רומן הכוח האטומי מיקרוסקופית מבוסס Biopanning לבידוד של חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה נגד גרסאות TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic
12 בפברואר 2015
באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי בשילוב עם טכנולוגיית ביו-פאנינג יצרנו מערכת ביו-פאנינג שלילית וחיובית לרכישת נוגדנים כנגד וריאנטים חלבונים ספציפיים למחלה הנמצאים בכל חומר ביולוגי, אפילו בריכוזים נמוכים. הצלחנו להשיג נוגדנים לגרסאות חלבון TDP-43 המעורבות בטרשת אמיוטרופית צידית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ריאגנטים ספציפיים למורפולוגיה כנגד חלבון קושר DNA זפת. 43 גרסאות קיימות ב- LS תוך שימוש בטכנולוגיית פאנינג רדיו מבוססת FM דו-פאזית. זה מושג על ידי הכפפת ספריית פאג'ים מגוונת לסבבים מרובים של פאנינג שלילי כנגד אנטיגנים מחוץ למטרה באמצעות צינורות חיסוניים.
פאנינג שלילי מבוצע ברצף כנגד אלבומין בסרום בקר, אלפא סינוקלאין מצטבר ורקמת מוח אנושית בריאה. השלב השני הוא השלמת אימות FM לאחר כל סט של פאנינג שלילי כדי להבטיח הסרה מוצלחת של כל הפאג'ים הלא רצויים. בדוגמה שלילית זו, שימוש בפאג'ים אלפא סינוקלאין מצטברים נראים לאחר סיבוב אחד, אך נעדרים לאחר הסיבוב העשירי.
לאחר מכן, שאר סבבי הגלילה השליליים מבוצעים ב-MICA עקב זמינות דגימה מוגבלת. פאג'ים המגיבים ל-TDP 43 משקע חיסוני מרקמת דמנציה בריאה ופרונטו-טמפורלית או FTD מוסרים ברצף. השלב האחרון הוא לבודד את הפאג'ים הנקשרים למשקעים החיסוניים של LS.
TDP 43 באמצעות פאג'ים קשורים לנציץ נרמזים באמצעות תאי טריפסין, טריאתיל, אמין ו-TG one. בסופו של דבר, הספציפיות של שיבוטי LS פוטנציאליים אלה מאומתת באמצעות כתמי fa eliza ונקודות עקיפים, A-L-S-F-T-D הומוגניים ורקמות מוח אנושיות בריאות משותקות בשתי הבדיקות. בדרך כלל מתגלה תגובתיות גדולה יותר לרקמת LS בהשוואה לקבוצות האחרות שנבדקו.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני פאג'ים ביולוגיים קונבנציונליים הוא השימוש בפרוטוקולי פאנינג שליליים ממצים כפי שאומתו על ידי FM כדי להבטיח בידוד של ריאגנטים המזהים באופן סלקטיבי וריאנטים חלבונים ספציפיים למחלה ישירות מדגימות ביולוגיות מורכבות, גם כאשר הם נמצאים בריכוזים נמוכים. למרות ש-FM יכול לספק תובנה לגבי חקירת תכונות ביומולקולריות והאינטראקציות, ניתן ליישם אותו גם במערכות אחרות כגון ניטור התקדמות הביו-עט ואישור הספציפיות של CLO בודדים. התחל הליך זה בייצור פאג'ים כמפורט בפרוטוקול הטקסט כדי לבצע פאנינג שלילי כנגד BSA תחילה, הוסף ארבעה מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר.
תמיסת BSA בתמיסת מלח חוצצת פוספט או PBS ל-12 צינורות חיסוניים ודגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שלב חלקיקי פאג'ים מכל אחת משלוש הספריות, והניח בצד כמות קטנה של תערובת פאג'ים זו לאימות עתידי של תהליך הפאנינג השלילי. לאחר מכן השליכו את תמיסת ה-BSA מהצינור הראשון ושטפו את הצינור פעמיים עד שלוש עם PBS כדי להסיר כל BSA לא קשור, הוסיפו את ספריות הפאג'ים המשולבות לצינור הראשון הזה, דגרו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על המסובב לפני איסוף הפאג'ים הלא קשורים.
זכור שחשוב לחסוך כמות קטנה של פאג' לאחר סיום הסבבים הרבים של פאנינג שלילי כנגד כל מטרה כדי לוודא את הצלחת תהליך הפאנינג ובמקרה של זיהום, חזור על תהליך הפאנינג השלילי עם הצינורות הנותרים של תמיסת BSA בכל פעם. השתמש בפאג הלא קשור שנאסף לאחר הדגירה של הצינור הקודם. לאחר מכן ודא את ההסרה של כל קלסרי הפאג'ים של BSA באמצעות נוהל A FM המפורט בחלק הבא של הסרטון.
כדי לדמיין את קשירת הפאג'ים באמצעות FM, הוסף 10 עד 20 מיקרוליטר של אנטיגן המטרה לשסע, נציץ ודגירה למשך חמש עד 10 דקות. שטפו את ה-MICA חמש פעמים במים, ולאחר מכן הוסיפו 10 עד 20 מיקרוליטר של הפאג'ים ל-MICA ודגרו במשך חמש עד 10 דקות. שטפו את הנציץ חמש פעמים נוספות במים והניחו לייבוש באוויר.
בצע את תהליך הדמיית FM באמצעות מצב הקשה FM עם ננו סקופ שלוש, בקר באוויר בטמפרטורת החדר. לבדיקות הסיליקון ו-FM יש תדר תהודה של 300 קילו-הרץ וקבוע קפיץ של 40 ניוטון למטר. הכנס את קצה ה-FM לתוך מעמיס הקצה.
חבר את מעמיס הקצה למיקרוסקופ A FM. הנח את הדגימה מתחת למיקרוסקופ A FM. השתמש בכפתורים כדי ליישר את הלייזר על קצה ה-A FM.
הגדר את קצב הסריקה ל-3.05 הרץ ואת רזולוציית הסריקה ל-512 דגימות לשורה. כוונן אוטומטית את המכונה כדי לייעל את רטט הסיליקה. תדירות הקצה, התחל סריקת דגימה.
הקצה יסרוק את פני השטח של ה-MICA, וימדוד את גובה הפאג' הקשור הפאג'ים הם הקווים הלבנים הארוכים לאחר עיבוד הרכישה של התמונות על ידי השטחה בסיסית של הרקע כדי להבטיח שכל גדלי החלקיקים ניתנים להשוואה בכל תמונה. רוחב הפאג' עשוי להשתנות מתמונה לתמונה עקב גדלי חלקיקים אחרים ואזור הסריקה, אך זה לעולם לא יפגע בדיוק אם הפאג' נקשר לאנטיגן או לא.
התמונה משוטחת לתמונה דו-ממדית ואזורים עם תמונה גרועה הנגרמים על ידי זיהום PEG מודגשים להסרה מניתוח נתונים עתידי. חיסון מזרז חלבון TDP 43 בריא מרקמת מוח אנושית בריאה כמתואר בפרוטוקול הטקסט עקב כמות נמוכה יותר של חלבון משקע חיסוני. בצע את הסבבים הללו של פאנינג שלילי באמצעות MICA תחילה חתך שמונה משטחי MICA ל-MICA הראשון בכ-100 מיקרוליטר של החלבון המשקע החיסוני ודגר במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה.
שטפו את ה-MICA חמש פעמים עם תמיסת מלח חוצצת פוספט 0.1% עם tween 20 בקיצור PBST. לאחר מכן הוסיפו כ-100 מיקרוליטר של פאג'ים לאחר הפאנינג השלילי כנגד רקמת מוח אנושית בריאה ודגרו במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. בדגירה באמצע הדרך, הוסף את החלבון המשקע החיסוני לנציץ השני.
אספו את הפאג' מה-MICA הראשון לפני שטיפת ה-MICA חמש פעמים עם 0.1% PBST. לאחר שטיפת הנציץ השני, הוסף את הפאג שנאסף בעבר. חזור על כל התהליך עד שהפאג' יופעל באופן שלילי כנגד כל שמונת הנציץ עם החלבון המשקע החיסוני.
ודא את הצלחת תהליך הפאנינג באמצעות הפאג' לאחר הסבב הראשון ושמונה של פאנינג שלילי עם FM כדי להתחיל לזרז חיסון חלבון TDP 43 ממוחם של אנשים עם LS כמתואר בפרוטוקול הטקסט, לחתוך שלושה משטחי MICA. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של A LS TDP 43 ל-MICA הראשון לאחר דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את ה-MICA חמש פעמים עם 0.1% PBST.
לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטר של הפאג' שנאסף לאחר פאנינג שלילי כנגד TDP 43 בריא ל-MICA ודגרו במשך חמש דקות. אסוף את הפאג'ים הלא קשורים. חשוב לשמור על כל הפאג'ים שנאספו בשלבי הגלילה הללו בנפרד.
לאחר מכן, אספו את הפאג'ים הקשורים באמצעות שלוש שיטות אלוציאניות. ראשית, הוסיפו 50 מיקרוליטר טריפסין לכל MICA ודגרו לא יותר מ-10 דקות. אוספים את התמיסה וחוסכים.
לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי טריאתילאמין לכל MICA ודגרו לא יותר מ -10 דקות. יש לאסוף את התמיסה בנפח שווה של חוצץ טריס HCL מולארי אחד pH 7.4 ולחסוך שלישית, להוסיף 50 מיקרוליטר של תא TG אחד ישירות ל-MICA ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כמו כן, הוסיפו את הפאג'ים שנאספו משתי השיטות האלוציאניות הראשונות ל-100 מיקרוליטר של תאי TG אחד באותו ריכוז ודגרו במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, חזור על תהליך זה עם נציץ שני. קח את הפאג' הלא קשור שנאסף באמצעות ה-MICA הראשון עם A LST DP 43 והוסף אותו ל-MICA השני עם דגירה A-A-L-S-T-D-P 43 למשך חמש דקות. שלב את תאי ה-TG הנגועים בפאג'ים, הנרמזים בטריפסין מכל נציץ A LST DP 43 וצלחת על כל צלחת מקדחת לוריא בוראני עם צלחת אמפיצילין או LBA.
חזור על אותו תהליך עבור הטריאתיל אמין ו-TG אחד רמז פאג'ים משתי הקבוצות של A LS TDP 43 MICA בסך הכל שלוש צלחות. חזור על כל השלבים עם נציץ A LS שלישי, עם זאת, במקרה זה, השתמש בפאג' שנאסף לאחר שני סבבים של פאנינג שלילי נגד דמנציה פרונטו-טמפורלית. T DP 43 לוחית את תאי ה-TG הנגוע בשלוש לוחות LBA ודוגר למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
למחרת. ספרו את מספר המושבות על ששת לוחות ה-LBA עם פוטנציאל לשיבוטים של LS. אמורות להיות פחות מושבות על שלושת לוחות ה-LBA מה-A LS MICA השלישי בהשוואה לשלושת לוחות ה-LBA לאחר שני סבבים של פאנינג חיובי תוך שימוש בפאג' לאחר פאנינג שלילי כנגד TDP בריא 43 לייצר פאג'ים ושברי נוגדנים מסיסים בשרשרת אחת או קורות חיים מהשיבוטים הללו ולנתח באמצעות מבחנים חיסוניים שונים כדי לאמת את הספציפיות לרקמת LS.
הדמיית FM משמשת לניטור שלבי הגלילה השליליים כנגד המטרות השונות כדי להבטיח שכל הפאג'ים הריאקטיביים יוסרו. תוצאות FM הראו קשירת פאג'ים לאחר סבב אחד של פאנינג שלילי כנגד אלפא סינוקלאין המצטבר וללא קשירה לאחר שמונה סבבים. פאנינג שלילי כנגד רקמת מוח אנושית בריאה בוצע כדי להסיר פאג'ים הקושרים את האנטיגנים הרבים הקיימים במוח אנושי בריא.
מוצג כאן פאג'ים שנקשרים לרקמה בריאה לאחר סבב אחד של פאנינג שלילי ואף פאג' לא נשאר נקשר לאחר 10 סבבים של פאנינג שלילי. לאחר הכנת פאג'ים ו-SCFE מסיסים משיבוטים פוטנציאליים, הם נבדקו בעקיפין אלייזה לספציפיות לרקמת LS. כמעט כל הפאג'ים הראו העדפה לרקמת LS על פני רקמה בריאה.
תוצאות דומות מתקבלות כאשר משווים קשירת פאג'ים ל-LS לדמנציה פרונטו-טמפורלית או רקמת FTD. השוואה של קשירת SCFV לרקמת LS הן ברקמה בריאה והן ברקמת FTD הראתה שוב קשירה סלקטיבית לרקמת LS כמעט בכל השיבוטים. הבדיקה החיסונית של כתם הנקודות שימשה כדי לאמת עוד יותר את הקישור לרקמת LS וגם כדי לוודא אילו שיבוטים מגיבים ביישומים אימונולוגיים אחרים.
כאן, מוצג שיבוט שני של קשירה לרקמת LS. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליישם פאנינג ביופ מבוסס FM כדי לבודד ריאגנטים כנגד מחלות, יעד ספציפי של אינטרסים, ריאגנטים, שעשויים לשמש ככלי אבחון ו/או טיפול פוטנציאליים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מחקר זה מציג גישה חדשנית לבידוד נוגדנים נגד וריאנטים של חלבון TDP-43 הקשורים לטרשת עורקית צדדית אמיוטרופית (ALS) באמצעות מיקרוסקופית כוח אטומית וטכנולוגיית ביופאנינג. השיטה כוללת מערכת ביופאנינג דו-פאזית ליעול מדויק של וריאנטים של חלבונים ספציפיים למחלה בחומרים ביולוגיים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- אימונולוגיה
- ביוטכנולוגיה
רקע
- TDP-43 הוא חלבון הקשור ל-ALS.
- נוגדנים נגד וריאנטים ספציפיים של חלבונים יכולים לסייע במחקר מחלות.
- טכנולוגיית ביופאנינג מאפשרת בחירה של נוגדנים ספציפיים.
- מיקרוסקופית כוח אטומית מספקת ניתוח מפורט של אינטראקציות חלבון.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לבידוד נוגדנים נגד וריאנטים של TDP-43.
- להשתמש במערכת ביופאנינג שלילית וחיובית לרכישת נוגדנים.
- לשפר את זיהוי חלבונים בריכוז נמוך בדגימות ביולוגיות.
שיטות ששימשו
- ביופאנינג שלילי נגד אנטיגנים שאינם יעד באמצעות צינורות חיסון.
- סיבובים רצופים של ביופאנינג נגד אלבומין סרום בקר וסינווקלין אלפא מצטבר.
- אימות של הסרת פאג'ים באמצעות מיקרוסקופית כוח אטומית.
- הערכת נראות הפאג'ים לאחר מספר סיבובים של ביופאנינג.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של נוגדנים נגד וריאנטים של חלבון TDP-43.
- הסרה יעילה של פאג'ים שאינם יעד באמצעות ביופאנינג שלילי.
- הוכחת יכולת לזהות חלבונים בריכוז נמוך.
- אימות של המתודולוגיה באמצעות הדמיה במיקרוסקופית כוח אטומית.
מסקנות
- מערכת הביופאנינג שפותחה יעילה לבידוד נוגדנים.
- שיטה זו יכולה לשמש לחלבונים ספציפיים למחלות אחרים.
- מיקרוסקופית כוח אטומית משפרת את תהליך האימות בבחירת נוגדנים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to isolate morphology-specific reagents against disease-associated protein variants directly from complex biological samples, even at low concentrations. By integrating atomic force microscopy verification with exhaustive negative panning, the approach enhances target validation confidence and reduces mechanistic ambiguity in early discovery. It supports predictive de-risking for therapeutic antibody development against challenging targets like TDP-43 variants in ALS and related neurodegenerative diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating reagents that selectively recognize disease-specific protein variants.
- Operational Value: Supports biological de-risking through sequential negative panning against off-target antigens to eliminate cross-reactive clones.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying reagents with selective binding to pathological variants over healthy tissue controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming phage removal via AFM imaging after each negative panning round.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through quantitative AFM-based monitoring of panning progress.
- Scalability: Enables screening readiness for low-abundance targets without requiring protein purification, expanding accessible antigen space.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant systems by isolating reagents that bind selectively to ALS tissue over healthy and FTD controls.
- Operational Value: Supports translational continuity from discovery through preclinical validation using immunoassays like indirect ELISA and dot blot.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven decisions by verifying specificity across multiple immunological applications before lead identification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, supporting hypothesis testing and biological de-risking prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating variants-specific reagents from complex lysates.
- Screening: Describes assay readiness through AFM-verified negative panning, ensuring reproducible phage library depletion.
- Analytics: Highlights quantitative AFM imaging outputs that enable teams to confirm removal of unwanted phages and track panning efficiency.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through validation in ALS tissue versus healthy and disease controls using standardized immunoassays.
- Enterprise Reuse: Frames the AFM-based biopanning platform as a reusable capability for isolating variants-specific reagents across neurodegenerative disease targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and selective recognition of disease-specific variants.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of panning workflows via AFM monitoring.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on variant-selective binding profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in phage display, AFM instrumentation, and immunoassay techniques.
- Dependent on AFM infrastructure for imaging and verification steps, including probe calibration and environmental control.
- Necessitates cross-team standardization between discovery biology and analytical teams for consistent panning monitoring.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different antigen types or complex sample matrices.
- Practical limitations include dependency on effective negative panning controls and AFM accessibility for routine monitoring.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:47
12 Rounds of Negative Panning Against Bovine Serum Albumin (BSA)
4:19
AFM Process
6:26
8 Rounds of Negative Panning Against Healthy Immunoprecipitated TDP-43
7:54
Positive Panning against Immunoprecipitated TDP-43 from Individuals with ALS
11:17
Results: Analysis of Potential ALS Clones
12:59
Conclusion
