ההדמיה Ca
6 במאי 2015
אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר דינמיקת 2 + Ca במסופים האקסון של קולטני האור חרוט באמצעות הכנת פרוסה לשעבר vivo של רשתית העכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים מקיפים של איתות קונוס Ca 2 + במערכת מודל של יונקים חשוב, העכבר.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקליט אותות סידן המעוררים על ידי גירוי אור מהפוטורצפטורים מסוג קונוס (cone photoreceptors) ברשתית של עכבר באמצעות ביו-סנסור פלואורסצנטי. דבר זה מושג על ידי בידוד הרשתית מקו עכברים טרנסגני המבטא חיישן סידן מקודד גנטית באופן בלעדי בפוטורצפטורים מסוג קונוס. השלב השני הוא חיתוך פרוסות אנכיות של רקמת הרשתית.
בשלב הבא, פרוסות הרשתינה מורכבות על לוחות כיסוי ומונחות תחת מיקרוסקופ פוטונים כפולים. השלב הסופי הוא הקלטת אותות סידן מהסיומות הסינפטיות הבודדות של פוטורצפטורי קונוס בתגובה לגירוי של אור. לבסוף, אותות הסידן שהוקלטו מנותחים באופן לא מקוון (offline).
באמצעות שיטה זו, אנו יכולים להקליט את הפעילות של רספטורי תזונה רבים בתירס בו-זמנית ברזולוציה סוב-סלולרית. זהו היתרון המרכזי על פני טכניקות קיימות, כגון הקלטות חשמליות של תא בודד, שהן קשות יותר וגוזלות זמן רב יותר. לפיכך, השאלה שברצוננו לבחון היא האם וכיצד סידן מעורב בניוון של פטורצפטורים.
שיטה זו מאפשרת לנו לקבוע אם זרימה פנימה של סידן היא זו שמניעה את דגנרציית הפוטורספטורים או שמא היא תוצאה של העובדה שהתא גוסס. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשרו בעיקר בשל הצורך לשמר את הרגישות של הרשתית לאור, ולכן יש לבצע את כל השלבים העדינים, כולל דיסקציה וחתך של הרשתית, תחת תאורה ירוקה או אדומה. כדי להתחיל בהליך זה, העבירו גלגל עין של עכבר לצלוחית פטרי המכילה תמיסה חוץ-תאית שחומצנה באמצעות פחמן דו-חמצני טרי.
דקרו את גלגל העין בכל נקודה לאורך הגבול שבין הקרנית ללובן העין באמצעות מחט הזרקה חדה. לאחר מכן, אחזו את העין בחלק של לובן העין באמצעות פינצטה והחדירו בעדינות להב אחד של מספריים לתוך החור. גזרו לאורך ה-ora serrata כדי להפריד את החלק הקדמי של העין מגביע העין.
לאחר מכן, חתוך את גביע העין באופן רדיאלי במיקום סימון העט המציין את המיקום הדורסלי ברשתית. לאחר מכן, מקם את גביע העין כך שהחתך הדורסלי פונה החוצה. אחז בסקלרה בצד שמאל ובצד ימין של גביע העין על ידי החדרת קצות הפינצטה בין הרשתית לסקלרה.
לאחר מכן, נתקו את הרשתית על ידי היפוך עדין של חלק הסקלרה (luteal part) של ה-iica. לבסוף, חתכו את העצב האופטי כדי לשחרר את הרשתית מהסקלרה. החזיקו את קצה הרשתית בעזרת פינצטה והסירו בעדינות שאריות וגוף זגוגית מפני השטח של הרשתית באמצעות זוג פינצטות שני.
כאשר פני השטח של הרשתית נקיים, בצעו שלושה חתכים רדיאליים קצרים נוספים. כעת טבלו באיטיות זכוכית כיסוי לתוך התמיסה החוץ-תאית בסמיכות לרקמה. משכו בעדינות את הרשתית אל על זכוכית הכיסוי כאשר הצד של תאי הגנגליון פונה כלפי מעלה, על ידי תפיסת הקצה, כדי לצמצם נזק מכני וקיפול של הרקמה.
בשלב הבא, גזרו מלבן של כ-1 על ידי 2 מילימטרים מאזור הרשתית שנבחר באמצעות להב סקאלפל מעוקל ונגבו תמיסה עודפת מסביב לרקמה. לאחר מכן, הניחו את ממברנת סיבי הניטרוסלולוז שהוכנה מראש מעל פיסת הרשתית, כך שצד תאי הגנגליונים ייצמד לממברנה. הוסיפו מיד טיפה של מצע חוץ-תאי (extracellular medium) על הממברנה כדי להצמיד את הרקמה אליה בצורה חזקה.
העבירו את רקמת הרשתית המעוגנת לממברנה אל תא החיתוך המכיל תמיסה חוץ-תאית טרייה. לאחר מכן, חתכו את הרשתית לפרוסות אנכיות בעובי 200 micrometer. באמצעות קוצץ רקמות, הדביקו פרוסה אחת המעוגנת לממברנה לזכוכית כיסוי שהוכנה מראש עם גריז ואקום גבוה.
שמרו על פני השטח של הזכוכית מתחת לרשתית נקיים משומן. לאחר מכן, הוסיפו טיפה של תמיסה חוץ-תאית לכל פרוסה המותקנת על לבידה בתא ההחזקה בטמפרטורת החדר. הכניסו קרבוגן לתא על ידי ביבוע של מאגר מים קטן כדי לשמור על האטמוספירה בתא ההחזקה רטובה.
הניחו לפרוסות לנוח בתא ההמתנה למשך 10 עד 15 דקות לפני העברתן אחת אחת לתא ההקלטה. העבירו פרוסה מתא ההמתנה לתא ההקלטה והתחילו מיד בביצוע פרפוזיה באמצעות תמיסה חוץ-תאית מוגזת. שמרו על קצב זרימה של הפרפוזיה של 2 mL לדקה ועל טמפרטורה של 37 °C.
בתא ההקלטה. השתמש בעדשת שיקוע במים 20 x 0.95 NA ובמצלמת CCD בשילוב עם LED באינפרא-אדום מתחת לתא ההקלטה. כדי לאתר את פרוסת הרשתית, הפעל את מערכת הדימות הדו-פוטונית בהתאם להנחיות היצרן.
בשלב הבא, הדליקו את הלייזר והגדירו אותו ל-860 nanometers. הפעילו את שני ערוצי הזיהוי לדימות פלואורסצנציה של ECFP ו-citrine. לאחר מכן, באמצעות תוכנת רכישת התמונות, הפעילו את מיקרוסקופ הפוטונים הכפולים כדי לסרוק ולבחור שורה של קצות קונוסים (cone terminals) להקלטה; הגדירו את רכישת התמונות לתמונות של 128 על 16 pixels או תצורה דומה, והגבילו את אזור הסריקה לקצות הקונוסים כדי למנוע הלבנה (bleaching) של פוטו-פיגמנטים במקטעים החיצוניים.
הפעל את הלייזר. אפשר למסלולים (cones) להסתגל ללייזר הסריקה ולאור הרקע של הגירוי במשך 20 עד 30 שניות לפני הצגת גירויי אור או יישום של חומרים פרמקולוגיים. כעת התחל בהצגת הגירויים השרירותיים.
הגירויים נוצרים על ידי מודולציה של עוצמת שתי נורות ה-LED לאורך זמן, באמצעות לוח מיקרו-מעבד הנשלט על ידי תוכנה מותאמת אישית. לאחר מכן, התחל בהקלטה של שני ערוצי הפלואורסצנציה בו-זמנית באמצעות תוכנת רכישת התמונות המתאימה. ההקלטות התמקדו בסיומות הסינפטיות של פוטורצפטורים מסוג קונוס (cone photoreceptors) בחתכי רשתית.
זוהי דוגמה לאזור שהוקלט עם שבעה טרמינלים בודדים. הפלורסצנציה הוקלטה באמצעות שני ערוצים, אחד עבור ה-fre scepter citrine, ואחד עבור ה-fret donor.ECFP. מוצגים כאן שינויים בעוצמת הפלורסצנציה של citrine ו-ECFP שעוררו באמצעות אור והוקלטו באזור עניין (region of interest) בודד.
וכאן מוצגות תגובות הסידן של קצה קונוס לסדרה של הבזקי אור בהיר למשך שנייה אחת במרווחים של חמש שניות. איור זה מציג ניתוח כמותי לדוגמה של תגובות סידן בקונוס המעוררות על ידי אור. וכאן מוצגות תגובות הסידן המעוררות על ידי אור מקצה קונוס בודד.
איור זה מציג את קביעת תגובת הסידן הממוצעת. רמת הסידן במצב מנוחה מייצגת את קו הבסיס לפני גירוי באור, וגודל התגובה הוא ra, שהוא השטח שבין רמת הסידן במצב מנוחה לבין אמפליטודת השיא, ובין הקינטיקה של תחילת התגובה לסיומה. ניתן להרחיב הליך זה עוד יותר.
לדוגמה, אותיות סידן בתאי פוטורספטורים עשויות להיות משמעותיות תחת תנאי גרייה רחבים ותנאים פרמקולוגיים מגוונים לצורך חקירה, כגון אדפטציה או לימוד מפורט של שלבים שונים בתהליך הפוטוטרנסדוקציה. טכניקה זו מאפשרת לחקור את דינמיקת הסידן בתאי פוטורספטורים מסוג קונוס תחת תנאים פיזיולוגיים נורמליים. דבר זה רלוונטי במיוחד להבנת דגנרציה ראשונית ושניונית של פוטורספטורים מסוג קונוס במחלות עיוורון אנושיות כגון acro topia או retinitis pigmentosa.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול לניטור דינמיקת Ca2+ בעקצונות האקסון של פוטורספטורים מסוג קונוס (cone photoreceptors) באמצעות פרוסות ex-vivo של רשתית עכבר. השיטה מאפשרת מחקרים מקיפים של איתות Ca2+ בקונוסים במערכת מודל של יונקים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- תפקוד פטורצפטורים
רקע
- אותיות סיגנלינג של סידן הן קריטיות לתפקוד הפוטורצפטורים.
- הבנת הדינמיקה של Ca2+ יכולה לשפוך אור על דגנרציה של פוטורצפטורים.
- טכניקות קיימות לחקר דינמיקות אלו הן לרוב מורכבות וגוזלות זמן.
- פרוטוקול זה נועד לפשט את התהליך תוך אספקת נתונים ברזולוציה גבוהה.
מטרת המחקר
- להקליט אותות סידן המושרים על ידי אור מפוטורצפטורים מסוג קונוס.
- לחקור את תפקידו של הסידן בניוון של פוטורצפטורים.
- לאפשר הקלטה סימולטנית ממסופי קונוס מרובים ברזולוציה סוב-צלולית.
שיטות בשימוש
- בידוד רשתית מעכבר טרנסגני המבטא חיישן סידן מקודד גנטית.
- הכנת פרוסות אנכיות של רקמת רשתית.
- מיקרוסקופיה דו-פוטונית להדמיית אותות סידן.
- ניתוח תגובות סידן לגירויים של אור.
תוצאות עיקריות
- הקלטה מוצלחת של דינמיקת סידן בפוטורצפטורים מסוג קונוס (cone photoreceptors).
- הוכחת היכולת לנתח תגובות סידן לגירויי אור שונים.
- אספקת תובנות לגבי הקשר בין זרימת סידן (calcium influx) לבין בריאות הפוטורצפטורים.
- הדגשת היתרונות של שיטה זו לעומת טכניקות מסורתיות.
מסקנות
- פרוטוקול זה מציע שיטה מהימנה לחקר דינמיקת Ca2+ בפוטורספטורים מסוג קונוס.
- הוא מאפשר בחינה של תפקידו של הסידן בניוון של פוטורספטורים.
- השיטה משפרת את ההבנה של מנגנוני העברת אותות ברשתית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות כמותי של דינמיקת Ca2+ בקצות האקסונים של הפוטורספטורים הקוניים נותן מענה לפער קריטי בהבנת הבסיס המכניסטי של דגנרציה רשתית. פרוטוקול זה מאפשר מדידה מרובת-ערוצים (multiplexed) ברזולוציה גבוהה של תגובות Ca2+ המושרות על ידי גירוי, ובכך תומך בביטחון חיזוי בתיקוף מטרות למחקר מחלות נוירודגנרטיביות. גישה זו מיועדת לספק מידע לשלבי הגילוי המוקדמים ולאסטרטגיות תרגומיות עבור פורטפוליו של שיקום הראייה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולי העברה תלויי Ca2+ המעורבים בניוון של פוטורצפטורים.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי הבחנה בין זרימה של Ca2+ כגורם סיבתי לבין זרימה כתוצאה משנית במודלים של מחלות.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות בקווי עכברים מהונדסים גנטית הרלוונטיים להפרעות רשתית אנושיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת ex vivo מתוקף לקריאות כמותיות וניתנות לשחזור של Ca2+ בקצוות של תאי קונוס.
- מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה ויכולת הרחבה לסריקת תרכובות או מודיפיקטורים גנטיים.
- מספק נתונים ברזולוציה סוב-סלולרית לתמיכה בהערכה מהימנה של התערבויות מועמדות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תואם למודלים רלוונטיים למחלה לצורך חקר מנגנוני דגנרציה ראשוניים ושניוניים של תאי קונוס.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי מתן אפשרות להכלאה עם מודלים של דגנרציה.
- מספק ערך ניבוי לפיתוח ביומרקרים תרגומיים במסלולי פיתוח של מחלות רשתית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול דימות זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשר בין מחקרים מכניסטיים למחקר תרגומי במחלות רשתית העין.
- ביולוגיה של התגלהיות: מכמת שינויים ב-Ca2+ המעוררים על ידי גירוי כדי להבהיר מסלולי סיגנל של פוטורצפטורים וגורמים לדגנרציה.
- סינון (Screening): קובע נקודות סיום כמותיות הניתנות לשחזור להערכת התערבויות פרמקולוגיות או גנטיות.
- אנליטיקה: מספק מדידות של ריכוזי Ca2+ מוחלטים ויחסיים לצורך השוואה סטטיסטית חסונה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מאפשר התאמה למודלי מחלה ותומך בפיתוח אסטרטגיה של ביומרקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה למודלי עכברים מגוונים ולתנאים ניסויים שונים עבור יישום רחב במו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ואת ההבנה המכניסטית של ניוון רשתית.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה של דימות סטנדרטיים, ניתנים להרחבה ולשחזור, לצורך השוואתיות בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומפחית סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים בתוכניות לשיקום הראייה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מטרות והתערבויות בקווי פיתוח של ניוון עצבי, בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של רשתית, מיקרוסקופיה דו-פוטונית וטיפול בביוסנסורים מקודדים גנטית.
- דורש מכשור דימות ייעודי ותשתית לניתוח פלואורסצנציה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך הדירות והשוואת נתונים.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של עכברים, אך רגיש לתנאי טיפול ברקמה ולחשיפה לאור.
- תלוי בזמינות של קווים טרנסגניים ובפרוטוקולי כיול לצורך כימות מוחלט של Ca2+.
