Name: רומן הכוח האטומי מיקרוסקופית מבוסס Biopanning לבידוד של חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה נגד גרסאות TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: למד לבודד נוגדנים מסוימים מורפולוגית נגד וריאנטים של TDP-43 בטרשת אמיוטרופית לרוחב באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי וטכנולוגיית ביופאנינג דו-שלבית. שיטה זו מאפשרת זיהוי חלבונים בריכוז נמוך בדגימות ביולוגיות מורכבות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענק מNIH: R21AG042066. ברצוננו להודות לפיליפ שולץ על תרומתו ביצירת קטעי וידאו לכידת מסך.

<ol><li>Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+recombinant+antibodies+against+specific+protein+morphologies+using+atomic+force+microscopy+and+phage+display+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies.</a> Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).</li>
<li>Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+Human+Single+Chain+Antibody+Fragment+Against+Oligomeric+%CE%B1-Synuclein+that+Inhibits+Aggregation+and+Prevents+%CE%B1-Synuclein-induced+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity.</a> Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).</li>
<li>Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Morphologically+Distinct+Oligomeric+Forms+of+%CE%B1-Synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).</li>
<li>Kasturirangan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+specific+for+oligomeric+beta-amyloid+stabilizes+nontoxic+form%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form.</a> Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).</li>
<li>Kasturirangan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+antibody+fragments+selective+for+specific+protein+morphologies+from+nanogram+antigen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples.</a> Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).</li>
<li>Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-oligomeric+A%CE%B2+Single-chain+Variable+Domain+Antibody+Blocks+A%CE%B2-induced+Toxicity+Against+Human+Neuroblastoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells.</a> Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).</li>
<li>Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+%CE%B2-Secretase+Activity+in+Alzheimer%27s+Disease+Cell+Models+with+Single-Chain+Antibodies+Specifically+Targeting+APP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer's Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP.</a> Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).</li>
<li>Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+Tandem+Single+Chain+Antibody+Simultaneously+Inhibits+%CE%B2-Secretase+and+Promotes+%CE%B1-Secretase+Processing+of+A%CE%B2PP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 28, 961-969 (2012).</li>
<li>Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Single-Chain+Fv+Intrabody+Blocks+Aberrant+Cellular+Effects+of+Overexpressed+%5Balpha%5D-Synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein.</a> Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).</li>
<li>Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43-mediated+neurodegeneration%3A+towards+a+loss-of-function+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).</li>
<li>Akamatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+mouse+model+for+investigating+the+properties+of+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+protein+TDP-43%2C+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation.</a> Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).</li>
<li>Keage, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+in+the+Population%3A+Prevalence+and+Associations+with+Dementia+and+Age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 42, 641-650 (2014).</li>
<li>Honda, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ALS%2FFTLD-related+RNA-binding+proteins+TDP-43+and+FUS+have+common+downstream+RNA+targets+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons.</a> FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).</li>
<li>Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43%3A+the+relationship+between+protein+aggregation+and+neurodegeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+lobar+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration.</a> FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).</li>
<li>Ling, S. -C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).</li>
<li>Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+subcellular+localization+of+TDP-43+immunoreactivity+in+the+anterior+horns+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).</li>
<li>Robertson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+TDP-43+abnormalities+in+mutant+SOD1+transgenic+mice+shows+disparity+with+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS.</a> Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).</li>
<li>Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mislocalization+of+TDP-43+in+the+G93A+mutant+SOD1+transgenic+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS.</a> Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).</li>
<li>Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+abnormal+processing+of+TDP-43+is+not+an+upstream+event+of+reduced+ADAR2+activity+in+ALS+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons.</a> Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).</li>
<li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+abolishes+mutant+TDP-43+induced+excitability+in+a+motoneuron-like+cellular+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS.</a> Neuroscience. 272, 141-153 (2014).</li>
<li>Sheets, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+a+large+nonimmune+phage+antibody+library%3A+The+production+of+high-affinity+human+single-chain+antibodies+to+protein+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).</li>
<li>Hairul Bahara, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+antibodies+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Phage display antibodies for diagnostic applications.</a> Biologicals. 41, 209-216 (2013).</li>
<li>Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+technology%3A+clinical+applications+and+recent+innovations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+single-chain+antibodies+from+a+human+synthetic+phage+display+library+for+detection+of+Bacillus+thuringiensis+%28Bt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cry1B+toxin.+Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt).</a> Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+characterization+of+single-chain+recombinant+antibodies+against+spring+viraemia+of+carp+virus+from+mouse+phage+display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library.</a> Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).</li>
<li>Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+salivary-pellicle-binding+peptide+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display.</a> Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).</li>
<li>Adamson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+single+chain+antibodies+to+the+prion+protein+identified+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display.</a> Virology. 358, 166-177 (2007).</li>
<li>Hebron, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+Ubiquitinates+Tar-DNA+Binding+Protein-43+%28TDP-43%29+and+Promotes+Its+Cytosolic+Accumulation+via+Interaction+with+Histone+Deacetylase+6+%28HDAC6%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6).</a> Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).</li>
<li>Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Antibody+Specificity+to+Different+Protein+Morphologies+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM.</a> Langmuir. 25, 912-918 (2008).</li>
<li>Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+brain-reactive+autoantibodies+and+behavioral+deficits+in+the+MRL+model+of+CNS+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus.</a> Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).</li>
<li>Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., Górski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+external+factors+on+bacteriophages%E2%80%94review%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The influence of external factors on bacteriophages—review.</a> Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).</li>
<li>Hammers, C. M., Stanley, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Phage+Display%3A+Technique+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Antibody Phage Display: Technique and Applications.</a> J Invest Dermatol. 134, e17(2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

וריאנטים של חלבונים הוכחו כמעורבים בהתקדמות של מחלות ניווניות רבות כגון אלצהיימר, פרקינסון, ALS ו-FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. בידוד של נוגדנים שיכולים לזהות באופן סלקטיבי את מטרות וריאנט החלבון השונות הללו יכול להיות ריאגנטים יעילים למחקר, אבחון וטיפול פוטנציאלי במחלות כאלה. כדי ליצור נוגדנים ספציפיים לוריאנטים כאלה, פיתחנו תהליך ביו-פאנינג חדשני המשתמש במיקרוסקופ כוח אטומי כדי לעקוב אחר ההתקדמות של כל שלב. עבודה קודמת שהשתמשה בשילוב ביו-פאנינג שלילי וחיובי דומה הביאה לשיבוט הקושר בטא-עמילואיד5 א...

הנוכחות של גרסאות חלבון הייתה מעורבת כגורם בהתפתחות של מחלות רבות, כולל מחלות ניווניות כגון אלצהיימר, פרקינסון, ALS ופרונטוטמפורל דמנציה (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. צורות Oligomeric של בטא-עמילואיד החלבונים ואלפא-סינוקלאין נחשבות למינים הרעילים האחראים לאלצהיימר ופרקינסון, בהתאמה 2,3,4,5. מצרפים של חלבון (43 TDP-43) TAR DNA מחייבים נקשרו לALS וFTD 12,13,14. לכן ריאגנטים כמו נוגדנים שיכולים באופן סלקטיבי למקד את גרסאות חלבון השונות יכולות להיות כלי רב עוצמה כדי לשמש כסמנים לאבחון וכתרופות פוטנציאליות. במחקר זה, אנו מתמקדים בפיתוח חומרים כימיים שסלקטיבי לאגד גרסאות של חלבון TDP-43 המעורבים בALS, אך הטכניקה שתוארה במאמר זה צריכה להיות ישימה לבידוד של חומרים כימיים נגד מגוון רחב של protein גרסאות. צבירת cytoplasmic של TDP-43 זוהתה כתכונה פתולוגית בALS 15,16,17,18,19. בדרך כלל TDP-43 נמצאים בגרעין של כל תאי מאדם נורמלי, למרות שהיא נוטה לעבור בין cytosol והגרעין 15,17. צורות עם זאת, בALS מצטברים של TDP-43 מזוהות בציטופלסמה של תאי עצב בחר וגליה עם ריכוזים נמוכים יותר נמצאו בגרעין טוען התנועה של TDP-43 מהגרעין אל הציטופלסמה במהלך התקדמות מחלה 16,20. בעוד צבירה של TDP-43 נמצאת ברוב המכריע של המקרים ALS, זה אינו לוקח בחשבון את כל המקרים מאז 1% -2% מהמקרים כולל ALS (או 15% -20% מהמקרים ALS משפחתיים) צמודים למוטציות ב סופראוקסיד דיסמוטאז 1 15,17 גן (SOD1). בגלל התפקיד החשוב של TDP-43 ברוב המכריע של המקרים ALS, כאן אנו מתמקדים בפיתוח חומרים כימיים נוגדנים מבוססים שיכול באופן סלקטיבי להיקשר לTDP-43 וריאנטים שקיים ברקמת המוח אנושית ALS תוך שימוש בטכניקות biopanning מבוסס רומן AFM שלנו. בתחילה אנו זקוקים לרפרטואר מגוון של תחומים נוגדן מחייב. אנחנו שילבנו שלוש ספריות בר שונה תצוגת הפאג שרשרת אחת תחום משתנה נוגדן (scFvs), (טומלינסון אני וJ וספריות גיליונות 21). תהליך צילום פנורמי מחולק לשלבי צילום פנורמי שליליים וחיוביים. פאגים מהספריות כפופים ראשון לתהליך צילום פנורמי השלילי שבמהלכו פאגים תגובה לאנטיגנים מחוץ יעד מרובים אינם נכללים. לאחר השלמת כל סיבוב של צילום פנורמי שלילי נגד כל אנטיגן מחוץ היעד, התהליך מנוטר על ידי ההדמיה AFM כדי להבטיח שכל הפאג מחייב אנטיגנים מחוץ היעד הוסר. רק אחרי שאימתי על ידי ההדמיה AFM שכל פאגים התגובה יוסרו אנחנו להמשיך ליעד הבא. כדי לבודד ריאגנטים נגד TDP-43 גרסאות מעורבות בALS אנו מנוצלים אנטיגנים פנורמי השליליים הבאים:<html> 1) BSA כדי להסיר הפאג אשר נקלט חלש או שאינם ספציפי לחלבונים; 2) אלפא-סינוקלאין מצטבר להסיר הפאג אשר נקלט על ידי אלמנטים מבניים הגנרית של חלבונים מצטברים; 3) homogenates רקמת המוח האנושי כדי להסיר הפאג אשר נקלט על ידי כל חלבונים או רכיבים אחרים הנמצאים בדגימות שלאחר המוות של רקמת מוח אדם בריאה; 4) immunoprecipitated TDP-43 ממוח האנושי בריא כדי להסיר הפאג אשר נקלט על ידי כל TDP-43 טפסים הקשורים למוח אנושי בריא; ו -5) immunoprecipitated TDP-43 מבודד מhomogenates מוח FTD להסיר הפאג אשר נקלט TDP-43 וריאנטים הקשורים לפתולוגיה שאינו ALS. לאחר הסרת כל הפאג התגובה לכל אנטיגנים מחוץ היעד, אנחנו לאחר מכן המשכנו את שלב צילום פנורמי החיובי שבמהלכו שברי נוגדנים שקושרים את האנטיגן של עניין מבודדים, במקרה זה TDP-43 immunoprecipitated מרקמת המוח אנושי ALS. נוגדנים מבודדים אלה עשויים להיות תגובתי לצורות מצטברות או שונה של TDP-43. &quot;&gt; Biopanning הפאג הקונבנציונלי מתמקד בעיקר בשלב צילום פנורמי החיובי 22,23. בדרך כלל המטרה של עניין היא משותקת, ספריית הפאג הוסיפה ופאגים כבול eluted. אז פאגים הם מוגברים והוסיפו ליעד שוב. תהליך ההגברה והדגירה בדרך כלל חוזרים על עצם מספר פעמים כדי להגדיל את האחוז של הפאג מחייב חיובי. בעוד וריאציות של תהליך זה נעשו שימוש נרחב לבודד את ריאגנטים נוגדנים נגד מגוון רחב של אנטיגנים יעד, הם בדרך כלל דורש כמויות גדולות של אנטיגן היעד המטוהר 24,25,26, 27, ואילו התהליך שלנו דורש רק כמויות זעירות של האנטיגן היעד. הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש כדי לבודד ריאגנטים שאנטיגנים באופן סלקטיבי לאגד יעד שנמצאים בריכוזים נמוכים מאוד, ללא הצורך בטיהור והצילום פנורמי יכולים להתבצע ישירות נגד הווה אנטיגן בדגימות רקמה מורכבות. השימוש בפרוטוקולי צילום פנורמי שליליים ממצים כפי שאומתעל ידי AFM מבטיח כי שיבוטים המבודדים נגד אנטיגן החיובי צריכים סלקטיבי יחייבו את היעד גם כאשר לא מטוהרים או מועשר. Kasturirangan ועמיתיו (2003) ביצעו תהליך biopanning שלילי וחיובי דומה לבודד נוגדנים מגיבים לביתא-עמילואיד oligomeric באמצעות ריכוז ננוגרם של היעד 5. כאן אנו להרחיב על תהליך זה כדי לאפשר את הדור של חומרים כימיים שסלקטיבי לקשור חלבון ספציפי למחלה גרסאות ישירות מדגימות רקמה אנושיות. במחקרים עתידיים בכוונתנו להמשיך לחקור לא רק את הערך האבחנתי של ריאגנטים המבודדים כאן, אלא גם להעריך את הרלוונטיות הטיפוליות שלהם לטיפול ב- ALS. בסך הכל, הטכנולוגיה הייחודית שלנו לAFM מבוססת biopanning צריכה להיות ישימה לבידודה של כל חלופת חלבון ספציפית למחלה בכל חומר ביולוגי ללא הצורך בטיהור חלבון או שינוי, גם כאשר concentratio אנטיגן היעדns הם נמוכים מאוד.

<table><tbody><tr><td>ספריות טומלינסון I ו- J</td><td>MRC (קיימברידג', אנגליה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספריית גיליונות</td><td>MRC (קיימברידג', אנגליה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>BD Sciences</td><td>244020</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>אמרסקו</td><td>0188-2.5 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>אמרסקו</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>מגרה KM13 עוזר פאג</td>' <td>MRC (קיימברידג', אנגליה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>OmniPur</td><td>5880</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן מגרה גליקול 8000</td><td>OmniPur</td><td>6510</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td> מגרה <td>מקרון</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>אמרסקו</td><td>0404-1KG</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td> מגרה <td>EMD</td><td>PX1405-1</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן מגרה פוספט מונוביסקו</td><td>אמרסקו</td><td>0781-500G</td><td></td></tr><tr><td>תאי TG1</td> מגרים <td>MRC (קיימברידג', אנגליה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani Agar</td><td>EMD</td><td>1.10283.0500</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>אמרסקו</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>STEN buffer</td><td>Crystalgen Inc.</td><td></td><td></td>33429775</tr><tr><td>Immunotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>470319</td><td></td></tr><tr><td>נציץ נציץ</td><td>אורן אשוחית</td><td>24365</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>EMD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>סיגמא</td><td>T-0303</td><td>מגרה</td></tr><tr><td>טריאתילאמין</td><td>סיגמא</td><td>T-0886</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td> דליק <td>אמרסקו</td><td>0854-1L</td><td>מגרה</td></tr><tr><td>ערכת הכנה לפלסמיד DNA</td><td>qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>אבקת חלב מגרה ללא שומן</td><td>ציפורן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 באר צלחת ELISA מחייבת גבוהה</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>Anti-M13 HRP</td><td>GE Healthcare מדעי החיים</td><td>27-9421-01</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מצע כימילומינסנציה ELISA Femto Thermo</td><td>Scientific</td><td>37074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody</td><td>ProteinTech</td><td>10782-2-AP</td><td></td></tr><tr><td>A/G חרוזי אגרוז</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-2003</td><td></td></tr><tr><td>HB 2151 תאים</td><td>MRC (קיימברידג', אנגליה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropylthiogalactoside</td><td>Teknova</td><td>13325</td><td></td></tr><tr><td>9e10 HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-40</td><td></td></tr><tr><td>קרום ניטרוצלולוזה</td><td>Biorad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td> דליקה <td>תרמו מדעית</td><td>Sorvall RC 6+</td><td></td></tr><tr><td>Nanoscope IIIa מיקרוסקופ כוח אטומי</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM בדיקות</td><td>VistaProbes</td><td>T300R-10</td><td></td></tr></tbody></table>

רומן הכוח האטומי מיקרוסקופית מבוסס biopanning לבידוד של חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה נגד גרסאות tdp-43 בטרשת לרוחב amyotrophic

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

בגלל גרסאות חלבון תפקיד קריטי במחלות רבות, כולל TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic (ALS), אלפא-סינוקלאין במחלה וביתא-עמילואיד וטאו במחלת אלצהיימר, זה חשוב באופן קריטי לפיתוח חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה שיכולה באופן סלקטיבי יעד פרקינסון חלבון ספציפי למחלה אלה גרסאות כדי ללמוד את התפקיד של גרסאות אלה בפתולוגיה מחלה ועבור יישומים אבחוניים וטיפוליים פוטנציאליים. פיתחנו טכניקות חדשניות במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) המבוססות biopanning המאפשרות בידוד של חומרים כימיים שסלקטיבי להכיר גרסאות חלבון ספציפית למחלה. ישנם שני שלבים עיקריים מעורבים בתהליך, שלבי צילום פנורמי השליליים וחיוביים. בשלב צילום פנורמי השלילי, פאגים שמגיבים לאנטיגנים מחוץ היעד בוטלו באמצעות סבבים רבים של צילום פנורמי תוסף ניצול סדרה נבחרו בקפידה אנטיגנים מחוץ היעד. תכונה מרכזית בשלילהשלב פנורמי הוא ניצול ההדמיה AFM כדי לפקח על התהליך ולוודא שכל חלקיקי phage לא רצויים יוסרו. בשלב צילום פנורמי החיובי, אנטיגן היעד של ריבית קבועה על משטח נציץ ופאגים מחויבים הם eluted והוקרנו לזהות פאגים שסלקטיבי לקשור את האנטיגן היעד. גרסת חלבון המטרה לא צריכה להיות מטוהרת מספקת בקרות צילום פנורמי השליליות המתאימות כבר בשימוש. אף למקד את גרסאות חלבון שנמצאים רק בריכוזים נמוכים מאוד בחומר ביולוגי מורכב יכול להיות מנוצל בצעד החיובי צילום פנורמי. באמצעות יישום של טכנולוגיה זו, שרכשנו את הנוגדנים לחלבון גרסאות של TDP-43 הנמצאות באופן סלקטיבי ברקמת המוח אנושית ALS. אנו צופים כי פרוטוקול זה צריך להיות ישים ליצירת חומרים כימיים שסלקטיבי לאגד גרסאות חלבון קיימים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים שונים ומחלות.

באיור 1, סכמטי מדגים את תהליך צילום פנורמי השלילי שבו אנו הוסרו הפאג מחייבים אנטיגנים מחוץ יעד מהספרייה שלנו באמצעות immunotubes. אנחנו בתחילה התחלנו עם BSA שכן מדובר בסוכן חסימה נפוץ וכל הפאג שיגיב nonspecifically עם יעד זה יהיה בעייתי בimmunoassays העתיד. בשלב הבא, הסרנו קלסרים אלפא-סינוקלאין מצטבר לחסל הפאג כי הם מגיבים עם מבנים הגנרית של חלבונים מצטברים (כלומר, נוגדנים שיהיו צלב-reactive אלפא-סינוקלאין מצטבר, TDP-43, Abeta, וכו &#39;). תוצאות...

באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי בשילוב עם טכנולוגיית ביו-פאנינג יצרנו מערכת ביו-פאנינג שלילית וחיובית לרכישת נוגדנים כנגד וריאנטים חלבונים ספציפיים למחלה הנמצאים בכל חומר ביולוגי, אפילו בריכוזים נמוכים. הצלחנו להשיג נוגדנים לגרסאות חלבון TDP-43 המעורבות בטרשת אמיוטרופית צידית.

רומן הכוח האטומי מיקרוסקופית מבוסס Biopanning לבידוד של חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה נגד גרסאות TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד ריאגנטים ספציפיים למורפולוגיה נגד חלבון קושר DNA של tar. 43 וריאנטים הנוכחים ב-LS תוך שימוש בטכנולוגיית radio panning דו-שלבית המבוססת על A FM. דבר זה מושג תחילה על ידי הגשת ספריית פאג'ים מגוונת לסבבים מרובים של panning שלילי נגד אנטיגנים שאינם מטרה באמצעות מבחנות אימונוגניות (immuno tubes).סמימה שלילית (Negative panning) מבוצעת באופן רצית נגד bovine serum albumin, alpha synuclein מצטבר ורקמת מוח אנושית בריאה. השלב השני הוא ביצוע אימות FM לאחר כל סבב של סמימה שלילית כדי להבטיח הסרה מוצלחת של כל הפאג'ים הבלתי רצויים. בדוגמה זו לסמימה שלילית, בשימוש ב-alpha synuclein מצטבר, ניתן לראות פאג'ים לאחר סבב אחד, אך הם אינם קיימים לאחר הסבב ה-10.בשל זמינות מוגבלת של דגימות, סבבי ה-panning השליליים הנותרים מבוצעים על MICA. פאגים המגיבים ל-TDP 43 שהופרד באמצעות שיקוע חיסוני (immuno precipitation) מרקמות של אנשים בריאים ומרקמות של דמנציה פרונטוטמפורלית או FTD מוסרים באופן רצף. השלב הסופי הוא בידוד הפאגים הנקשרים ל-a LS שהופרד בשיקוע חיסוני.TDP 43 המשתמש בפאג'ים קשורי מיקה נגלה באמצעות trypsin, triethyl, amine ותאי TG one. לבסוף, הספציפיות של שיבוטי a LS פוטנציאליים אלו מאומתת באמצעות indirect fa eliza's ו-dot blots; רקמות מוח אנושיות הומוגניזות של A-L-S-F-T-D ושל בני אדם בריאים מקובעות בשני הבדיקות. בדרך כלל מזוהה תגובתיות גבוהה יותר לרקמת a LS בהשוואה לקבוצות הנבדקות האחרות.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני ביו-פנינג (bio panning) קונבנציונלי של פאג'ים הוא השימוש בפרוטוקולי פנינג שלילי מקיפים, כפי שאומתו באמצעות FM, כדי להבטיח בידוד של ריאגנטים המזהים באופן סלקטיבי וריאנטים של חלבונים הספציפיים למחלה ישירות מדגימות ביולוגיות מורכבות, גם כאשר הם נוכחים בריכוזים נמוכים. למרות ש-FM יכול לספק תובנות לבדיקת מאפיינים ביו-מולקולריים ואינטראקציות, ניתן ליישמו גם במערכות אחרות, כגון ניטור התקדמות הביו-פנינג ואישור הספציפיות של CLO בודדים. התחילו את ההליך בייצור פאג'ים כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב כדי לבצע תחילה פנינג שלילי כנגד BSA, על ידי הוספת 4 mL של 1 mg/mL.העבירו תמיסת BSA במיחזור פוספטי (PBS) ל-12 מבחנות אימונו (immuno tubes) והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. לאחר מכן, ערבבו חלקיקי פאג'ים משלוש הספריות, והפרידו כמות קטנה מתערובת פאג'ים זו לצורך אימות עתידי של תהליך הניקוי השלילי (negative panning). לאחר מכן, השליכו את תמיסת ה-BSA מהמבחנה הראשונה ושטפו את המבחנה פעמיים עד שלוש באמצעות PBS כדי להסיר BSA שלא נקשר; הוסיפו את ספריות הפאג'ים המשולבות למבחנה ראשונה זו, הדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורה של החדר על גבי רוטטור, ולאחר מכן אספו את הפאג'ים שלא נקשרו.יש לזכור כי חשוב לשמור כמות קטנה של פאג'ים לאחר סיום סבבי הניפוי השליליים (negative panning) הרבים כנגד כל מטרה, וזאת כדי לאמת את הצלחת תהליך הניפוי ובמקרה של זיהום, לחזור על תהליך הניפוי השלילי עם שפופרות הפתרון של BSA שנותרו בכל פעם. השתמשו בפאג'ים שלא נקשרו (unbound) שנאספו לאחר הדגירה של השפופרת הקודמת. לאחר מכן, אמתו את הסרת כל הקושרים של פאג'ים ל-BSA באמצעות הליך ה-A FM המפורט בחלקו הבא של הסרטון.כדי להדמיה את קישור הפאג'ים באמצעות FM, הוסף 10 עד 20 µL של האנטיגן המטרה למיקה שפוצלה, והדגר למשך חמש עד 10 דקות. שטוף את ה-MICA חמש פעמים במים, ולאחר מכן הוסף 10 עד 20 µL של פאג'ים ל-MICA והדגר למשך חמש עד 10 דקות. שטוף את המיקה חמש פעמים נוספות במים והשאר לייבוש באוויר.בצע תהליך דימות AFM באמצעות מצב tapping mode ב-NanoScope III, עם בקר באוויר ובטמפרטורת החדר. לגששי ה-AFM מסיליקון יש תדר תהודה של 300 kilohertz וקבוע קפיץ של 40 newton's per meter. הכנס את חוד ה-AFM למטען החודים.חברו את טוען המחטים למיקרוסקופ ה-A FM. הניחו את הדגימה תחת מיקרוסקופ ה-A FM. השתמשו בכפתורי הכיוונון כדי ליישר את הלייזר על מחט ה-A FM.הגדירו את קצב הסריקה ל-3.05 hertz ואת רזולוציית הסריקה ל-512 samples per line. בצעו Auto-Tune למכשיר כדי למקסם את תהודה של הסיליקה. בתדר של הראש, התחילו בסריקת הדגימה.הראש יסרוק את פני השטח של ה-MICA וימדוד את גובה הפאג' הקשור. הפאג'ים הם הקווים הלבנים הארוכים; לאחר תהליך הרכישה, מעבדים את התמונות באמצעות יישור בסיסי של הרקע כדי להבטיח שכל גדלי החלקיקים יהיו ברי-השוואה בתוך כל תמונה. רוחב הפאג' עשוי להשתנות מתמונה לתמונה בשל גדלי חלקיקים אחרים ואזור הסריקה, אך הדבר לא יפגע בדיוק של קביעה אם הפאג' נקשר לאנטיגן או לא.התמונה מופשטת לתמונה דו-ממדית ואזורים בעלי איכות דמויה שנגרמה מזיהום PEG מודגשים לצורך הסרה מניתוחי נתונים עתידיים. בצעו שיקוע חיסוני של חלבון TDP 43 בריא מרקמת מוח אנושית בריאה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, בשל כמות נמוכה יותר של החלבון ששוקע חיסונית. בצעו סבבים אלו של מיון שלילי (negative panning) באמצעות MICA תחילה. העבירו שמונה משטחי MICA למשטח ה-MICA הראשון עם כ-100 µL של החלבון ששוקע חיסונית והדגרימו במשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר לאחר ההדגרה.שטוף את ה-MICA חמש פעמים עם 0.1% phosphate buffered saline with tween 20, המקוצר כ-PBST. לאחר מכן, הוסף כ-100 microliters של פאג'ים לאחר ביצוע negative panning כנגד רקמת מוח אנושית בריאה, והדגר למשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. במחצית זמן ההדגרה, הוסף את החלבון שעבר immuno precipitation ל-mica השני.אספו את הפאג מה-MICA הראשון לפני שטיפת ה-MICA חמש פעמים עם 0.1%PBST. לאחר שטיפת המיקה השני, הוסיפו את הפאג שנאסף קודם לכן. חזרו על התהליך כולו עד שהפאג יעבור מיון שלילי (negative panning) כנגד כל שמונת המיקות עם החלבון שהושקע אימונולוגית.אששו את הצלחת תהליך ה-panning באמצעות הפאג לאחר הסבבים הראשון והשמיני של panning שלילי עם FM כדי להתחיל בשיקוע חיסוני (immuno precipitate) של חלבון TDP 43 ממוחות של אנשים עם LS כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, ושטפו שלושה משטחי MICA. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של A LS TDP 43 ל-MICA הראשון לאחר דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את ה-MICA חמש פעמים עם 0.1% PBST.בשלב הבא, הוסיפו 50 µL של הפאגים שנאספו לאחר סינון שלילי (negative panning) מול TDP 43 בריא ל-MICA והדגירו למשך חמש דקות. אספו את הפאגים שלא נקשרו. חשוב לשמור על הפרדה בין כל הפאגים שנאספו בשלבי הסינון הללו.בשלב הבא, אספו את הפאגים הקשורים באמצעות שלוש שיטות אלוציה. ראשית, הוסיפו 50 µl של trypsin לכל MICA והדגירו למשך לא יותר מ-10 דקות. אספו את התמיסה ושמרו אותה.בשלב הבא, הוסף 50 µL של triethylamine בריכוז 100 mM לכל MICA והדגר למשך לא יותר מ-10 דקות. אסוף את התמיסה בנפח שווה של tris HCL buffer בריכוז 1 M ב-pH 7.4 ושמור. לאחר מכן, הוסף 50 µL של תאי TG1 ישירות ל-MICA והדגר למשך 30 דקות ב-37 °C. כמו כן, הוסף את הפאגים שנאספו משתי שיטות an elution הראשונות ל-100 µL של תאי TG1 באותו ריכוז והדגר למשך 30 דקות ב-37 °C.בשלב הבא, חזור על תהליך זה עם מיקה שנייה. קח את הפאג'ים הבלתי קשורים שנאספו מהמיקה הראשונה עם A LST DP 43 והוסף אותם למיקה השנייה עם A-A-L-S-T-D-P 43, ודגור למשך חמש דקות. ערבב את תאי ה-TG one שהודבקו בפאג'ים, אשר שוחררו באמצעות טריפסין מכל A LST DP 43 MICA, ופזר אותם על צלחת Luria-Bertani agar עם אמפיסילין או על צלחת LBA.חזור על אותו תהליך עבור הפאג'ים triethyl amine ו-TG one משתי קבוצות של A LS TDP 43 MICA, עבור סה"כ שלושה מצעים. חזור על כל השלבים עם A LS mica שלישי, אולם במקרה זה, השתמש בפאג'ים שנאספו לאחר שני סבבים של מיון שלילי (negative panning) כנגד דמנציה פרונטוטמפורלית. T DP 43 plate את תאי ה-TG one המודבקים על שלושה מצעי LBA והדגרה למשך לילה ב-37 °C.ביום למחרת, ספרו את מספר המושבות על שש צלחות ה-LBA עם שיבוטי a LS פוטנציאליים. מספר המושבות בשלוש צלחות ה-LBA מה-A LS MICA השלישי אמור להיות נמוך יותר בהשוואה לשלוש צלחות ה-LBA לאחר שני סבבים של פנינג חיובי תוך שימוש בפאג' לאחר פנינג שלילי נגד פאג'ים המייצרים TDP 43 בריא; הפקו פאג'ים ופרגמנטים של נוגדנים מסוג soluble single chain variable domain antibody fragments או s cvs משיבוטים אלו, ובחנו אותם באמצעות בדיקות אימונו-ספציפיות שונות כדי לאמת את הספציפיות לרקמת a LS.דימות FM משמש לניטור של שלבי המיון השלילי (negative panning) מול המטרות השונות כדי להבטיח שכל הפאגים הריאקטיביים הוסרו. תוצאות ה-FM הראו קישור של פאגים לאחר סבב אחד של מיון שלילי נגד alpha synuclein מצבורי, וללא קישור לאחר שמונה סבבים. מיון שלילי נגד רקמת מוח אנושית בריאה בוצע כדי להסיר פאגים הנקשרים לאנטיגנים הרבים הנוכחים בהומוגנאט של מוח אנושי בריא.מוצג כאן פאג הנקשר לרקמה בריאה לאחר סבב אחד של מיון שלילי (negative panning), וללא פאג הנקשר לאחר 10 סבבים של מיון שלילי. לאחר הכנת הפאג וה-SCFE המסיס משיבוטים פוטנציאליים, הם נבחנו בבדיקת Eliza עקיפה כדי לבחון ספציפיות לרקמת LS. כמעט כל הפאגים הראו העדפה לרקמת LS על פני רקמה בריאה.תוצאות דומות התקבלו כאשר השוו את קישור הפאג לרקמת LS מול רקמה של דמנציה פרונטוטמפורלית או FTD. השוואה של קישור SCFV לרקמת LS הן ברקמה בריאה והן ברקמת FTD הראתה שוב קישור סלקטיבי לרקמת LS כמעט בכל השיבוטים. בדיקת אימונו-סורבנט מסוג dot blot שימשה לאימות נוסף של הקישור לרקמת LS וכן כדי לקבוע אילו שיבוטים הם תגובתיים ביישומים אימונולוגיים אחרים.כאן מוצג תהליך של clone two a binding לרקמת LS. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן ליישם biop panning מבוסס FM כדי לבודד ריאגנטים נגד מטרות עניין ספציפיות למחלה, ריאגנטים שעשויים לשמש ככלים אבחנתיים ו/או טיפוליים פוטנציאליים.

novel-atomic-force-microscopy-based-biopanning-for-isolation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כוח הקשה במצב מיקרוסקופ אטומי (AFM) שיטת הדמיה של פלסמיד דנ"א, חלבונים cytoplasmic, ו-DNA-חלבון מתחמי מתואר. השיטה כוללת גישות חלופיות להכנת דגימות הדמיה AFM בעקבות מניפולציה ביוכימית. ה-DNA המכיל אזורים ספציפיים אינטראקציה חלבון שנצפה כמעט פיזיולוגי התנאים חיץ.

ויזואליזציה של דנ&quot;א רקומביננטי ו קומפלקסים חלבונים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

Source: Lunelli, L., et. al. הצצה בפוליזומים במוח עם כוח אטומי מיקרוסקופיה. J. Vis. Exp.(2016).סרטון זה מדגים הדמיה של פוליזומים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. יריעת נציץ מצופה יוני ניקל מעגנת RNA עם ריבוזומים מחוברים. הדגימה נשטפת, מיובשת ומותקנת על במת המיקרוסקופ. קצה השלוחה סורק את פני הדגימה, רושם סטיות לייזר כדי למפות את הטופולוגיה. תוכנה משמשת לתיקון עיוותים ולהמחשת מבני פוליזום ברזולוציה גבוהה.

 הדמיית פוליזומים שבודדו ממוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

RNA in situ hybridization (ISH) מאפשר הדמיה של RNA בתאים וברקמות. כאן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בהצלחה בשילוב של RNAscope ISH עם אימונוהיסטוכימיה או צבעים היסטולוגיים כדי לזהות mRNAs הממוקמים באקסונים בחלקים של מוחות עכברים ובני אדם.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

אנו מציגים פרוטוקול לפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התלויה מנופים עם תא T יחיד וחלקיק חרוז למחקרים אימונולוגיים. הליכים לחקור בודד זוג תא תא דנדריטי כריכה על ידי AFM ולפקח על התגובה התאית בזמן אמת של מקרופאגים לחלקיק אחיד אחד על ידי AFM עם הדמיה פלואורסצנטית מוצגים.

הפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי מנופים עם תאים חד-טי או חלקיק יחיד לספקטרוסקופיית של כוח בודד אימונולוגיים

אנו מתארים את היישום של ננו ספקטרוסקופית אינפרא אדום ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופ כוח אטומי כדי להמחיש את תהליך של חלבון הרכבה עצמית לתוך אגרגטים oligomeric ו-עמילואיד fibrils, אשר קשורה היטב התחלתה ופיתוח של מגוון רחב של מחלות ניווניות אנושיות.

אפיון מצרפים לחלבונים בודדים ע י ננו-ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום ומיקרוסקופ כוח אטומי

בדיקות דם מבוססות עבור מחלות ניווניות חיוניים ליישום מחקרים קליניים בקנה מידה גדול. בדיקת דם אמינה ומאומתת צריך לדרוש נפח דגימה קטן, כמו גם להיות שיטת דגימה פחות פולשנית, במחיר סביר, והניתן לקריאה. נייר זה מדגים כי התפוקה הגבוהה של אלקטרופורזה באמצעות נימי הכוח מספקת את הקריטריונים להתפתחות ביואלית פוטנציאלית.

שימוש של אלקטרופורזה נימי הנוגדנים כדי לחפש בסמנים פוטנציאליים של טרשת Amyotrophic לרוחב בטסיות האדם

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום למעבר פאזה של חלבון מחייב DNA TAR 43 (TDP-43) על ידי אור בתאי העצב המוטוריים בעמוד השדרה באמצעות דגי זברה כמודל.

מעבר שלב אופטוגנטי של TDP-43 בתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה

מחקר זה מתאר שיטות ניסוי לאפיון ביוכימי של GFAP והמוטציות הגורמות למחלות, תוך התמקדות בהרכבת פילמנט, הצבירה ושינוי פוסט-תרגום. נבדקו בחלבוני GFAP טהור גבוה, וחשפו תובנות לגבי מנגנוני מחלת אלכסנדר שעשויים לספק מסגרת לחקר מטרות טיפוליות פוטנציאליות ולהבנת מוטציות GFAP והפרעות נלוות.

גישות ניסיוניות לניתוח ביוכימי של חלבון חומצי סיבי גליאלי ושל וריאנטים הקשורים למחלה

למד לבודד נוגדנים מסוימים מורפולוגית נגד וריאנטים של TDP-43 בטרשת אמיוטרופית לרוחב באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי וטכנולוגיית ביופאנינג דו-שלבית. שיטה זו מאפשרת זיהוי חלבונים בריכוז נמוך בדגימות ביולוגיות מורכבות.

רומן הכוח האטומי מיקרוסקופית מבוסס Biopanning לבידוד של חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה נגד גרסאות TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic (וידאו) | JoVE Journal

רומן הכוח האטומי מיקרוסקופית מבוסס Biopanning לבידוד של חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה נגד גרסאות TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic

גלה סרטונים נוספים