Name: זהב nanorod בסיוע גירוי אופטי של תאים עצביים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: חקור גירוי תאים עצביים באמצעות nanorods זהב ולייזר תת-אדום קרוב. שיטה זו מאפשרת חקר דינמיקת סידן תוך-תאית והשפעה על התמיינות נוירונלית ליישומים בנוירו-פרוסתטיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות NanoVentures אוסטרליה לתמיכה במימון הנסיעות ופרופ &#39;ג&#39;ון כובע על שארח באופן חלקי מחקר זה באוניברסיטת שפילד והגב&#39; Jaimee Mayne על עזרתה בזמן הצילומים.

1. Au NRS הכנה הערה: יכול להיות מסונתז Au NRS על ידי מספר המתכונים 16, או שנרכש מיצרנים מסחריים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הצפיפות הראשונית האופטית (OD) של פתרון Au NR באמצעות ספקטרוסקופיה UV-Vis, על ידי הקלטת ערכי הקליטה מ -300 ננומטר עד 1,000 ננומטר עם רזולוציה של 0.5-2 ננומטר. משתנה הנפח של הפתרון לשימוש עם קובט הזמינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הריכוז הראשוני NP טוחנת עם הטכניקה מתאימה 17 (ספקטרוסקופיה למשל UV-Vis, ספקטרומטריית מסת פלזמה בשילוב אינדוקטיבי חלקיק יחיד, מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים) או להשתמש בערכי הריכוז הניתנים על ידי הספק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 5 מיליליטר ידי דילול מדגם Au NR הראשוני להגיע OD = 1. לדירות הטובות ביותר, לשמור קבוע OD לכל הדגימות שנבדקו. עקוב הפרוטוקול של הספק המסחרי להרכב הממס המדלל. אם אינך בטוח, להשתמש במים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 1 מיליליטר של פתרון Au NR פעמיים במשך 15 דקות ב7,800 XG כדי להסיר כל עודף כימי מהפתרון. מחזורי צנטריפוגה יכולים להשתנות בכוח והזמן (למשל g × 20 דקות ב 5,600) 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatants מחדש להשעות NRS במים ללא יונים. כחלקיקים מחדש מושעה עלולים ליצור אגרגטים בפתרון, להכין אותם מדי יום כדי לקבל את התוצאות הטובות ביותר. לחלופין, חנות במקרר לא יותר משבוע 1. לא להקפיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש בתנאי תרבית תאים, sonicate פתרון Au NR למשך 5 דקות ולאחר מכן לחטא עם אור UV למשך 30 דקות (עוצמת קרינת UV לא פחות מ -400 mW ∙ m -2 ב 254 ננומטר). </li></ol> תרבות קו 2. NG108-15 תאים עצביים ובידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדיום תרבית תאים, להכין 500 מיליליטר של המדיום של Dulbecco סטרילי שונה נשר (DMEM) המכיל 10% (w / v) בסרום עגל עוברי (FCS), 1% (w / v) L- גלוטמין, 1%(W / v) (w / v) ב amphotericin פניצילין / סטרפטומיצין ו -0.5% יכולים להיות aliquoted תוספי, מאוחסנים ב -20 ° C והוסיפו לתקשורת ביום נדרש: הערה. מדיום תרבות תא יכול להיות בקירור במצב סטרילי לתקופה מקסימלית של 1 חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבינוני התמיינות תאים, להכין 50 מיליליטר של DMEM סטרילי המכיל 1% (w / v) L- גלוטמין, 1% (w / v) (w / v) ב amphotericin פניצילין / סטרפטומיצין ו -0.5% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול NG108-15 תאים עצביים ב 10 מיליליטר של מדיום תרבית תאים בצלוחיות T75 עשויים קלקר באינקובטור עם אווירת humidified (5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס). בדרך כלל, זרע 1.5-2 × 10 5 תאים בבקבוק אחד כדי להיות מוכן ב3-4 ימים. שנה בינוני תרבית תאים בכל יומיים. הערה: כדי למנוע סחף או וריאציה גנטיים, לא משתמש בתאים מבוגרים יותר ממעבר 21 לניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ומחוברות 70-80% בתרבות, לשנות בינוניות עם בינוני תרבות תא חם וטריה. מכאני לנתק את התאים על ידי בעדינות knocהמלך התחתון של הבקבוק ומחוברות. אל תשתמש בטריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא במשך 5 דקות ב 600 XG מחדש להשעות את התא גלולה ב 2 מיליליטר של מדיום התמיינות תאים חם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 × 10 4 תאים / סנטימטר זרע 2 בצלחת גם קלקר תרבית רקמת 96 עם 200 μl של מדיום התמיינות תאים. דגירה הניסוי ליום 1 בשעה 5% CO 2/37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף בין 3.2 × 10 9 -4.2 × 1 0 10 / חלקיקי מיליליטר של תמיסת Au NR ביום 2 ודגירה אותו למשך 24 שעות נוספות. אל תוסיף את החלקיקים לניסויי שליטה. הערה: כפי ששליטה חלופית, Au צירופים ועם אורך גל קליטת שיא היטב הבדיל יכולים לשמש למטרות השוואה 14. להתנהגות תא עקבית יותר, לשמור על צפיפות תאים קבועים ולא לשנות את פני השטח היטב לפני זריעת תאים. </li></ol> 3. neurite תולדה שיפור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוגהלייזר עם סיב אופטי מצב יחיד (צמצם המספרי = 0.13) ולסיים אותו עם מחבר סיבים (המחברים FC נוחים וזמינים בדרך כלל). מדוד את כוח לייזר פלט עם מד כוח סטנדרטי. כדי להשיג את התוצאות האפקטיביות ביותר, להתאים את אורך הגל לשיא של הלייזר לשיא תהודת plasmon של NRS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3 הדגירה NR הבאה, לתקן את מחבר FC לטוב. מכשיר את דגימות ובקרות בRT דקות 1 בגל רציף, לסמכויות לייזר שונות. לאפשר לתרבות כדי להמשיך במשך 3 ימים נוספים בבית 5% CO 2/37 מעלות צלזיוס. חזור על הקרנת הלייזר למינימום של 3 מדידות עצמאיות. הערה: זמני הקרנה שונים ותדרי דופק ניתן לבחור, בהתאם ליישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין את הלייזר במונחים של קוטר האלומה וirradiance לייזר (W ∙ סנטימטרים -2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיבי מצב יחידים סטנדרטיים, להשתמש = n ∙ θ חטא NA,כאשר n הוא מקדמת השבירה של המדיום בשימוש וθ הוא זווית המחצית מחרוט אור יציאה מהסיבים (ראה איור 1 א). מטריגונומטריה, r = d θ ∙ שיזוף, שבו r הוא רדיוס הקורה וd הוא המרחק בין הסיבים והמדגם. מחבר FC תואם את הקוטר של באר, ולכן מאיר את המדגם במרחק d = 2.70 ± 0.20 מ&quot;מ. אור יוצא הסיבים במים (n = 1.33), נותן r = tan (חטא-1 (NA / n)) ∙ ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות המשוואה האחרונה, לחשב את רדיוס קרן לייזר, קרן האזור המתאים וirradiance הממוצעת הלייזר (כוח הלייזר מחולק באזור קרן) ביעד (ראה גרף הדוגמא באיור 1). ערכים אלה מייצגים irradiance הממוצעת מעל האזור המואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הטעויות למדידות עם התאוריה הכללית של התפשטות שגיאה. הערה: b המרחקetween מחבר FC והמדגם ניתן למדוד בתצלומיו של ההסדר הניסיוני ולאחר העיבוד של התמונה באמצעות תוכנה מתאימה (למשל ImageJ). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 5, להסיר בינוני התמיינות תאים מהניסויים ולתקן את הדגימות עם 3.7% (v / v) פתרון פורמלדהיד במשך 10 דקות, ולאחר מכן permeabilize התאים עם 0.1% (v / v) טריטון X-100 עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA) על הדגימות עבור 60 דקות כדי לחסום את חלבון unreacted אתרי קישור. תווית הדגימות ללילה אנטי-βIII טובולין (5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS בתוספת 1% מBSA) בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים למשך 90 דקות בחושך עם נוגדנים משני מתאימים (אנטי עכבר נוגדני IgG למשל TRITC-מצומדות) באמצעות ריכוז של .4-2 מיקרוגרם / מיליליטר בBSA 1% ב- PBS. תווית גרעין התא עם DAPI (0.1 מיקרוגרם / מיליליטר מים דה מיונן ב) במשך 10 דקות. הערה: נטיית נוגדן ומיג ריכוזht להשתנות בהתאם לפרוטוקול החברה. לשטוף דגימות עם PBS פעמיים במשך 5 דקות לאחר כל שלב צביעה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig1.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות תמונה על ידי epifluorescence או confocal באמצעות לפחות 20 × אובייקטיביים. בחר מיקרוסקופ מסננים בהתאם לנוגדנים משני. בחר מסנן DAPI (λ = 358 nm EX; λ EM = 488 ננומטר) כדי להמחיש את גרעין התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את התמונות על ידי הערכה: i) האורך המרבי neurite (שיא האורך מקצה neurite לתחילת גוף התא), ii) מספר neurites לכל תא עצבי (לסכם את כל neurites לכל תא) וiii) את אחוז התאים עם neurites (לחלק את המספר הכולל של תאים לבטא βIII טובולין במספר הכולל של תאים בעלי גרעין מוכתם חיובי) 19. </li></ol> 4. בלייזר מושרה ההדמיה 2 + תאיים Ca <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20% (w / v) פתרון מניות של pluronic F-127 על ידי המסת 2 גרם של מומס ב 10 מיליליטר של sulfoxide נטול מים דימתיל (DMSO). מחממים את הפתרון של pluronic F-127 ב 40 מעלות צלזיוס במשך כ -20 דקות כדי להגדיל את המסיסות. להכין אותו מראש אם הם נמצאים בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3 הבאים דגירה NR, להכין תמיסת מלח מאוזנת (BSS; 135 מ&quot;מ NaCl, 4.5 מ&quot;מ KCl, 1.5 מ&quot;מ CaCl 2, 0.5 מ&quot;מ MgCl 2, 5.6 גלוקוז מ&quot;מ, ו -10 מ&quot;מ HEPES, pH 7.4) והשלים אותו עם 5 מיקרומטר של Fluo-4 בבוקר ובDMSO 0.1% (w / v) של פתרון pluronic F-127. הערה: פתרון BSS יכול להיות מוכן מראש וקירור לתקופה מקסימלית של 1 חודש. הוסף את התוספים (Fluo-4 בבוקר וpluronic F-127) ביום של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני התמיינות תאים ולהחליף אותו עם פתרון BSS בתוספת. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר עם מיקרוסקופ confocal הפוך, דגירה התאים במייקרו-שקופית היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי עומס NG108-15 עם Fluo-04:00למשך 30 דקות בחושך ב5% CO 2/37 מעלות צלזיוס. בעקבות זמן הדגירה, לשטוף דגימות פעמיים עם BSS כדי להסיר כל fluorophore טעון תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוג הלייזר עם סיב אופטי במצב בודד, ודבק בקצה תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית. שים לב לקצה וכתוצאה מכך תחת מיקרוסקופ אופטי, על מנת להבטיח איכות גבוהה משטח (כלומר הקצה צריך להיות בניצב לציר הסיבים ושטוח על בדיקה מיקרוסקופית). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את כוח לייזר פלט עם מד כוח סטנדרטי. הכנס את סיבי משלוח האור לבעל סיבים אופטיים ולהדביק אותו לmicropositioner. עיין באל בראון ואח. 20 לפרטים נוספים על הכנת סיבים אופטית ומיצוב. זהירות: בצע את הכללים לבטיחות לייזר במהלך המדידה של כוח הלייזר (למשל לא נראים ישירות לתוך קרן לייזר, לחבוש משקפי מגן בטיחות הלייזר במהלך טיפול, מניעת חשיפה לאור תועה למשתמשי מעבדה אחרים) &lt;./ Li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אוסצילוסקופ לליזר הנייד כדי לפקח על האפנון האופטי. השתמש באות בינארי עם תדרים משתנים (0.5-2 הרץ) ואורכי דופק (20-100 אלפיות שני). חבר הלייזר באמצעות אות האפנון כהיגיון טרנזיסטור-טרנזיסטור (TTL) קלט למיקרוסקופ, לאחר ההתקנה מוצגת בet al Paviolo. 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים תחת מיקרוסקופ confocal הפוך ולמקם את סיבי משלוח אור 250 ± 50 מיקרומטר מתא המטרה במצב תאורת שידור. במרחק זה, להשתמש במשוואות שהוצגו ב3.3.1 לחשב את רדיוס הקרן ביעד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בליזר ארגון-יון (488 ננומטר) כדי לעורר את צבע AM Fluo-4 הפנים (λ = 494 nm EX; λ EM = 516 ננומטר) וLD המסונכרן לעירור של NRS endocytosed. לבצע ההדמיה בRT של דגימות ובקרה באמצעות לפחות אובייקטיבי 40 × ידי איסוף סריקות בזמן סדרהעם 256 × 256 פיקסלים / רזולוציה מסגרת במצב הלוך ושוב בתדירות של לפחות 4 הרץ. לבצע הקלטה ללא כל עירור LD לזהות כל הפרעה ארגון יון לייזר (רעש בסיס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרקע מנתונים באמצעות משוקלל adaptively אלגוריתמי הריבועים הפחותים נענשו 21. העלילה Ca 2 + וריאציות המושרית כפונקציה של זמן. לנתח את הפסגות חולפות בעוצמת הקרינה באמצעות תוכנה שלאחר עיבוד תמונה על ידי thresholding ברמה שלוש פעמים סטיית התקן של רעש הבסיס (3σ). </li></ol>

<ol><li>Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stimulation+with+optical+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Laser.+Photonics+Rev%22%5BJournal%5D)">Neural stimulation with optical radiation.</a> Laser. Photonics Rev. 5 (1), 68-80 (2011).</li>
<li>Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+transients+evoked+by+pulsed+infrared+radiation+in+neonatal+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes.</a> J. Physiol. 589 (6), 1295-1306 (2011).</li>
<li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+light+absorption+in+tissue+during+infrared+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 17 (7), 075002-075002 (2012).</li>
<li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+temporal+effects+of+heating+during+infrared+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Modeling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 18 (3), 035004(2013).</li>
<li>Huang, H., Delikanli, S., Zeng, H., Ferkey, D. M., Pralle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+ion+channels+and+neurons+through+magnetic-field+heating+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Remote control of ion channels and neurons through magnetic-field heating of nanoparticles.</a> Nat. Nanotechnol. 5 (8), 602-606 (2010).</li>
<li>Farah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holographically+patterned+activation+using+photo-absorber+induced+neural-thermal+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Eng%22%5BJournal%5D)">Holographically patterned activation using photo-absorber induced neural-thermal stimulation.</a> J. Neural. Eng. 10 (5), (2013).</li>
<li>Ciofani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+neurite+outgrowth+in+neuronal-like+cells+following+boron+nitride+nanotube-mediated+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enhancement of neurite outgrowth in neuronal-like cells following boron nitride nanotube-mediated stimulation.</a> ACS Nano. 4 (10), 6267-6277 (2010).</li>
<li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells+by+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhancement of neurite outgrowth in PC12 cells by iron oxide nanoparticles.</a> Biomaterials. 32 (11), 2871-2877 (2011).</li>
<li>Myroshnychenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+optical+response+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Modelling the optical response of gold nanoparticles.</a> Chem. Soc. Rev. 37 (9), 1792-1805 (2008).</li>
<li>Choi, W. I., Sahu, A., Kim, Y. H., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+cancer+therapy+and+imaging+based+on+gold+nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Photothermal cancer therapy and imaging based on gold nanorods.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (2), 534-546 (2011).</li>
<li>Zhan, Q., Qian, J., Li, X., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+mesoporous+silica-encapsulated+gold+nanorods+as+enhanced+light+scattering+probes+for+cancer+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">A study of mesoporous silica-encapsulated gold nanorods as enhanced light scattering probes for cancer cell imaging.</a> Nanotechnology. 21 (5), 055704(2010).</li>
<li>Paviolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+exposure+of+gold+nanorods+can+increase+neuronal+cell+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Laser exposure of gold nanorods can increase neuronal cell outgrowth.</a> Biotechnol. Bioeng. 110 (8), 2277-2291 (2013).</li>
<li>Paviolo, C., Haycock, J. W., Cadusch, P. J., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+exposure+of+gold+nanorods+can+induce+intracellular+calcium+transients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Laser exposure of gold nanorods can induce intracellular calcium transients.</a> J. Biophotonics. 7 (10), 761-765 (2014).</li>
<li>Yong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold-nanorod-assisted+near-infrared+stimulation+of+primary+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">Gold-nanorod-assisted near-infrared stimulation of primary auditory neurons.</a> Adv. Healthcare Mater. , (2014).</li>
<li>Eom, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+infrared+neural+stimulation+using+localized+surface+plasmon+resonance+of+gold+nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced infrared neural stimulation using localized surface plasmon resonance of gold nanorods.</a> Small. , (2014).</li>
<li>Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L. M., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods%3A+Synthesis%2C+characterization+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Coordination+Chemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods: Synthesis, characterization and applications.</a> Coordination Chemistry Reviews. (17-18), 1870-1901 (2005).</li>
<li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+counting%3A+towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle counting: towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chem. Soc. Rev. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li>
<li>Sharma, V., Park, K., Srinivasarao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+separation+of+gold+nanorods+using+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Shape separation of gold nanorods using centrifugation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (13), 4981-4985 (2009).</li>
<li>Kaewkhaw, R., Scutt, A. M., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+site+influences+the+differentiation+of+adipose-derived+stem+cells+for+schwann-cell+phenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Anatomical site influences the differentiation of adipose-derived stem cells for schwann-cell phenotype and function.</a> Glia. 59 (5), 734-749 (2011).</li>
<li>Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+patch+clamp+for+investigating+the+mechanisms+of+infrared+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation.</a> JoVE. (77), (2013).</li>
<li>Cadusch, P. J., Hlaing, M. M., Wade, S. A., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+fluorescence+background+subtraction+from+Raman+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Raman+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Improved methods for fluorescence background subtraction from Raman spectra.</a> J. Raman Spectrosc. 44 (11), 1587-1595 (2013).</li>
<li>Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aligned+3D+neuronal-glial+co-culture+model+for+peripheral+nerve+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies.</a> Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+gold+nanoparticles+increase+neuronal+excitability+and+aggravate+seizure+activity+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain.</a> PLoS ONE. 9 (3), e91360(2014).</li>
<li>Salinas, K., Kereselidze, Z., DeLuna, F., Peralta, X., Santamaria, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+extracellular+application+of+gold+nanostars+increases+hippocampal+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Transient extracellular application of gold nanostars increases hippocampal neuronal activity.</a> J. Nanobiotechnology. 12 (1), 31(2014).</li>
<li>Ebbesen, C. L., Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+laser-induced+heating+in+optical+neuronal+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Analysis of laser-induced heating in optical neuronal guidance.</a> J. Neurosci. Meth. 209 (1), 168-177 (2012).</li>
<li>Iwanaga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location-dependent+photogeneration+of+calcium+waves+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Location-dependent photogeneration of calcium waves in HeLa cells.</a> Cell Biochem. Biophys. 45 (2), 167-176 (2006).</li>
<li>Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+minimum+temperature+required+for+selective+photothermal+destruction+of+cancer+cells+with+the+use+of+immunotargeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells with the use of immunotargeted gold nanoparticles.</a> Photochem. Photobiol. 82 (2), 412-417 (2006).</li>
<li>Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles+are+taken+up+by+human+cells+but+do+not+cause+acute+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity.</a> Small. 1 (3), 325-327 (2005).</li>
<li>Isomaa, B., Reuter, J., Djupsund, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subacute+and+chronic+toxicity+of+cetyltrimethylammonium+bromide+%28CTAB%29%2C+a+cationic+surfactant%2C+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The subacute and chronic toxicity of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), a cationic surfactant, in the rat.</a> Arch. Toxicol. 35 (2), 91-96 (1976).</li>
<li>Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods%3A+synthesis%2C+characterization+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Coord.+Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods: synthesis, characterization and applications.</a> Coord. Chem. Rev. 249 (17-18), 1870-1901 (2005).</li>
<li>Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+golden+age%3A+gold+nanoparticles+for+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">The golden age: gold nanoparticles for biomedicine.</a> Chem. Soc. Rev. 41 (7), 2740-2779 (2012).</li>
<li>Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuang%2C+X+%22Lasers+Med.+Sci%22">Lasers Med. Sci</a>. 23 (3), 217-228 (2008).</li>
<li>Albert, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV4+channels+mediate+the+infrared+laser-evoked+response+in+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 107 (12), 3227-3234 (2012).</li>
<li>Garcia-Elias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-4%2C5-biphosphate-dependent+rearrangement+of+TRPV4+cytosolic+tails+enables+channel+activation+by+physiological+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent rearrangement of TRPV4 cytosolic tails enables channel activation by physiological stimuli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9553-9558 (2013).</li>
<li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nat. Commun. 3 (736), (2012).</li>
<li>Roggan, A., Friebel, M., Dörschel, K., Hahn, A., Müller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+properties+of+circulating+human+blood+in+the+wavelength+range+400-2500+nm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm.</a> J. Biomed. Opt. 4 (1), 36-46 (1999).</li>
<li>Byrnes, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+promotes+regeneration+and+functional+recovery+and+alters+the+immune+response+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg.+Med%22%5BJournal%5D)">Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury.</a> Lasers Surg. Med. 36 (3), 171-185 (2005).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((810+nm+wavelength+light%3A+an+effective+therapy+for+transected+or+contused+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg.+Med%22%5BJournal%5D)">810 nm wavelength light: an effective therapy for transected or contused rat spinal cord.</a> Lasers Surg. Med. 41 (1), 36-41 (2009).</li>
<li>Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((780+nm+low+power+diode+laser+irradiation+stimulates+proliferation+of+keratinocyte+cultures%3A+involvement+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg.+Med%22%5BJournal%5D)">780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species.</a> Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).</li>
<li>Wong-Riley, M. T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobiomodulation+directly+benefits+primary+neurons+functionally+inactivated+by+toxins+-+Role+of+cytochrome+c+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins - Role of cytochrome c oxidase.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).</li>
<li>Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+mitochondrial+compartment+to+the+optical+properties+pf+the+rat+liver%3A+a+theoretical+and+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach.</a> Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

הפרוטוקולים מפורטים במצגת זו מתארים כיצד תרבות, להבדיל ואופטי לעורר תאים עצביים באמצעות בולמים חיצוניים. מאפייני NR (למשל ממדים, צורה, אורך גל תהודת plasmon וכימיה של פני השטח) ופרמטרי גירוי לייזר (כגון אורך גל, אורך הפולס, שיעור החזרה, וכו &#39;) יכולים להיות מגוון כדי להתאים לצרכי ניסיוניים שונים. ההשפעות על התנהגות תא ניתן לנטר באמצעות מבחני סטנדרטיים וחומרים ביולוגיים. בסך הכל הגישה מספקת, דרך פשוטה, אך רבת עוצמה כדי להקרין אוכלוסיות תאים במבחנה עם א...

מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי החימום החולף הכרוכות בקליטה של אור אינפרא אדום על ידי מים (אורך הגל&gt; 1,400 ננומטר) ניתן להשתמש כדי לגרום לפוטנציאל פעולה ברקמת עצב 1 וארעי סידן תוך תאי בשריר לב 2. השימוש באור אינפרא אדום העלה עניין רב עבור יישומים בתותבות עצביות, בשל הרזולוציה מרחבית עדינה הפוטנציאל, חוסר מגע ישיר עם הרקמות, מזעור של חפצי גירוי, והסרת הצורך לשנות גנטי את התאים לפני הגירוי ( כפי שנדרש בoptogenetics) 1. למרות כל היתרונות הללו, מודלים תרמיים שפותחו לאחרונה הציעו כי רקמת התאים / היעד עשויים להיות מושפעים מהשפעות מצטברות חימום, כאשר אתרי גירוי מרובים ו / או שיעורים גבוה חזרה משמשים 3,4. בתגובה לאתגרים אלה, חוקרים זיהו את הפוטנציאל לשימוש חיצוני absorbers לגירוי עצב לייצר אפקטי חימום מקומיים יותר ברקמה. הואנג et al. הוכיח את העיקרון הזה על ידי שימוש בננו-חלקיקי פרית פאראמגנטי להפעיל מרחוק ערוצי TRPV1 רגיש לטמפרטורה בתאי HEK 293 עם תדר רדיו שדה מגנטי 5. למרות שטכניקה זו עשויה לאפשר לחדירה עמוקה יותר (שדות מגנטיים מגיבים יחסית חלש עם רקמה), התגובות נרשמו רק על פני תקופות של שניות, ולא המשכים אלפית השנייה הנדרשים במכשירי יונית 5. באופן דומה, פרח et al. גירוי חשמלי של תאי עצב בקליפת המוח הראה עכברוש עם מיקרו-חלקיקים שחורים במבחנה. הם הראו דיוק ברמת תא בגירוי באמצעות משכי דופק בסדר הגודל של מאות מייקרו-שני ואנרגיות בטווח של μJ, פוטנציאל המאפשרים לשיעורי חזרה מהירים יותר 6. השימוש בבולמים חיצוניים גם הוחל לגרוםשינויים מורפולוגיים במבחנה. Ciofani et al. הראה עלייה ~ 40% בתולדת תאים עצביים באמצעות צינורות ניטריד בורון פיזואלקטריים נרגשים על ידי אולטרסאונד 7. בדומה לכך, חלקיקי תחמוצת ברזל endocytosed בתאי PC12 כבר דיווח על מנת לשפר את בידול neurite באופן תלוי מינון, בשל הפעלת מולקולות הידבקות תא עם תחמוצת ברזל 8. לאחרונה, העניין בבולמים חיצוניים כדי לסייע גירוי עצבי גם התמקד בשימוש בננו-חלקיקי זהב (NPS Au). יש צירופים וAu היכולת לספוג ביעילות אור הלייזר בשיא plasmonic וכדי להפיג אותו לסביבה בצורה של חום 9. בין כל צורות חלקיקים הזמינות, הקליטה האופטית של ננו זהב (Au NRS) במקום נוח תואמת את החלון הטיפולי של רקמות ביולוגיות (ליד אינפרא אדום - ניר, גל בין 750-1,400 ננומטר) 10. יתר על כן, בהמשךשלוחה של גירוי עצבי, השימוש בAu NRS מספק biocompatibility נוח יחסית ומגוון רחב של אפשרויות functionalization משטח 11. מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי השפעה ממריצה על בידול יכולה להיגרם לאחר חשיפת לייזר רציפה של Au NRS בNG108-15 תאים עצביים 12. באופן דומה, הארעיים סידן תוך תאי נרשמו בתאים עצביים תרבית עם Au NRS אחרי הקרנת הלייזר מווסתת עם תדרים ודופק משתנים אורכי 13. שלילת קוטביות קרום תא נרשמה גם לאחר תאורת לייזר NIR של Au NRS בתרבויות עיקריות של נוירונים הגנגליון ספירלה 14. הראשון ביישום vivo עם מוקרן Au NRS הודגם רק לאחרונה. משקיפים ועמיתים לעבודה נחשפו Au NRS בשיא plasmonic ונרשמו עלייה של פי שש במשרעת של פוטנציאל פעולה עצבי מתחם (CNAPs) וירידה של פי שלושה בסף הגירוי בעצבי sciatic חולדה. Enתגובה חל שיפורים יוחסה להשפעות חימום מקומיות כתוצאה מהעירור של שיא plasmonic NR 15. בעבודה הנוכחית, פרוטוקולים לבודקים את ההשפעה של גירוי הלייזר בNG108-15 תאים עצביים תרבית עם NRS Au מפורטים. שיטות אלה מספקות, דרך פשוטה, אך רבת עוצמה כדי להקרין אוכלוסיות תאים במבחנה תוך שימוש בטכניקות ביולוגיות סטנדרטיים וחומרים. הפרוטוקול מבוסס על דיודות לייזר בשילוב סיבים (LD), המאפשרת הפעלה בטוחה ויישור הדיר. שיטות הקרנת הכנת מדגם ולייזר Au NR ניתן להאריך עוד יותר לצורות שונות של חלקיקים ותרביות תאים עצביים, ובלבד שפרוטוקולי הסינתזה והתרבות הספציפיים ידועים, בהתאמה.

<table><tbody><tr><td>Au NR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>716812</td><td></td></tr><tr><td>NG108-15</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8811230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6546</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Life Technologies</td><td>10100147</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Life Technologies</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>BDH</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>אנטי ובטא; III-tubulin</td><td>Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>TRITC מצומד נגד עכבר נוגדן</td><td>IgG Sigma Aldrich</td><td>T5393</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis ספקטרומטר</td><td>וריאן מערכות רפואיות בע"מ</td><td>קארי 50 ביו</td><td></td></tr><tr><td>מיני צנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td>מיני ספין</td><td></td></tr><tr><td>סוניק אמבט</td><td>יוניסוניקס אוסטרליה</td><td>FPX 10D</td><td></td></tr><tr><td>חממת תרבית תאים</td><td>Kendro</td><td>Hera Cell 150</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה תרבית תאים</td><td>Hettich</td><td>Rotofix 32A</td><td></td></tr><tr><td>דיודת לייזר</td><td>Optotech</td><td>780 ננומטר סיבים במצב יחיד - מצמד LD</td><td></td></tr><tr><td>סיבים אופטיים</td><td>Thorlabs</td><td>780 HP</td><td></td></tr><tr><td>מד כוח</td><td>בדיקת</td><td></td>לייזר <td>קוהרנטי</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי</td><td>מכשירי אקסון</td><td>ImageX-press 5000A</td><td></td></tr><tr><td>&mu;-slide well</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך</td><td>קארל צייס מיקרוסקופיה בע"מ</td><td>LSM 510 אוסילוסקופ מיקרוסקופ</td><td></td>מטא-קונפוקלי</tr><tr><td></td><td>Tektronix</td><td>TDS210</td><td></td></tr></tbody></table>

זהב nanorod בסיוע גירוי אופטי של תאים עצביים

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

מחקרים אחרונים הראו כי ניתן לגרות עצבים במגוון דרכים על ידי חימום חולף הקשור לספיגת אור אינפרא אדום על ידי מים ברקמה עצבית. טכניקה זו טומנת בחובה פוטנציאל רב להחלפה או השלמה של טכניקות גירוי סטנדרטיות, בשל הפוטנציאל ללוקליזציה מוגברת של הגירוי ולמזעור המגע המכני עם הרקמה. עם זאת, גישות אופטיות מוגבלות על ידי חוסר היכולת של האור הנראה לחדור עמוק לתוך הרקמות. יתר על כן, מודלים תרמיים מצביעים על כך שהשפעות חימום מצטברות עלולות להיות מסוכנות כאשר נעשה שימוש באתרי גירוי מרובים או בשיעורי חזרות לייזר גבוהים. הפרוטוקול המתואר להלן מתאר גישה משופרת לגירוי אינפרא אדום של תאים עצביים. המנגנון הבסיסי מבוסס על חימום חולף הקשור לספיגה אופטית של ננו-מוטות זהב, מה שעלול לגרום להפעלת התמיינות תאים עצביים ולרמות מוגברות של פעילות סידן תוך תאית. תוצאות אלה מדגימות כי בולמי ננו-חלקיקים יכולים לשפר ו/או להחליף את תהליך הגירוי העצבי האינפרא אדום המבוסס על ספיגת מים, עם פוטנציאל ליישומים עתידיים בתותבות עצביות וטיפולים תאיים.

על ידי שימוש בפרוטוקולים 1, 2, ו -3 שתוארו כאן, השפעה ממריצה על בידול נצפתה בNG108-15 תאים עצביים תרבותיים עם הצירופים וAu (NRS Au, פולי (styrenesulfonate) -coated Au NRS והמצופה סיליקה Au NRS) לאחר לייזר חשיפות בין 1.25 ו -7.5 W · סנטימטר -2. תמונות Confocal של NRS Au כותרת rhodamineB הראו כי החלקיקים הופנמו מיום 1 של דגירה 12. הלוקליזציה הייתה בעיקר שנצפתה בציטופלסמה התא, מצביעה על כך שהמנגנון המועדף של ספיגה היה דרך קרום תא בגוף 12. השינויים מור...

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בחימום החולף הקשור לספיגה אופטית של ננו-מוטות זהב כדי לעורר התמיינות ופעילות סידן תוך תאית בתאי עצב. תוצאות אלה עשויות לפתוח יישומים חדשים בתותבות עצביות ומחקרים בסיסיים במדעי המוח.

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לעורר תאי עצב שגודלו עם ננו-מוטות זהב באמצעות דיודה של לייזר באינפרא-אדום קרוב. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת ננו-חלקיקי הזהב בצפיפות האופטית המתאימה. השלב השני הוא גידול תאי העצב והוספת הננו-חלקיקים אליהם.השלב הבא הוא ההקרנה בלייזר. השלב הסופי הוא אימות дифרנציאציה של התאים באמצעות ביטוי של beta three tubulin. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להראות את השונות של הסידן התוך-תאי.הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר חיפשנו דרך לעורר פוטנציאל פעולה בנוירונים בודדים בתוך אוכלוסיית תאים. את הפרוצדורה ידגימו ג'יימי מיי וסטודנטים לתואר ראשון מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בפעולה זו, הכניסו כמות קטנה של תמיסת ננו-מוטות זהב לספקטרופוטומטר UV-visible.מדוד את הצפיפות האופטית הראשונית על ידי רישום ערכי הבליעה מ-300 nanometers ועד 1000 nanometers ברזולוציה של בין 0.5 לשני nanometers. הכן תמיסת סטוק של one milliliter על ידי דילול דגימת ה-gold anoro הראשונית לצפיפות אופטית של one centrifuge. צנטריף one milliliter של תמיסת ה-gold nano rod פעמיים כדי להסיר שאריות כימיות.לאחר מכן, הסיר את העלונות ותלה את ננו-מוטות הזהב מחדש במים דה-יוניים. כדי להכין את התמיסה לשימוש בתרבית תאים, בצע סוניקציה לתמיסת הזהב למשך חמש דקות, ולאחר מכן עקר אותה באמצעות קרינת UV למשך 30 דקות. בה

gold-nanorod-assisted-optical-stimulation-of-neuronal-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

למבוגרים יליד נוירונים להביע ChR2 ניתן לטפל בהכנות פרוסה אלקטרו על מנת לבחון את תרומתם כלפי פונקציה של מעגלים עצביים חוש הריח.

באמצעות מערכי LED משתלמת עבור גירוי-תמונה של נוירונים

נוירונים בוגרים שנולדו של הנורה חוש הריח יכול להיות נשלט באמצעות optogenetically Channelrhodopsin2-לבטא הזרקת lentiviral בזרם נודדות מקורי ו photostimulation כרונית עם מיניאטורי מושתל LED.

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

סרטון זה מדגים טכניקה לקידום התמיינות עצבית על ידי חשיפת תאי עצב לננו-מוטות זהב ואור לייזר, אשר יוצרים הקרנות תאים הנתמכות על ידי βIII-tubulin. צביעה והתבוננות בטובולין ובגרעין התא במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי חושפת את צמיחת התא, דבר המצביע על יעילות הננו-מוטות בהתמיינות עצבית.

גירוי התמיינות תאי עצב באמצעות ננו-מוטות זהב

הפיתוח האחרון של כלים מדעי המוח המשלבים גנטיקה ואופטיקה, המכונה "optogenetics", מאפשר שליטה על פעילות מעגלים עצבית ברמה חסרת תקדים של רזולוציה מרחב ובזמן. כאן אנו מספקים פרוטוקול לשילוב בהקלטה vivo עם המניפולציה optogenetic של תת קבוצות גנטית מוגדרות של תאי עצב בקליפת המוח פירמידה וsubicular הקדם חזיתית.

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

אופטוגנטיקה הפכה לכלי רב עוצמה לשימוש בניסויים במדעי המוח ההתנהגותיים. פרוטוקול זה מציע מדריך שלב אחר שלב לתכנון והקמה של מערכות לייזר, ומספק פרוטוקול מלא לביצוע גירויים אופטוגנטיים מרובים ובו זמנית התואמים לרוב פרדיגמות הבדיקות ההתנהגותיות של מכרסמים.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

שתלי שבלול (CIS) לאפשר שמיעה על ידי גירוי חשמלי ישיר של עצב השמיעה. עם זאת, תדירות עניה ורזולוציה עוצמה מגבילה את איכות שמיעה עם מדינות חבר העמים. כאן אנו מתארים גירוי optogenetic של עצב השמיעה בעכברים כאסטרטגיה חלופית למחקר שמיעתי ופיתוח CIS עתיד.

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

אנו מראים את ההכנה ומתייחסים להיתכנות של כלי רכב סלולריים המכילים ננו-מוטות זהב להדמיה פוטו-אקוסטית של סרטן.

ניתוח הכנת photoacoustic של כלי רכב ניידים המכילים Nanorods הזהב

מתוארת שיטה לגירוי פעילות חשמלית של תרביות תאים במבחנה עם אור נראה, המבוססת על שימוש בפולימרים אורגניים מוליכים למחצה.

שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות

במחקר זה, אנו משנים פחמן סיבים מיקרואלקטרודות עם חלקיקי זהב כדי לשפר את הרגישות של זיהוי נוירוטרנסמיטר.

גולד ננו-חלקיק שונה סיבי פחמן מיקרואלקטרודות לגילוי משופר נוירוכימי

פרוטוקול זה מתאר את השימוש nanowires סיליקון עבור ביו-אפנון אופטי תאי של תא בשיטה פשוטה וקלה לביצוע. הטכניקה ניתנת להתאמה גבוהה לסוגי תאים מגוונים ותוכל לשמש במבחנה, כמו גם ביישומים vivo.

ננו-חוטי סיליקון וגירוי אופטי לחקירות של צימוד חשמלי פנים-תאי

כאן אנו מציגים את שיטת הייצור של מערכת אופטרודה עם סיבים אופטיים להעברת אור ומערך אלקטרודות להקלטה עצבית. ניסויי In vivo עם עכברים מהונדסים המבטאים את channelrhodopsin-2 מראים את ההיתכנות של המערכת לגירוי אופטוגנטי סימולטני ורישום אלקטרופיזיולוגי.

מערך Optrode לאפנון אופטוגנטי סימולטני והקלטה עצבית חשמלית

חקור גירוי תאים עצביים באמצעות nanorods זהב ולייזר תת-אדום קרוב. שיטה זו מאפשרת חקר דינמיקת סידן תוך-תאית והשפעה על התמיינות נוירונלית ליישומים בנוירו-פרוסתטיקה.

זהב nanorod בסיוע גירוי אופטי של תאים עצביים

גלה סרטונים נוספים