עם DM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את כל bioreactor הגדרה ב5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. באופן ידני לסובב את שתל decellularized 90 ° סביב ציר האורך כל חצי שעה בשעה 2 הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תרבות סטטית עבור 12 שעות כדי לאפשר הידבקות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק DM באמצעות לומן על ידי משאבת peristaltic לגרום להתמיינות תאי שריר חלק. התחל קצב זרימה ראשוני בשעה 5 מיליליטר / דקה ועלייה בשלבים עד 20 מיליליטר / דקה מעל 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את קצב זרימה הבינוני במחזור של 20 מיליליטר / דקה למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את הזרימה בינונית ולהעביר את bioreactor יציאה של החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-זרע לומן של השתל עם PiPSC. Trypsinize, לספור ו צנטריפוגות 1 x 10 6 PiPSC כמו בשלבים 5.5-5.6. Resuspend התאים 50 μl של EGM-2 בינוניים מכיל 50 ng / ml VEGF. להזריק את תערובת התאים לתוך לומן של השתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום בתא הדגירה וכל מחזור לEGM-2 בינוניות מכיל 50 מיליליטר VEGF / ng לגרום להתמיינות אנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את bioreactor שוב את הגדרת החממת דואר. באופן ידני לסובב את השתל 90 ° כל 30 דקות בשעה 2 הראשונה ולאחר מכן לשמור על תרבות סטטית עבור 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל במחזור הזרימה בין 5 מיליליטר / דקה ועלייה בשלבים ל -35 מיליליטר / דקה. שמור את קצב הזרימה ב 35 מיליליטר / דקה במשך 5 ימים. שינוי במחזור והתא בינוני בכל יום אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את השתל המהונדס להשתלה נוספת לעכבר. </li></ol> 6. הארכת כפול זרע PiPSC השתל לתוך עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SCID השימוש NOD.CB17-Prkdc / עכברי זכרי NcrCrl כמקבלי שתל כלי. תמיד להבטיח שהעכברים כ -10 שבועות, שוקלים בערך 25 - 35 גרם, ונמצאים במצבים בריאותיים טובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר נמען על ידי מתן שילוב של Hypnorm (25 מ&quot;ג / קילוגרם) וHypnovel (25 מ&quot;ג / קילוגרם) intraperitoneally. החל משחת עיני וזלין על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. לאשר הרדמה יעילה על ידי הבטחה שיש לי עכברים שרירים רגועים ונושמים בהתמדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העכבר במצב שכיבה עם צווארה המגולח ומורחב. לנהל סולפט אטרופין (1.7 מ&quot;ג / קילוגרם) בשילוב עם חומרי ההרדמה על מנת להבטיח כי בדרכי הנשימה העכבר נשארה ברורות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חתך קו האמצע מהלסת התחתונה לעצם החזה של העכבר. תחת מיקרוסקופ לנתח עם 5 להגברה של פי 10, להרים את בלוטות רוק תקין רוחבית ולהסיר את השרירים cleidomastoid זכות לחשוף את עורק התרדמה המשותף תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר רקמות המצורפות לגייס את עורק התרדמה המשותף הימני מהקצה הדיסטלי לקראת הסוף הפרוקסימלי. ולקשור את החלק האמצעי של עורק התרדמה המשותף פעמיים עם תפר משי 8-0 ולנתח בין שני הקשרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר דרך שרוול עשוי מצינור ניילון autoclavable בכל קצה ספינה ולתקן כל קצה עם מהדק microhemostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עניבת תפר בקצה אחד ולהחיל ירידה של הפרין (100 U / ml). מייד לאחר מכן, להפוך את הקצה הדיסטלי של העורק דואר כדי לכסות את כל גוף השרוול ולתקן את הספינה ההפוכה עם תפר 8-0 משי לשרוול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותו ההליך לחלק האחר של העורק. עורק סומק עם תמיסת מלח כדי להסיר קרישי דם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתל שתל כלי decellularized בין שני קצוות של עורק התרדמה על-ידי החלקת קצות כלי decellularized של מעל אזיקי העורק ולתקן את זה עם 8-0 תפרי משי. הסר מלחציים כלי דם משני מסתיים לפני הערכת הפעימה של השתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את בלוטת רוק הזכות חזרה למקומו המקורי. סגור את העור על המיקום כירורגית עם תפר שהופסק באמצעות תפר 6-0 polyglactin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן עקבי לשמור סימנים חיוניים של עכבר לאחר ההליך הושלם, עד שיתחדש תודעה. להקריב את עכברי נמען באמצעות שתלי נקע וכלי קציר צוואר רחם או hr 24 או 3 שבועות מאוחר יותר לניתוח נוסף. </li></ol>

<ol><li>Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Tissue-Engineered+Vascular+Grafts+for+Cardiac+Surgery%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).</li>
<li>Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+follow-up+of+patients+with+synthetic+right+heart+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits.</a> Circulation. 72, II77-II83 (1985).</li>
<li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+insight%3A+the+evolution+of+tissue-engineered+vascular+grafts-from+research+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).</li>
<li>Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+blood+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of blood vessel.</a> J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).</li>
<li>Cearbhaill, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+mesenchymal+stem+cells+to+the+biomechanical+environment+of+the+endothelium+on+a+flexible+tubular+silicone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate.</a> Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).</li>
<li>Gong, Z., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+%28hMSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs).</a> FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+HSP47+augments+mouse+embryonic+stem+cell+smooth+muscle+differentiation+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis.</a> PLoS One. 9 (1), e86118(2014).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+CD34%2B+progenitor+cells+by+combined+modulation+of+the+MEK%2FERK+and+BMP4+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways.</a> Blood. 116, 5762-5772 (2010).</li>
<li>Samuel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functionally+competent+and+durable+engineered+blood+vessels+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).</li>
<li>Margariti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+fibroblasts+into+endothelial+cells+capacble+of+angiogenesis+and+reendothelialization+in+tissue-engineered+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).</li>
<li>Karamariti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cells+differentiated+from+reprogrammed+embryonic+lung+fibroblasts+through+DKK3+signaling+are+potent+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts.</a> Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).</li>
<li>Udelsman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+operator-independent+method+for+seeding+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).</li>
<li>Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin-based+vascular+tissue+engineering+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs.</a> Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+control+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+plasticity+through+tumor+necrosis+factor-%CE%B1-mediated+nuclear+factor-%CE%BAB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirolimus+stimulates+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+migration+and+differentiation+into+smooth+muscle+cells+via+epidermal+growth+factor+receptor%2Fextracellular+signal-regulated+kinase%2F%CE%B2-catenin+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+State+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: State of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).</li>
<li>Hung, H. S., Hsu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Advances+of+stem+cell-based+approaches+to+tissue-engineering+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22OA+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts.</a> OA Tissue Engineering. 1 (1), 2(2013).</li>
<li>Quint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+antiplatelet+adhesion+layer+on+an+electrospun+scaffold+using+porcine+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells.</a> J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).</li>
<li>Hibino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+use+of+an+induced+puripotent+stem+cell+sheet+for+the+construction+of+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+to+engineer+small-diameter+vascular+grafts+from+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).</li>
<li>Tsai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+stem+cells+to+neointimal+formation+of+decellularized+vessel+grafts+in+a+novel+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model.</a> Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).</li>
<li>Kasimir, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+decellularization+procedures+of+porcine+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves.</a> Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).</li>
<li>Stephenson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+propagation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+from+frozen+embryos+in+an+animal+product-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment.</a> Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).</li>
<li>McCall, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction+and+intramyocardial+injection+models+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine.</a> Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).</li>
<li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+an+allogeneic+vein+bioengineered+with+autologous+stem+cells%3A+a+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study.</a> Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).</li>
</ol>

אי לנו אינטרסים כלכליים סותרים.

הפרוטוקול הנוכחי מצביע על צליל אסטרטגיה, מהירה, פשוטה, יעילה ושחזור שבו יכולים להיות שנוצרו כלי רקמה מהונדסות תפקודיים באמצעות PiPSC מfibroblasts האנושי. טכניקה זו מהווה כלי רב ערך לרפואת רגנרטיבית, הנדסת רקמות וטיפול בתאים שעלולים להיות מטופל ספציפי בעתיד הקרוב. שלבים קריטיים כדי להבטיח את היעילות של הפרוטוקול כוללים הכנת PiPSC, הכנת שתלי אב העורקים סטרילי וdecellularized באופן מלא, זריעה מוצלחת ובידול של PiPSC בפיגומים ועקרות שמירה של שתלי אב העורקים בbioreactor כלי הדם. <p ...

הבנייה של צינורות כלי דם היא אסטרטגיה בסיסית לתיקון כירורגי של כלי נפגעו ונפצעו כתוצאה ממחל לב וכלי דם. עד כה, חומרי שתל המשמשים בניתוחים כוללים ביולוגית פולימרים סינטטיים (polytetrafluoroethylene [טפלון], polytetrafluoroethylene המורחב [ePTFE; גור-Tex] או terephthalate פוליאתילן [דקרון]), allografts, רקמת אוטולוגי (קרום הלב או וריד saphenous) וxenografts 1. בעוד שתלי מלאכותיים (למשל, גורטקס ודקרון) הם נפוצים ביותר, חומרים אלה עלולים לגרום לסיבוכים לטווח קצר וארוך רבים הכוללים היצרות, בתצהיר סידן, thrombo-אמבוליזציה וזיהומים. למרות שמטופלים עם שתלים ביולוגיים נוכחי עם ירידה באירועי thrombo-תסחיפים, הם עדיין נתקלים במגבלות כגון אי ספיקה משנית שתל ועמידות מקוצרת בשל הסתיידות השפלה 2. לכן, למרות שיפור המשמעותי בt כירורגיתechniques במשך השנים, החוקרים וקלינאים עדיין עמוס עם הצורך בזיהוי הצינור האידיאלי למחלות לב וכלי דם. לאחרונה, תחום המחקר של הנדסת רקמות כלי דם יצר מושג שבו תאים משולבים פיגומים מתכלים, במטרה ליצור סביבת biomimetic שמגלמת כלי פונקציונלי להשתלה מוצלחת 1. ביסודו, הצלחתו של בונה כלי הדם תלויה בשלושה מרכיבים חיוניים; תאים המרכיבים את הפיגום, כלומר, שכבה פנימית של תאי האנדותל ושכבת תאי שריר חלק, פיגום המכיל המטריצה ​​תאית המתאימה כדי לספק תכונות מכאניות דומות לכלי הדם המקומיים, ואיתות המולקולרית / סלולרית שנדרש לייזום / ויסות תיקון. patency שתל לטווח ארוך ופיתוח מתמשך של הניאו-רקמות תלויים מאוד בזריעת תאים יעילה של פיגומים, הereby טיוח ההחלטה של ​​סוג תא חשיבות קריטית. מספר דיווחים להדגים את השימוש באנדותל הבוגר ותאי שריר חלק ממקורות שונים לפתח צינורות בקוטר קטן 3-6. למרות מבטיח, חוסר כלי אוטולוגי מספיק כדי להשיג אנדותל הבוגר ותאי שריר חלק יישארו נטל ניכר. לאחרונה, תאי גזע ממקורות שונים שנוצלו עבור יישומי הנדסת רקמות וכלי דם. תאים אכן, תאי גזע pluripotent מגוון של סוגי תאי גזע כוללים תאי גזע עובריים 7, מושרה (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, נגזר מח עצם mononuclear 12, בתאי גזע mesenchymal 13, ותאי האנדותל וקיר כלי למבוגרים -derived תאי גזע אנטיגן-1 (SCA-1) + תאי גזע / אב 14,15 כולם הודגמו להיות מסוגל בידול לתאי האנדותל או פונקציונלי או שריר חלק בתגובה לתקשורת מוגדרת ותנאי תרבות. יתר על כן, יכולת התחדשות עצמית בלתי מוגבלת של תאי הגזע להפוך אותם מועמדים טובים יותר בניגוד לאנדותל הבוגר ותאי שריר חלק שיכול רק לחלק למספר מוגבל של פעמים לפני שעברו למעצר צמיחה והזדקנות. הבחירה של חומר פיגום כדי ליצור כלי רקמות מהונדס מוצלחות להשתלה תלויה במספר גורמים כגון biocompatibility, תכונות ביו-מכאניות, ושיעור ההתכלות. ביסודו, חומרים המשמשים ליצור פיגומים לשתלים צריכים להיות מתכלה ולא הר תגובות חיסוני נמען מיותר. בנוסף, הוא חייב להקיף נקבוביות מתאים ומייקרו עבור קובץ מצורף תא והישרדות שלאחר מכן. עד כה, החומרים הנפוצים ביותר בשימוש לפיגומים בהנדסת רקמות וכלי דם כוללים פולימרים של חומצות polyglycolic, חומצת polylactic, וε-caprolactone פולי 16. לאחרונה, יש לי חומרים ביולוגיים decellularizedגם יושם בהצלחה מסוימת. מספר מעבדות הראו כי זריעה אנושית decellularized, כלבים או כלי החזיריים עם תאי אוטולוגי סיפקה שתל ביולוגי שהתנגד קרישה והיפרפלזיה intimal 17-19. אסטרטגיות אחרות בהנדסת רקמות וכלי דם כוללות שתלים תאיים כלי דם המבוססים על חלבוני מטריצה ​​למשל, זריעת תאים בג&#39;ל הפיברין 13 וגיליונות תא יצירה ללא תמיכת פיגום 20, 21. הפרוטוקול הנוכחי מדגים את הבידול של PiPSC האנושי לאנדותל הפונקציונלי ותאי שריר חלק, הדור של bioreactor המורכב מפיגום כלי decellularized נמל תאי כלי דם נגזר PiPSC פונקציונליים, והשתלה של כלי הרקמה מהונדסות לכשל חיסוני משולב חמור (SCID עכברים). PiPSC הוא סוג תא אופטימלי לשימוש עבור הנדסת רקמות של שתלי כלי משום שתאים אלה לא יוצרים גידולים בעכברים או להעלות אתי ותגובות allo-חיסונית. יתר על כן, יש לנו הראינו כי האסטרטגיה ליצירת פיפס-אנדותל תאים ופיפס חלק תאי שריר היא יעילה והשחזור 10,11. לאחר מכן, מתכננים כלי decellularized לזריעה של תאי כלי דם נגזר PiPSC לחקות באופן הדוק חלבוני מטריצה ​​שקיים בתוך כלי ילידים, וכך לשפר את יעילות השתלה והישרדות. יתר על כן, decellularization של כלי לפני זריעת PiPSC מונע ההתרחשות של תגובות דלקתיות רכובים על ידי סוגי תאים חיסוניים כגון מקרופאגים. יותר מכך, פרוטוקול זה לא רק מייצג מתודולוגיה כדי ליצור מבטיח צינורות כלי דם לתרגום לבני אדם, אלא גם מספק אמצעי רב ערך של לימוד והבנת המנגנונים המולקולריים השולטים בהתחדשות רקמת כלי דם באמצעות מודלים עכבר.

<table><tbody><tr><td>פיברובלסטים אנושיים CCL-153</td><td>ATCC</td><td>CCL-153</td><td>פיברובלסטים עובריים אנושיים טרום לידתיים</td></tr><tr><td>ATCC F-12K מדיום (שינוי קייגן של מדיום F-12 של האם)</td> <td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>נוקאאוט מדיום DMEM המותאם לתאי גזע עובריים</td><td>טכנולוגיות חיים (Gibco)</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים להחלפת סרום נוקאאוט</td><td>(Invitrogen)</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Human Basic FGF-2&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-837</td><td></td></tr><tr><td>אלפא-MEM טכנולוגיות חיים בינוניות</td><td>(Invitrogen)</td><td>32571093</td><td></td></tr><tr>מו"פ<td>PDGF אנושי</td><td> D System</td><td>120-HD-001</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת ג'לטין 2%</td> <td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)</td> <td>Addgene</td><td>20866</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; אנזים הגבלת PvuI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>RO150S</td><td></td></tr><tr><td>SureClean Plus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>ערכת Nucelofection (ערכת NHDF)</td> <td>LONZA</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>SIGMA</td><td>G418</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD, תאורה למיקרוסקופיה סטריאו</td><td>SCHOTT</td><td>KL 1500 LCD</td><td>תאורת אור קר למיקרוסקופיה</td></tr> <tr><td>סטריאוניקון זום סטרומיקרוסקופ SMZ800</td><td>ניקון</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>הפרין נתרן מלח</td><td>סיגמא</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS תמיסת מלאי ריאגנט ביולוגיה מולקולרית</td><td>Severn Biotech</td><td>CAS 151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>פוספט של Dulbecco בופר מלח</td><td>סיגמא</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>מטריג'ל (10 מ"ג/מ"ל)</td><td>BD</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>שייקר IKA Vibrax עם פלטפורמת טלטול VX 7&nbsp;</td><td>ג'פסון בולטון, ג'אנקה & Kunkel</td><td>S32-102</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S כונן משאבה דיגיטלי</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 6 ערוצים, ראש משאבת מחסנית 6 רולר</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-15</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S מחסניות גדולות לראש משאבה</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-75</td><td></td></tr><tr><td>צינורות משאבת סיליקון מרפאים פלטינה Masterflex, L/S 14, 25 רגל</td><td>Cole-Parmer&nbsp;</td>צינורות <td>WZ-96410-14</td><td>עוברים דרך המשאבה הפריסטלטית</td></tr><tr><td>0.5 מ"מ ID, צינורות סיליקון OD 0.8 מ"מ</td><td>SILEX</td><td>N/</td><td>A צינורות מחברים תא דגירה, מאגר מדיה ותא תאימות&nbsp;</td></tr><tr><td>מפחית התאמה 0.5 עד 1.6, מתאם פוליפרופילין טבעי</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td>מתחבר מעל שני סוגים של</td></tr><tr><td>צינורות צינורות 1/32 אינץ', מזהה 0.01 אינץ' (250&micro; מ) חומר: צינורות PEEK</td><td>LabSmith</td><td>T-132-010P</td><td>דרך קיר תא הדגירה המחבר את השתל עם צינורות חיצוניים</td></tr><tr><td>אביזרי מקשה אחת&nbsp;</td><td>LabSmith</td><td>T-132-100</td><td>תקן את הצינורות הנ"ל דרך דופן תא הדגירה</td></tr><tr><td>צינורות ניילון (OD 0.9 מ"מ, מזהה 0.75 מ"מ)&nbsp;</td>צינורות <td>Smiths Medical</td><td>N/A</td><td>מוכנסים לשני קצוות של שתל אבי העורקים</td></tr><tr><td>NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl עכבר</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תפרים כירורגיים, 8-0&nbsp; משי</td><td>ETHICON</td><td>W819</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>Vetapharm</td><td>Vm21757/4000</td><td>Neuroleptanalgesic לשימוש בעכברים</td></tr><tr><td>Hypnovel (Midazolam)</td><td>Roche</td><td>59467-70-8</td><td>אינדוקציה של</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח</td> הרדמה <td>קארל זייס</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>צינורות ניילון</td><td>Portex LTD</td><td>800/200/100/200</td><td>קוטר 0.65 מ"מ ואורך 1 מ"מ; להכנת שרוול עורקים</td></tr><tr><td>Electrocoagulator</td><td>Martin&nbsp;</td><td>SN 54.131</td><td>קשירת ענפי העורקים על אבי העורקים</td></tr><tr><td>מלקחיים מיקרו המוסטט דו קוטבי</td><td>מרטין</td><td>80-91-12-04</td><td>קיבוע קצוות כלי</td></tr> דם <tr><td>מרחיב כלי</td><td>S& T</td><td>JFX-7</td><td></td></tr><tr><td>מרחיב כלי</td><td>S& T</td><td>JFL-3dZ</td><td></td></tr><tr><td>מרחיב כלי</td><td>S& T</td><td>D-5aZ</td><td></td></tr><tr><td>מיני אפליקציה&nbsp;</td><td>AESCULAP</td><td>FE572K</td><td></td></tr><tr><td>מהדקי המוסטטים מיקרו</td> תפרים כירורגיים <td>AESCULAP</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>, 6-0 VICRYL</td><td>ETHICON</td><td>V489</td><td></td></tr></tbody></table>

דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

בניית צינורות כלי דם היא אסטרטגיה בסיסית לתיקון כירורגי של כלי דם פגומים ופגועים כתוצאה ממחלות לב וכלי דם. הפרוטוקול הנוכחי מציג אסטרטגיה יעילה וניתנת לשחזור שבה ניתן ליצור שתלי כלי דם מהונדסים רקמות פונקציונליות באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים חלקית (PiPSC) מפיברובלסטים אנושיים. עיצבנו ביו-ריאקטור פיגום כלי דם נטול תאים, המחקה מקרוב את מבנה חלבון המטריצה וזרימת הדם הקיימת בתוך כלי טבעי, לזריעה של תאי אנדותל PiPSC או תאי שריר חלק לפני השתלה בעכברים. גישה זו הוכחה כמועילה מכיוון שעכברים חסרי חיסון שהושתלו בשתלים שמקורם ב-PiPSC הציגו שיעור הישרדות מוגבר באופן ניכר 3 שבועות לאחר הניתוח. פרוטוקול זה מייצג כלי רב ערך לרפואה רגנרטיבית, הנדסת רקמות וטיפול תאי ספציפי למטופל בעתיד הקרוב.

הדור המוצלח של PiPSC אושר 4 ימים לאחר nucleofecting fibroblasts אדם עם פלסמיד pCAG2LMKOSimO ינארית ביצוע 4 גורמי שעתוק, Oct4, Sox2, KLF4 וc-MYC (OSKM). PiPSC מוצג פנוטיפ ניכר מובהק בהשוואה לfibroblasts (איור 2 א) והביע גורמי תכנות מחדש 4 בmRNA (איור 2) וחלבון רמות (איור 2 ג) 10. היעילות של שתל כלי דם המבוסס על PiPSC תלויה מאוד ביכולת של PiPSC להתמיין לשתי שושלות שריר אנדותל וחלקות. לכן זה קריטי כדי לאשר מאפיינים אלה של ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר שתלי כלי רקמה מהונדסת, כי הם פונקציונליים להשתלה לעכברים על ידי זריעה כפולה תאי גזע pluripotent מושרה באופן חלקי (PiPSC) - נגזר תאי שריר חלק וPiPSC - תאי האנדותל נגזרו על bioreactor פיגום כלי decellularized.

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק שתלי כלי דם בהנדסת רקמות הפונקציונליים להשתלה בעכברים. דבר זה מושג תחילה על ידי תכנות מחדש של פיברובלסטים אנושיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושראים חלקית in vitro, המסוגלים להבדיל עצמם לתאי אנדותל ולתאי שריר חלק. לאחר מכן, מוצאים אאורטה מעכבר שהוקרב ומבצעים דסלולריזציה באמצעות תמיסת sodium dodecyl sulfate או SDS כדי להכין את שתלי האאורטה שעברו דסלולריזציה.בשלב הבא, מעגל הזרימה של הביוראקטור מוגדר לצורך זריעה כפולה של תאי גזע פלוריפוטנטיים שהושרjeron חלקית. השלב האחרון הוא השתלה של השתל תאי הגזע הפלוריפוטנטיים שהושרגרו חלקית ושנזרעו באופן כפול לתוך עכברים. לבסוף, ניתוח שיעורי התמותה של העכברים שלושה שבועות לאחר ההשתלה משמש להדגמת התפקוד של השתלי כלי הדם בהנדסת רקמות.להשלכות של טכניקה זו יש השפעה על הטיפול במחלות קרדיווסקולריות, מכיוון שהוכח כי היא מייצרת בהצלחה כלי דם תפקודיים באמצעות תאי PIPS בפרק זמן קצר. באופן כללי, חשוב מאוד לשמור על השתלה של כלי הדם שלמה וסטרילית לאורך כל הפרוצדורה, במיוחד עבור אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו. התחילו את הפרוצדורה בתכנות מחדש של פיברובלסטים אנושיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים חלקית, או תאי PIPS, על ידי טרנספקציה של התאים עם 4 µg של פלסמיד OSKM ליניארי באמצעות ערכה להחדרה גרעינית לפיברובלסטים של עור אנושי.פיברובלסטים אנושיים הופכים לתאי PIPS לאחר ארבעה ימים של תכנות מחדש. לאחר הקרבת העכבר באמצעות דיסלוקציה צווארית, הנח את העכבר במנח גב תחת מיקרוסקופ דיסקציה.לאחר מכן, חתכו דרך עצם החזה ומסביב לכלוב הצלעות כדי לפתוח את חלל בית החזה. הסירו את הלב, הריאות והוושט כדי לחשוף את האביס (aorta), ולאחר מכן הסירו בעדינות את השומן המקיף את האביס באמצעות פינצטה. חתכו את האביס מקצהו הקדמי בעזרת מספריים והחזיקו בעדינות את הקצה באמצעות פינצטה קהה.לאחר מכן, נתק את האורטה מעמוד השדרה מאחור באמצעות דיסקציה קהה. סגור בזהירות את כל העורקים המתפצלים מהאורטה על ידי ליגציה באמצעות קואגולטור חשמלי דו-קוטבי וחיתוך מקצה הליגציה באמצעות מספריים. השתמש במזרק של 5 ml כדי לשטוף את חלל האורטה עם 3 ml של תמיסת סליין המכילה 100 units של heparin.כדי למנוע היווצרות של קרישי דם, חתוך את הקצה האחורי של האורטה לפני פיצולה לעורקים הכליתיים. שמירה על שלמות האורטה חשובה מאוד לאורך כל הפרוצדורה. לאחר מכן, שטוף את חלל האורטה עם חמישה מיליליטר של 0.075.השרו את האורטה של החולדה בתמיסת Sodium dodecyl sulfate או SDS בריכוז 0.075%, המדוללת בבופר פוספט סליין או PBS, בתוך צלחת פטרית בקוטר 10 סנטימטרים על שייקר אורביטלי למשך שעתיים במהירות של 150 RPM בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את לומן האורטה באמצעות 5 מיליליטר של PBS. לאחר מכן, השרו את האורטה ב-PBS בצלחת פטרית בקוטר 10 סנטימטרים והניחו את הצלחת על השייקר האורביטלי במהירות של 150 RPM למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.יש להחליף את ה-PBS בכל 20 דקות לאחר שעתיים. שטפו את לומן האורטה בעזרת חמישה מיליליטר של PBS. כדי להתחיל, הרכיבו את מעגל הזרימה של הביוראקטור כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.בשלב הבא, התנה את כלי הדם לאחר הסרת התאים באמצעות מדיום תרבית, על ידי השריה של האורטה במדיום דיפרנציאציה בצלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטר על שייקר אורביטלי למשך שעה אחת ב-50 RPM בטמפרטורת החדר. הכנס צינורות ניילון באורך של סנטימטר אחד לשני קצוות של כלי הדם לאחר הסרת התאים תחת המיקרוסקופ. לאחר מכן, קשור את כלי הדם ואת הצינורות באמצעות תפרי משי במידה 8/0.הרכיבו את השתל של האורטה שעברה דקלול בתא הדגירה על ידי חיבור צינורות הניילון עם פתחי הכניסה והיציאה מדופן התא. שמרו על נפח של חמישה מיליליטר medium בתא הדגירה בכל פעם. לאחר מכן, בצעו עיכול של תאי ה-PIPS באמצעות הוספת trypsin שחומם מראש.סגרו את צלחת התרבית ונערו את הצלחת בעדינות 10 פעמים. השליכו את הפ pipette tips והשאירו את הצלחת באינקובטור למשך שתי עד שלוש דקות. לאחר מכן, הוסיפו למשקית מצע גידול שחומם מראש וערבבו את המצע עם התאים.לאחר מכן, ספרו את מספר התאים באמצעות המוציטומטר צנטריפוגה. שתי מנות של תרחיפי תאים המכילות חצי מיליון תאים כל אחת למשך חמש דקות ב-300 ×g. לאחר הסבב, השעיכו מחדש לחלוטין משקע אחד של משקעי תאי ה-PIPS. ב-50 µL של dm, הזרקו את תרחיף התאים לתוך חלל כלי הדם שסוכו תאיו.לאחר מכן, השעה את משקע תאי ה-PIPS השני ב-100 microliters של matrigel. טפטף בזהירות את התערובת על הש przeszב האורטה שסורר ממנו התאים. המתן 10 עד 15 דקות עד שהתערובת תהפוך למצב ג'ל ותעטוף באופן אחיד את פני השטח החיצוניים של כלי הדם.בנקודה זו, בנו את תא הדגירה באמצעות dm. מקמו את מערך הביוריאקטור כולו בתוך אינקובטור עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. לאחר מכן, הצמידו את הפיתול המקשר בין מאגר המצע לתא הגמישות (compliance chamber) למשאבה הפריסטלטית.בתוך האינקובטור. סובב ידנית את השתל שעבר דה-צלולריזציה ב-90 מעלות סביב הציר האורכי בכל חצי שעה בשתי השעות הראשונות, לאחר השארת התרבית במצב סטטי למשך 12 שעות, כדי לאפשר למשאבה הפריסטלטית להזרים DM דרך הלומן להשראת דיפרנציאציה של תאי שריר חלק. התחל את קצב הזרימה הראשוני בחמישה milliliters per minute.לאחר שמירת קצב זרימה של מצע מחזור של 20 milliliters per minute למשך 24 שעות, החילו עלייה מדורגת של 20 milliliters per minute בכל פעם לאורך 24 שעות, הפסיקו את זרימת המצע והוציאו את הביוראקטור מהאינקובטור. לאחר מכן, זרקו ללומן של השתל PIPS cells לאחר ספירה בטריפסין וסנטריפוגה של 1 million PIPS cells. כבעבר, השעיקו מחדש את התאים ב-50 microliters של מצע גידול אנדותליאלי.שניים המכילים 50 nanograms per milliliter של vascular endothelial growth factor. לאחר מכן, מזריקים את תערובת התאים ללומן של השתל. מחליפים את המצע בתא הדגירה ובכל מערכת הסירקולציה ל-e GM שתיים המכילה VEGF כדי להשרות דיפרנציאציה אנדותליאלית.לאחר החזרת מערך הביוראקטור לדגירה, סובב את השתל ידנית ב-90 מעלות מדי חצי שעה במהלך השעתיים הראשונות, ולאחר מכן שמור על תרבית סטטית למשך 12 שעות. לאחר 12 שעות, התחל זרימה מחזורית מקצב של 5 mL/min עם עלייה מדורגת עד ל-35 mL/min, ולאחר מכן שמור על קצב זרימה של 35 mL/min למשך חמישה ימים. לאחר מכן, הוצא את השתל המהונדס על ידי חיתוך קצוות צינורות הניילון.הניחו את השתל על פטריה המכילה מצע e GM two טרי, כהכנה להשתלה בעכבר לאחר הרדמתו של העכבר המקבל. קבעו את העכבר במצב שכיבה על הגב (supine), כאשר צווארו מגולחת ומתוחה. בצעו חתך בקו האמצע מהלסת התחתונה ועד לעצם השטרנום של העכבר תחת מיקרוסקופ דיסקציה עם הגדלה של פי 5 עד 10.הרם את בלוטות הרוק הימניות לצד וסלק את שריר המסטואיד הימני. כדי לחשוף את העורק התהAvi common carotid הימני, הסר בעדינות רקמות צמודות כדי לנקב את העורק התהAvi common carotid הימני מהקצה הדיסטלי לכיוון הקצה הפרוקסימלי. קשור את החלק המרכזי של העורק התהAvi common carotid פעמיים באמצעות תפר משי 8/0 ובצע דיסקציה בין שני הקשירות. העבר שרוול העשוי מצינור ניילון ניתן לאוטוקלאב לתוך כל כלי דם.סגור וקבע כל קצה באמצעות תסמיכי המוסטט מיקרוסקופיים. לאחר מכן, הסר את קשרי התפירה מקצה אחד והחל מיד טיפה של heparin. הפוך את הקצה הדיסטלי של העורק כדי לכסות את כל גוף השרוול (cuff) וקבע את כלי הדם ההפוך לשרוול באמצעות תפר משי בגודל 8/0.לאחר חזרה על אותו הליך בחלק השני של העורק, שטפו את העורק בתמיסת סלין כדי להסיר קרישי דם. לאחר מכן, השתילו שתל כלי דם דקלולרי (decellularized) בין שני קצותיו של העורק הקרוטידי על ידי החלקת קצוות הכלי הדקלולרי מעל חפת העורק וקיבועו באמצעות תפרי משי בגודל 8-0. הסירו את התפסנים הכירורגיים משני הקצוות לפני הערכת הדופק של השתל, ולאחר מכן החזירו את בלוטת הרוק הימנית למקומה המקורי.סגרו את העור באתר הניתוח באמצעות תפרים נפרדים תוך שימוש בחוט תפירה פרולקטין במידה 6/0. המשיכו בטיפול לאחר הניתוח כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המייצג. כאן מוצגה המורפולוגיה של פיברובלסטים אנושיים לאחר ארבעה ימים של תכנות מחדש לתאי PIPS.תאי PIPS הציגו פנוטיפ מובחן באופן ניכר בהשוואה לפיברובלסטים. כפי שצפוי, הושגה דה-צלולריזציה מלאה של האורטה על ידי טיפול ב-SDS למשך שעתיים. כתוצאה מכך, האורטה לאחר דה-צלולריזציה נראתה כפיגום אצלולרי שקוף בהשוואה לאורטה שהוצאה מהגוף טרם הטיפול.בעקבות זריעה כפולה של תאי PIPS בתוך אאורטה שעברה דה-צלולריזציה, השתלים הווסקולריים ההנדסיים מציגים תכונות של תאי אנדותל ותאי שריר חלק, השונות מאלו של השתלי כלי דם שעברו דה-צלולריזציה בלבד. הדבר מודגם כאן באמצעות צביעה בירוק עבור תאי אנדותל וצביעה באדום עבור תאי שריר חלק. עכברים שקיבלו השתלי כלי דם עם תאי PIPS הראו שיעור הישרדות של 60% שלושה שבועות לאחר הש transplantation, כפי שצפוי היה.בעכברים שהושתלו כלי דם דסלולריים נצפתה שיעורי תמותה גבוהים באופן משמעותי כבר ביום הראשון לאחר הפיתוח. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הקרדיולוגיה לבחון את השימוש בתאי PIPS ובשתלי כלי דם דסלולריים ליצירת צינורים כלי דם תפקודים בהנדסת רקמות. לאחר צפייה בסרטון זה, אני מקווה שתוכלו להשיג הבנה טובה לגבי אופן הכנת השתל של כלי הדם הדסלולריים, אופן הרכבת הביוריאקטור ואופן השталתו מחדש של השתל המעובד בעכברים.

generation-and-grafting-of-tissue-engineered-vessels-in-a-mouse-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים טכניקה שבה קטע של אב העורקים בבטן מעכבר הושתל orthotopically ממש מתחת לעורקי הכליה בנמען אלוגנאית או syngeneic. טכניקה זו יכולה להיות שימושית במחקרים בם השתלה של עורקים גדולים של גודל אחיד נחשבת יתרון.

השתלת אב עורקים בעכברי orthotopic לחקר מחלת כלי דם

אנו מתארים פרוטוקולים לarteriosclerois שוחדנו העכבר (GA) דגמים אשר כרוך חציצה של מגזר כלי עכבר לנמען של אותו הזן המולד. על ידי backcrossing שינויים גנטיים נוספים לתורם הכלי, המודל יכול להעריך את ההשפעה של גנים ספציפיים על GA.

מודלים עכבר לטרשת עורקים שתל

מודל השתלת לב בצוואר הרחם העכברי הוא גם מתאים חיסוני, כמו גם מחקרי פציעת reperfusion איסכמיה. שינינו את התהליך תוך שימוש בטכניקת שרוול שאינו תפר וביצעו יותר מ 1,000 השתלות מוצלחות עם גישה זו.  במסמך זה, אנו מספקים פרטים נוספים בטכניקה זו כדי להשלים את הווידאו.

עכברי צוואר הרחם לב השתלת דגם שימוש בטכניקת חפתים השתנה

כדי לשפר את הידע של היווצרות neotissue תאית ומולקולרית שלנו, מודל עכברי של TEVG פותח לאחרונה. השתלים הושתלו שתלי כחציצת וריד נבוב infrarenal בעכברי C57BL / 6. מודל זה משיג תוצאות דומות לאלה שהושגו בחקירה הקלינית שלנו, אבל לאורך זמן כמובן הרבה מקוצר.

השתלה של וריד נבוב חציצת שתל נחותה בעכבר דגם

כדי לחקור השתלה משולבת של איברים מוצקים וכלי דם, אנו מתארים מודל חדש של השתלת דופן חזה הטרוטופית, בלוטת התימוס ולב בעכברים באמצעות טכניקת שרוול צוואר הרחם ללא תפרים.

Microsurgical דגם חדשני לHeterotopic, כמקשה אחת בחזה קיר, קורנית, ולב השתלה בעכברים

אנו מציגים מודל השתלת אבי העורקים orthotopic בטכניקה שרוול בעכברים. זו שיטה השקה מהירה מאוד, אשר יכול להיות מועסק במחקרים של מחלת כלי דם.

בטכניקה שרוול במודל של עכברים של אבי העורקים השתלת - סרט הדרכה

היצרות השתל מהווה מכשול קריטי החלפת רקמות מהונדסים דרכי הנשימה. כדי לחקור את המנגנונים התאיים המשמשים כבסיס היצרות, אנו מנצלים את מודל מאתר של החלפת רקמות מהונדסים והכו אותי עם תאי תאי מח עצם הזריעה (מוניטור-MNC). כאן, אנו מפרטים פרוטוקול שלנו, כולל ייצור לגרדום, מוניטור-MNC בידוד, שתל זריעה השרשה.

Seeding, השרשת biosynthetic הוחלף נגזר רקמות מהונדסים בקנה הנשימה השתלה במודל של עכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של הטרוסקסואלים השתלת אבי העורקים בעכברים באמצעות שימוש בטכניקת השרוול שאינו תפר במודל מורטין הצווארי. מודל זה יכול לשמש כדי ללמוד את הפתולוגיה הבסיסית של השתלת האלופתיה כרונית (קו) והוא יכול לעזור להעריך סוכנים רפואיים חדשים כדי למנוע את הקמתה.

מורי צוואר הרחם מורנה השתלת מודל באמצעות שינוי שאינו תפר שיטה השרוול

מודלים להשתלת לב עכברים מייצגים כלי מחקר חשובים לחקר אימונולוגיה של השתלות. הפרוטוקול הנוכחי מפרט השתלת לב צווארית הטרוטופית של עכברים הכוללת מיקום של אזיקים על עורק הצוואר המשותף של המושתל ועל גזע עורק הריאה של התורם כדי לאפשר זרימת דם למינרית.

השתלת לב צוואר הרחם הטרוטופית בעכבר תוך שימוש באזיקי כלי דם

כאן, מוצג פרוטוקול להשתלת שתל כלי דם מהונדס רקמות בעורק הצוואר של העכבר בטכניקת השרוול, המספק מודל בעל חיים מתאים לחקירת מנגנוני התחדשות רקמות כלי הדם.

השתלת שתל כלי דם מהונדס רקמות בעורק הצוואר של העכבר בטכניקת שרוול

מחקר זה מציג מודל חזירי להערכת שתלים בקוטר קטן בעורקי הירך. המודל מחקה את הדינמיקה של כלי הדם האנושיים ומעריך באופן מקיף את סבלנות השתל, המודינמיקה ושיפוץ כלי הדם. הוא מציע פלטפורמה רבת ערך לבדיקת שתלי כלי דם ולניטור שלהם באמצעות אולטרסאונד דופלר ואנגיוגרפיה.

השתלת שתל כלי דם בעצם הירך במודל חזירים לבדיקת שתלי כלי דם בקוטר קטן

למד לייצר שתלים וסקולריים פונקציונליים מPiPSCs וסקפולדים מופרדים תאית בעכבר. הפרוטוקול כולל זריעה כפולה בביוריאקטור והשתלה לבחינת שרידות ואינטגרציה רקמתית.

דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

גלה סרטונים נוספים