זהב nanorod בסיוע גירוי אופטי של תאים עצביים

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בחימום החולף הקשור לספיגה אופטית של ננו-מוטות זהב כדי לעורר התמיינות ופעילות סידן תוך תאית בתאי עצב. תוצאות אלה עשויות לפתוח יישומים חדשים בתותבות עצביות ומחקרים בסיסיים במדעי המוח.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעורר תאים עצביים שגודלו עם מוטות ננו זהב באמצעות דיודת לייזר אינפרא אדום קרובה. זה מושג על ידי הכנה ראשונה של ננו-חלקיקי הזהב בצפיפות האופטית הנכונה. השלב השני הוא תרבית תאי העצב והוספת הננו-חלקיקים אליהם.

השלב הבא הוא הקרנת הלייזר. השלב האחרון הוא לאמת את התמיינות התאים באמצעות בטא שלוש לביטוי טובולין. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת להצגת ארעיות הסידן התוך-תאית.

הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשחיפשנו דרך לעורר פוטנציאל פעולה בתאי עצב בודדים בקרב אוכלוסיית תאים. ידגימו את ההליך ג'יימי מיי וסטודנטים לתואר ראשון מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, הנח וטרינר של תמיסת ננו מוט זהב בספקטרופוטומטר הגלוי UV.

מדוד את הצפיפות האופטית הראשונית על ידי רישום ערכי הספיגה מ-300 ננומטר ל-1000 ננומטר ברזולוציה שבין 0.5 לשני ננומטר. הכן תמיסת מלאי של מיליליטר אחד על ידי דילול דגימת אנורו הזהב הראשונית לצפיפות אופטית של צנטריפוגה אחת. מיליליטר אחד של תמיסת מוט הננו הזהב פעמיים כדי להסיר עודפים כימיים.

לאחר מכן הסר את הסופרנטנטים והשהה מחדש את מוטות הננו הזהב במים נטולי יונים. כדי להתכונן לשימוש בתרבית תאים, סוניקציה של תמיסת אנורו הזהב למשך חמש דקות, ולאחר מכן עקר אותה באור UV למשך 30 דקות. בהליך זה, הכינו 500 מיליליטר של dmem סטרילי למדיום תרבית התאים.

לאחר מכן, גדל את תאי העצב NG 1 0 8 15 ב-10 מיליליטר של מדיום תרבית תאים בבקבוק T 75, לאחר מכן מודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ואטמוספירה לחה. כאשר התאים הם 70 עד 80% מתלכדים, החלף את המדיום במדיום טרי וחם. לאחר מכן, נתק את התאים באופן מכני על ידי דפיקות עדינות בתחתית הבקבוק המשולב.

צנטריפוגה תרחיף תאים למשך חמש דקות ב-600 גרם והשעיה מחדש של פלטת התאים בשני מיליליטר של מדיום התמיינות תאים חם. לאחר מכן ראה את התאים בצלחת של 96 בארות עם 200 מיקרוליטר של מדיום התמיינות תאים. דגרו את הדגימה למשך יום אחד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, הוסיפו את תמיסת הננו מוט הזהב ודגרו אותה למשך 24 שעות נוספות. בהליך זה, חבר את הלייזר לסיב אופטי במצב יחיד וסיים אותו עם מחבר FC. מדוד את עוצמת הלייזר המוצא עם מד כוח סטנדרטי ביום השלישי של דגירה של מוט ננו.

תקן את מחבר ה-FC לבאר, הקרין את הדגימה ואת הבקרה בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת בגל רציף בעוצמות לייזר שונות ביום החמישי, הסר את מדיום התמיינות התאים מהדגימה ותקן אותו עם 3.7% נפח לתמיסת פורמלדהיד בנפח למשך 10 דקות. ואז חדיר את התאים עם 0.1% נפח לנפח Triton X 100 למשך 20 דקות. לאחר מכן, הוסף 3% משקל לנפח BSA לדגימה למשך 60 דקות.

כדי לחסום את אתרי קשירת החלבון הלא מגיבים, סמן את הדגימה באנטי בטא שלוש טובולין למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, דגרו על התאים למשך 90 דקות בחושך עם נוגדן משני מתאים. לאחר מכן סמן את גרעיני התא ב-DAP E למשך 10 דקות.

לאחר מכן צלם את הדגימה עם מיקרוסקופיה אפי פלואורסצנטית או קונפוקלית באמצעות מטרה של פי 20 לפחות. בחר את מסנני המיקרוסקופ בהתאם לנוגדנים המשניים ובחר מסנן DAPI כדי לדמיין גרעיני תא. בשלב זה, הכינו תמיסת מלאי של 20% משקל לנפח של אוניק F1 27 על ידי המסת שני גרם מומס ב-10 מיליליטר של DMSO.

מחממים את התמיסה של אוניק F1 27 בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להגביר את המסיסות. ביום השלישי של דגירה אנארו, הכינו תמיסת מלח מאוזנת. לאחר מכן, הסר את מדיום התמיינות התאים והחלף אותו בתמיסת BSS.

בתוספת חמישה מיקרומולר של שפעת, 4:00 בבוקר ב-DMSO ו-0.1% משקל לנפח של תמיסת מלאי אוניק F1 27. לאחר מכן, חבר את הלייזר עם סיב אופטי במצב יחיד וחתך את הקצה. בטכניקה סטנדרטית.

התבונן בקצה המתקבל תחת מיקרוסקופ אופטי כדי לוודא שהקצה שטוח ומאונך לציר הסיבים. לאחר מכן מדוד את עוצמת הלייזר המוצא עם מד ההספק הסטנדרטי. לאחר מכן, הכנס את סיב אספקת האור למחזיק סיבים אופטיים והצמד אותו למיקום המיקרו.

לאחר מכן, חבר אוסצילוסקופ למחולל האותות. כדי לפקח על האפנון האופטי. השתמש באות בינארי עם תדרים ואורכי פולסים משתנים.

לאחר מכן חבר את הלייזר והשתמש באות האפנון ככניסת TTL למיקרוסקופ. השתמש בלייזר יון ארגון כדי לעורר את צבע השפעת המופנם של 4:00 AM ואת הלייזר המסונכרן. לעירור מוטות הננו האנדוציטוז, הנח את התאים מתחת למיקרוסקופ קונפוקלי הפוך ומקם את סיב אספקת האור הרחק מתא המטרה במצב תאורת שידור.

לאחר מכן חשב את רדיוס האלומה במטרה. בצע את ההדמיה של הדגימה והבקרה בטמפרטורת החדר באמצעות אובייקט של פי 40 ואסוף את סריקות סדרות הזמן ברזולוציה של 256 על 256 פיקסלים למסגרת במצב הלוך ושוב. לאחר מכן בצע הקלטה ללא כל עירור DIO בלייזר על מנת לזהות כל הפרעות לייזר יון ארגון בסיסיות המוצגת כאן היא תמונת אפי פלואורסצנטית של תאי הרואל המובחנים NG 1 0 8 15 שגודלו לבד ומוקרנים בעוצמת לייזר של 7.5 וואט סנטימטר מרובע.

וזו תמונה של התאים שגודלו במוטות ננו זהב המוקרנים בעוצמת לייזר של 1.25 וואט סנטימטרים מרובעים. הנה דוגמה לתאי עצב מובחנים NG 1 0 8 15 טעונים בשפעת הו 4:00 AM סידן. התמונה צולמה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם יעד טבילה של פי 40 בשמן.

איור זה מציג את הדגימות המייצגות של וריאציות סידן המושרות בלייזר כפונקציה של זמן. ב- NG 1 0 8 15, תאים עצביים גודלו בתנאים נטולי סרום במשך שלושה ימים עם מוטות ננו זהב פוליסטירן סולפונאט, מוטות ננו זהב וללא מוטות ננו. F מקסימום מעל F אפס מציין את עליית הקרינה המקסימלית שזוהתה בתאי עצב NG 1 0 8 15 לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך ליישום עתידי בהדמיית אופטיקה של תאים עצביים.