Name: ההדמיה Ca 2 + Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: למדו לרשום דינמיקת סידן בסופי קונים של רשתית עכבר באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים. שיטה זו מאפשרת מחקר מקיף של תאי עצב ברזולוציה תת-תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (מרכז ורנר רייכארדט למדעי המוח האינטגרטיביים Tübingen, EXC 307 to T.E. ו-T.S.; KFO 134 ל-B.W. ו-F.P.D.), משרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF) (BCCN Tübingen, FKZ 01GQ1002 ל-T.E ו-T.B.), והאיחוד האירופי (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 ל-M.K. ו-F.P.D).

<ol><li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+strategies+for+the+treatment+of+inherited+photoreceptor+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration.</a> Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).</li>
<li>Paquet-Durand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain+is+activated+in+degenerating+photoreceptors+in+the+rd1+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse.</a> Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).</li>
<li>Paquet-Durand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+key+role+for+cyclic+nucleotide+gated+%28CNG%29+channels+in+cGMP-related+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa.</a> Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).</li>
<li>Frasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%3A+rod+photoreceptor+rescue+by+a+calcium-channel+blocker+in+the+rd+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse.</a> Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).</li>
<li>Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+calcium+channel+blocker+diltiazem+on+photoreceptor+degeneration+in+the+rhodopsin+Pro213His+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).</li>
<li>Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+photoreceptor+rescue+with+D-cis-diltiazem+in+the+rd+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).</li>
<li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-dependent+changes+in+outer+segment+free-Ca2%2B+concentration+in+salamander+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors.</a> The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).</li>
<li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+light+intensity+by+the+cone+photoreceptor+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 48, 555-562 (2005).</li>
<li>Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+stores+in+vertebrate+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium stores in vertebrate photoreceptors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012).</li>
<li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-driven+calcium+signals+in+mouse+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors.</a> The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).</li>
<li>Johnson, J. E. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+regulation+of+ATP+and+Ca2%2B+dynamics+in+vertebrate+rod+and+cone+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses.</a> Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46, 143-151 (2008).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-disruptive+technique+for+loading+calcium+buffers+and+indicators+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells.</a> Nature. 290, 527-528 (1981).</li>
<li>Hendel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).</li>
<li>Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+reporter+of+synaptic+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo.</a> Nature Methods. 6, 883-889 (2009).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+locus+control+region+adjacent+to+the+human+red+and+green+visual+pigment+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes.</a> Neuron. 9, 429-440 (1992).</li>
<li>Connaughton, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+retinal+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Zebrafish retinal slice preparation.</a> Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003).</li>
<li>Baden, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+two+retinal+domains%3A+near-optimal+sampling+of+achromatic+contrasts+in+natural+scenes+through+asymmetric+photoreceptor+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution.</a> Neuron. 80, 1206-1217 (2013).</li>
<li>Kemmler, R., Schultz, k, Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+cone+calcium+signals+by+different+horizontal+cell+feedback+mechanisms+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).</li>
<li>Werblin, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Euler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyecup+scope--optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina.+Pflugers+Archive%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive.</a> European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).</li>
<li>Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spikes+in+mammalian+bipolar+cells+support+temporal+layering+of+the+inner+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina.</a> Current Biology. 23, 48-52 (2013).</li>
<li>Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatic+bipolar+cell+pathways+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Thoreson, W. B., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+interactions+in+the+outer+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Lateral interactions in the outer retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).</li>
<li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).</li>
<li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%3A+rapid+neurodegeneration+is+governed+by+slow+cell+death+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms.</a> Cell Death & Disease. 4, e488(2013).</li>
<li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+gene+knock-out+increases+resistance+to+retinal+degeneration+without+affecting+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function.</a> PloS One. 5, e15495(2010).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פרוטוקולים קיימים מראש באמצעות הקלטות מתא בודד אלקטרו או Ca 2 + הדמיה עם אינדיקטורים ניאון סינטטיים להיאבק כדי להקליט את 2 + Ca הדינמיקה בקולטני אור קונוס עכבר למספר הסיבות טכניות (ראה מבוא). הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר המדידה של Ca 2 + אותות ואפילו Ca 2 + רמות מוחלטות במסופים בודדים שנוצר על קונוס העכבר בדרך יעילה ופשוטה יחסית. פרוטוקול זה כבר שימש בהצלחה בשלושה מחקרים העוסקים בהיבטים שונים של תפקוד חרוט ברשתית עכבר בריאה. במחקר הראשון 10, HR2.1: עכבר TN-XL התאפיין באמצעות אימונוהיסטוכימיה, הקלטות ERG, שני פוטונים הדמיה Ca 2 +, ופרמקולוגיה, מראה כי ביטוי קונוס הספציפי של biosensor Ca 2 + לא להפריע האנטומיה חרוט ותפקוד. במחקר השני 21, כרומטיתומאפייני תגובה אכרומטית של קונוסים עכבר מופו על פני הרשתית, מדגימים הבדלים בולטים בתפקוד קונוס בין הגב-נשלט opsin &quot;הירוק&quot; והרשתית &quot;הכחולה&quot; הנשלט opsin הגחון העכבר. הבדלים האזוריים אלה בנכסי קונוס תאמו את חלוקת ניגוד ההפרש בסביבה הטבעית (כלומר, שמים לעומת קרקע), המצביעים על כך הסוגים השונים של קונוסים הרפאים עכבר לספק ל( ליד) דגימה אופטימלית של ניגודים אכרומטית ו, ובכך, עשויה להציע יתרון אבולוציוני. במחקר השלישי 22 המשוב ההדדי שסופי האקסון חרוט מקבלים מהתאים אופקיים נחקר. כפי שכל מנגנוני משוב תא אופקי הציעו לפעול במתח מגודרת 2 + ערוצי Ca בסופי האקסון קונוס 28, מסוף חרוט Ca 2 + יכול לשמש כמדד לאינטראקציות תא אל החרוט אופקיים. המחקר על ידי Kemmler ועמיתים לעבודת 22 תומכיםההשקפה שתאים אופקיים להשתמש במערכת משוב מורכבת הכוללת מספר מנגנונים לשלוט שחרור גלוטמט קולטי האור. מחקרים אלה ממחישים את הרבגוניות של הפרוטוקול המתואר ולהראות שזה יכול להיות מותאם למגוון רחב של שאלות הנוגעות פונקצית חרוט ומעגלים הסינפטי. בנוסף, הפרוטוקול מאפשר ללמוד Ca 2 + איתות מקומית בתאי קונוס השונים, להבנה טובה יותר של הפיסיולוגיה קונוס. ידע כזה חשוב להבין תהליכי pathophysiological בקונוסים מנוונים, כדי לאפשר סופו של דבר לפיתוח רציונלים של גישות טיפוליות פוטנציאליות, במיוחד למחלות ניווניות המשפיעות על קונוסים. בHR2.1: קו עכבר TN-XL, biosensor Ca 2 + בא לידי ביטוי בכל חרוט, למעט הקטע החיצוני. זה מספק הזדמנות להערכה ישירה וratiometric של Ca 2 + דינמייםים בתאי קונוס שונים. מאז שינויים בCa 2 + זרמים במגזר החיצוני משתקפים במסופים באמצעות פוטנציאל הממברנה וההפעלה של ערוצי Ca 2 + מתח מגודרת וכתוצאה מכך, תהליכים בקטע החיצוני ניתן להבחין באופן עקיף. בעיות פוטנציאליות: הנתיחה של הרשתית היא שלב קריטי: בעכבר, הרשתית נפרדת מעיינית בדרך כלל בין מגזרים חיצוניים קולטי האור ואפיתל הפיגמנט. לכן, המגזרים החיצוניים קולטי האור רגיש לאור של הרשתית המבודדת חשופים ורגישים מאוד לפגיעות מכאניות. יש לנקוט בזהירות רבה שלא לפגוע על ידי נגיעה בצד קולטי האור עם כלים או על ידי הזזת הרקמות הצידה על משטח דבק (למשל, קרום מסנן). יכולות להיות מוכרות פרוסות רשתית באיכות גבוהה מתחת למיקרוסקופ על ידי משטח החיתוך הנקי שלהם ובשכבת קולטי האור מאורגנת היטב עם מגזרים חיצוניים ברורים. הערכה תפקודית של איכות פרוסה יכולה להיעשות במהירות על ידי מהבהב גירויי אור בהירים וקביעת אחוז קונוסים תגובה (לדוגמא, בשדה ראייה עם 10 - 20 קונוסים). הנה, איכות תגובה צריכה להיות מוערכת על ידי חישוב יחס אות לרעש (S / N) (משרעת של רעש בסיס לפני גירוי האור לעומת משרעת של תגובת האור); S / N של 2 - 3 צריך להיחשב כסף המינימאלי. בדרך כלל, אנחנו זורקים פרוסות עם קונוסים מגיבים פחות מ -50%. פרוס גם עם קונוסים המציגים מוגזמת התנהגות spiking הספונטני (ראה איור 4 ב 10) אמור להיות מושלכת. פרוסות בחדר ההקלטה שעומדות בקריטריונים אנטומיים ותפקודיים האמורים להראות תגובות עקביות ל1 - שעה 2 (לפרטים על עקביות תגובה, ראה 10). בגלל פרוסות לשרוד במשך שעותשלנו בתא מחזיק, ניסוי מוצלח יכול להימשך עד 6 שעות. ראוי לציין כי יש כמה הגבלות ביחס לחקר אינטראקציות מרחבי ארוכים הנעות בין קונוסים ותאים אופקיים, כמו חיתוך בהכרח מנתקת קשרי רוחב ברשתות רשתית. עם זאת, הגדלת העובי של פרוסות רשתית 300 מיקרומטר קילה נושא זה 22. השימוש בפרוסות רשתית אנכיות מונעת סריקה של מגזרים חיצוניים קונוס רגיש לאור על ידי לייזר העירור, ולכן, במידה רבה, מונעת הלבנת opsin (לדיון נרחב, לראות 10,21). עם זאת, Ca 2 + האותות נרשמו תלויים לא רק בגירויי האור, אלא גם לקבל מושפע רכיב תאורת רקע שנוצר על ידי לייזר עירור סריקה. למעשה, תאורת הרקע היעילה בניסויי הדמיה שני פוטונים כזה הוא שילוב של אור הלייזר מפוזר, אור הניאון הנפלט על ידי CE נרשםLLS, וכל רכיב רקע גירוי LED. לכן, יש לאפשר קונוסים להתאים לפחות 20 - 30 של לסריקת לייזר (עם רכיב הרקע של גירוי האור מופעלים) לפני ההקלטה. יתרונות ויישומים: בעוד כמה בקשות לקונוס זה Ca 2 + פרוטוקול -imaging תוארו לעיל 10,21,22, ניתן חזו יישומים אחרים: מחקרים פרמקולוגיים בשילוב עם חרוט הדמיה Ca 2 + עשוי לאמת Ca 2 + מסלולי איתות בקונוסים ויכולים להיות משמש לבדיקת יעילות ועצמה של תרופות המכוונות לשחקנים שונים בCa 2 + -signaling 10. עם זאת, יישום עשוי להיות מפתח ללמוד מחלות המשפיעות על תפקוד קונוס. מודלים עכבר ניוון רשתית רבים מחקה מחלות אנושיות זמינים. לדוגמא, העכבר (1 cpfl) הפסד קולטי האור חרוט 1 הוא סבל מודל ניוון חרוט עיקריממוטציה Pde6c 29. לעומת זאת, עכבר ניוון מוט 1 (RD 1) סובל ממוטציה Pde6b. אמנם זה גורם לניוון מוט העיקרי קולטי האור 30, ברגע שאובדן מוט RD 1 הושלם, ערכות ניוון חרוט המשניות ב 1. הכלאת החיות האלה עם HR2.1: קו TN-XL יאפשר לימוד והשוואת 2 + Ca דינמיקה בשני הניוון החרוט הראשוני והמשני ועשוי לספק תובנות רבות ערך לתפקיד של Ca 2 + במוות של תאים חרוט. כמו כן, פרמקולוגית מושרה ניוון קונוס - למשל באמצעות מעכבי PDE6 סלקטיבית - יכול לשמש כדי לזהות את המנגנונים במורד הזרם של 10,29,31 ניוון חרוט. לסיכום, הפרוטוקול מתואר כאן מאפשר מדידת Ca 2 + בתאי subcellular של קולטני האור קונוס העכבר ומציגה הזדמנויות גדולות לחשוף פיזיולוגיה קונוס תחת מגוון רחבתנאים פיסיולוגיים וpathophysiological. בנוסף, פרוטוקול זה יכול לשמש להקרנה של סוכנים תרופתיים שנועדו להפריע ל-signaling קונוס Ca 2 + ובכך לסייע להקמת טיפולים חדשים למחלות קונוס.

חזון מתחיל בהפעלה מושרה האור של מפל phototransduction בקולטני אור ברשתית. קולטני אור רוד מאפשר ראייה ברמות אור נמוכות, ואילו קולטני אור קונוס לתווך חזון אור צבע ורזולוציה גבוהה. גני קולטי האור ספציפי רבים רגישים למוטציות המובילות לניוון של תאים אלה. מספר הסמנים מולקולריים הקשורים באובדן קולטי האור זוהה 1, אך עד כה המנגנונים מולקולריים מפורטים ורצף אירועים לא ברורים. הומאוסטזיס שינה Ca 2 + היה העריך להיות הדק של מוות של תאי קולטי האור, השערה נתמכת על ידי עד-הסדרת הפעילות של Ca 2 + פרוטאזות -dependent calpain-הסוג במהלך 2,3 תהליך הניוון. עם זאת, נכון להיום, השערה זו אינה מגובה במדידות פיסיולוגיות של Ca 2 +. חוסר עקביות במספר מחקרים על ההשפעה של חוסמי הערוץ 2 + Ca מחדשמחלות tinal תיגר נוספת על המעורבות של Ca 2 + בתא המוות 4-6, קורא לשיטות להעריך ישירות Ca 2 + בקולטני אור קונוס יונקים. בעבר, רוב ההקלטה החשמלית ובדיקות ההדמיה Ca 2 + בוצעו בדגמים דו-חיים וזוחלים בגלל הגישה קלה יותר לקונוסים 7-9. עם זאת, פיזיולוגיה קולטי האור יונקים עשויה להיות שונה מזה של הלא-יונקים 10 ובמיוחד, בהקשר של ניוון רשתית תורשתי אנושי, הבנה טובה יותר של פיזיולוגיה קולטי האור יונקים היא מפתח לפיתוח טיפולים חדשניים. מודלים של עכברים רבים מחקה מחלות רשתית אנושיות זמינים אך מעט מאוד ידוע על 2 + Ca דינמיקה בקונוסים עכבר 11. טכניקות חשמל אינן מתאימות להקלטות תפוקה גבוהה מאצטרובלים, בפרט לא בעכברים, שבו מוטות (~ 97%) במספרם באופן משמעותי קונוסים (~ 3%) 12 </sעד&gt;. יתר על כן, טכניקות אלקטרו רגישות כגון הקלטות תיקון מהדק כל התא להפריע הסביבה תאית ולספק נתונים על Ca 2 + זרמים אבל לא על Ca 2 + ריכוזים תאיים מוחלטים. לפיכך, על אף ההחלטה הזמנית הנמוכה, הדמיה היא שיטת הבחירה כאשר פונים שאלות על קונוס דינמיקת Ca 2 +. הנושא המרכזי בהדמיה הוא איך לתייג באופן סלקטיבי את הקונוסים עם צבע מחוון ניאון Ca 2 +. מידור מתאים וספציפיות תא הוא קשה להשגה על ידי &quot;בתפזורת טעינה&quot; סינטטי Ca 2 + צבעי מחוון לתוך הרקמה. כתוצאה מכך, קונוסים שכותרת, מוטות 13,14, ותאי גליה מולר לא יכולים להיות מהימן מכובדים. כמו כן, צבעים סינטטיים נוטים לדלוף החוצה של התאים, מונעים הקלטות ממושכות בתנאים עקביים. יתר על כן, טוענים Ca 2 + אינדיקטורים סינטטיים בצורת AM-אסתר הוא בעייתי, כפי שהוא דורש דהtergents (למשל, DMSO), ויוצר פורמלדהיד 15. לCa 2 + מדידות מוחלטות, מדדי ratiometric הם חובה. עם זאת, מדד ratiometric הסינתטי זמין כרגע הטוב ביותר הפורע-2 דורשים עירור אור בטווח של 700-760 ננומטר (עירור שני פוטונים), אשר, בהתאם לעוצמתה, יכולה בעצמו לעורר את הקונוסים, ובכך לעכב את הלימודים של קונוס Ca 2 + דינמיקה בתנאי תאורה פיסיולוגיות. בניגוד לצבעים סינטטיים, יכולים לבוא לידי ביטוי Ca 2 + אינדיקטורים גנטי מקודדים באופן סלקטיבי סוג תא. הם לא ידלפו החוצה של תאים, ולכן, אם ההלבנה הוא נמנע, מדידות ratiometric ממושכות ואמינות הן אפשריות. תא סוג סלקטיבי ביטוי של 2 + חיישני Ca, בשילוב עם שני פוטונים במיקרוסקופ, מייצג כלי רב עוצמה כדי להעריך וללמוד subcellular Ca 2 + במידה רבה בתנאים פיסיולוגיים 13,16,17 </sup&gt;. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ללמוד חרוט עורר גירוי אור Ca 2 + דינמיקה בקו מהונדס Ca 2 + עכבר biosensor (HR2.1: TN-XL), המבטא את בסיס סריג Ca 2 + biosensor TN-XL 18 באופן סלקטיבי בקונוסים, תחת HR2.1 אמרגן opsin האדום האנושי 19. כדי לגשת למסופי קונוס, הכנת פרוסה לשעבר vivo 20 הועסקה. הפרוטוקול כבר בהצלחה בשימוש בשלושה מחקרים על תפקוד חרוט בעכברים בריאים 10,21,22. יתר על כן, הפרוטוקול מאפשר לימוד Ca קונוס 2 + איתות תנאים גנטיים ספציפיים, למשל, על ידי הכלאת עכברי מודל לניוון רשתית תורשתי עם HR2.1: עכברי TN-XL.

<table><tbody><tr><td>גריז ואקום גבוה</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td><a href="http://www.dowcorning.com/">http://www.dowcorning.com</a></td></tr><tr><td>Cover החלקות</td><td>R. Langenbrinck</td><td></td><td>24 x 60 מ"מ; 

<a href="http://www.langenbrinck.com">http://www.langenbrinck.com</a></td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות</td><td>ר. לנגנברינק</td><td></td><td>76 x 26 מ"מ; 
<a href="http://www.langenbrinck.com">http://www.langenbrinck.com</a></td></tr><tr><td>להבים לקוצץ רקמות</td><td>MARTOR KG</td><td>ARGENTAX מס' 1044</td><td>0.25 מ"מ; 

<a href="http://www.martor.de">http://www.martor.de</a></td></tr><tr><td>קוצץ רקמות</td><td>בנייה</td><td></td> מותאמת אישית <td>מבוסס על עיצוב של F. Werblin23, מותאם על ידי T. Schubert</td></tr><tr><td>קרום מסנן ניטרוצלולוז מרושת</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>AABG01300 סוג מסנן: 0.8 &micro; m;

<a href="http://www.emdmillipore.com">http://www.emdmillipore.com</a></td></tr><tr><td>Isoflurane CP</td><td>CP pharma</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td><a href="http://www.cp-pharma.de/">http://www.cp-pharma.de</</td></tr><tr><td>a>UV/green LED ממריץ שדה מלא מבוסס LED</td><td>בנייה</td><td></td> מותאמת אישית <td>לפרטים, ראה10</td></tr><tr><td>לוח מיקרו-מעבד קוד פתוח</td><td>Arduino</td><td></td><td><a href="http://www.arduino.cc/">http://www.arduino.cc</a></td></tr><tr><td>Imaging תוכנת CfNT</td><td>Custom-written</td><td></td><td>שפותחה על ידי Michael M&uuml; ller, MPI למחקר רפואי, היידלברג, גרמניה</td></tr><tr><td>IgorPro</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td><a href="http://www.wavemetrics.com/">http://www.wavemetrics.com</a></td></tr><tr><td>VC3-4 מערכת זלוף מוקדי</td><td>ALA מכשיר מדעי</td><td></td><td>עם 100 &mu; סעפת קצה בקוטר m; 

<a href="http://www.alascience.com/">http://www.alascience.com/</a></td></tr><tr><td>Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td><a href="http://www.spectra-physics.com/">http://www.spectra-physics.com</a></td></tr><tr><td>Movable Objective microscope (MOM), עוצב על ידי W. Denk, MPImF, היידלברג, גרמניה</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td><a href="http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html">http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html</a></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>XLUMPlanFL 20X/0.95w objective</td><td>Olympus</td><td></td><td><a href="http://www.olympusamerica.com/">http://www.olympusamerica.com</a></td></tr><tr><td>Vaporizer 100 series</td><td>Surgivet</td><td></td><td><a href="http://www.surgivet.com/ ">http://www.surgivet.com</a></td></tr><tr><td>Ionomycin, מלח סידן</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>I24222</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/">https://www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101191250</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Leica MZ95</td><td>leica microsystems</td><td></td><td><a href="http://www.leica-microsystems.com/">http://www.leica-microsystems.com/</a></td></tr></tbody></table>

ההדמיה ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

קולטני אור ברשתית קונוס (קונוסים) משרת חזון אור יום והם הבסיס של אפליית צבע. הם כפופים לניוון, לעתים קרובות מובילים לעיוורון בהרבה מחלות רשתית. סידן (Ca 2 +), שליח שני מפתח באיתות קולטי האור וחילוף חומרים, הוצע להיות מקושר באופן עקיף עם ניוון קולטי האור במודלים של בעלי חיים שונים. באופן שיטתי לומד היבטים של הפיסיולוגיה קונוס אלה והפתופיזיולוגיה כבר הקשתה על ידי הקשיים של חשמל הקלטה מהתאים הקטנים אלה, בפרט בעכבר שבו הרשתית הוא נשלט על ידי קולטני אור מוט. כדי לעקוף בעיה זו, הקמנו Ca 2 + פרוטוקול הדמיה שני פוטונים באמצעות קו עכבר מהונדס המבטא את Ca 2 + biosensor TN-XL מקודדים גנטי באופן בלעדי בקונוסים וניתן כלאים עם מודלים עכבר לניוון קולטי האור. הפרוטוקול המתואר כאן כרוך בהכנת חלקים אנכיים (R20; פרוסות &quot;) של רשתית מעכברים והדמיה אופטית של שינויים עוררי גירוי אור ברמת 2 + Ca קונוס. הפרוטוקול מאפשר גם &quot;מדידה ב- פרוסה&quot; של Ca 2 + ריכוזים מוחלטים; כפי שניתן אחרי ההקלטות של כיול. פרוטוקול זה מאפשר לימודים למאפייני קונוס פונקציונליים וצפוי לתרום להבנה של חרוט Ca 2 + איתות כמו גם המעורבות האפשרית של Ca 2 + במוות קולטי האור וניוון רשתית.

על ידי שילוב של פרוסות אנכיות (איור 1) שהוכן מHR2.1: רשתית עכבר TN-XL עם הדמיה שני פוטונים (איור 2), שהיינו מסוגל לבצע מדידות ratiometric של 2 + אותות Ca-עורר גירוי אור בסופי האקסון קולטי האור קונוס . גישה זו מהווה שיפור משמעותי בגישה חזותי קונוסים עכבר מעל שיטות הדמיה אופטיות קיימות מראש עם Ca 2 + אינדיקטורים סינטטיים. לדוגמא, ביטוי קונוס הספציפי של Ca ratiometric גנטית המקודד 2 + biosensor TN-XL הקל באופן משמעותי את זיהוי של מסופי האקסון קונוס (ראה ROIs באיור 3 א). לכן, הפרוטוקול שלנו מבטל את הסיכון של אותות הקלטה ממקור לא ברור, כלאותות דוגמא &quot;מעורבים&quot; עם תרומות משני מסופי חרוט והאקסון המוט. הגישה שלנו מאפשרת פתרון תגובות חד-משפט ברמה של indiviמסוף האקסון חרוט כפול. חול אור עורר של Ca 2 + ממסוף חרוט מסומן על ידי עלייה וירידה בתורם acceptor הקרינה, בהתאמה (איור 3). ירידה בשיעור הקרינה (R) תואמת את החול של Ca 2 + ממסוף קונוס (איור 3 ג), הנגרם על ידי hyperpolarization מושרה האור של קונוס והסגירה הבאה של ערוצי Ca 2 + מתח מגודרת. מאחר שניתן לנטר כמה סופי האקסון חרוט בו-זמנית (איור 3 א), רכישת נתונים היא יעילה מאוד ומאות התגובות 2 + קונוס Ca ניתן לאסוף בניסוי יחיד. על ידי הערכת תגובות אלה כמותית (איור 4), ניתן להשוות קונוס אותות Ca 2 + ומוערך בטווח של תנאים (ראה דיון). זה הוא לעתים קרובות מספיק כדי להשתמש ביחס בין סריג-acceptor (סיטרין) ו-donor הקרינה (ECFP)(F / F D; לפרטים, ראה 3.4) כאמצעי יחסי של Ca 2 + הרמה תאית. ובכל זאת, בכל פעם שיש צורך, היחס יכול להיות מכויל כדי להשיג Ca 2 + ריכוזים תאיים מוחלטים ([Ca 2 +]) (איור 5). בתאורת רקע שימוש בפרוטוקול זה (לפרטים, ראה 10 ואיור 3 אגדה), כיול הניב אומדן למוחלט נח בHR2.1 [Ca 2 +] &quot;wild-type&quot;: מסופי TN-XL קונוס העכבר של 243 ± 159 ננומטר (ממוצע ± סטיית תקן), שנמצא בטווח שדווח לעכברים בספרות 11. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig1.jpg" /> איור 1. הכנת פרוסות רשתית אנכית. () מבודד ושטח רשתית מוכנה לחיתוך. (ב) חתיכה מלבנית של רשתית (יםEE תיבה אדומה ב) רכוב על קרום נייר סינון (אפור כהה) לאחר חיתוך. (ג) צפה לראש של פרוסת רשתית רכוב קרום הקבוע על coverslip זכוכית באמצעות גריז. (ד) ציור סכמטי של חלק מפרוסת רשתית (ראה תיבה אדומה בC). קולטני אור חרוט מצוין בירוק. V הגחון,; D, גב; N, האף; T, זמני; מערכת הפעלה, קטע חיצוני; ONL, שכבה חיצונית גרעינית; OPL, שכבה חיצונית plexiform; INL, שכבת גרעין פנימית; IPL, שכבת plexiform פנימית; GCL, שכבת תא גנגליון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig2.jpg" /> איור 2. שני פוטונים הדמיה של פרוסות רשתית: איור של תצורת ההקלטה למעלה:. עדשה אובייקטיבית מים טבילה התמקדות להיותבבוקר של לייזר הסריקה (חץ כלפי מטה אדום) לתוך הרשתית, ואיסוף הקרינה הנפלטת (חיצים כלפי מעלה). העדשה גם אוספת מועברת אור אינפרא אדום מLED תאורה רכוב מתחת למעבה כאשר הדמיה הפרוסה באמצעות מצלמת CCD מרכז:.. פרוסת רשתית רכובה בחדר ההקלטה וperfused עם פתרון תאי תחתונה: עדשת הקבל התמקדות האור מנוריות הגירוי (וLED אינפרא אדום עבור הדמיה מצלמת CCD) באמצעות התחתית השקופה של חדר ההקלטה לתוך רקמת הרשתית. IR LED, אינפרא אדום אור דיודה; CCD, מכשיר תשלום מצמידים; BP, להקה עוברת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig3.jpg" /> איור 3. אור-להעלות זכרונותתגובות 2 + D Ca במסופי האקסון של קולטני האור קונוס העכבר. (א) משמאל: הקלטות התמקדו במסופים הסינפטי (תיבה אדומה) של קולטני האור קונוס (ירוקה) בפרוסות רשתית ימנית:. דוגמא לאזור שהוקלט עם 7 מסופים בודדים. הקרינה נרשמה באמצעות שני ערוצים:. אחד לסיטרין סריג-acceptor (למעלה; 535 BP 50) ואחד לסריג-תורם ECFP (התחתון; 480 BP 32) (ב) שינויי אור עורר בסיטרין (F) וECFP הקרינה (F D) שנרשמה בהחזר על השקעה בודדת. התגובות (C) Ca 2 + (כיחס F / F D) של מסוף חרוט לסדרה של הבזקי אור בהירים 1 שניות במרווחים של 5 שניות. החזר על השקעה, אזור של עניין; BP, מסנן להקה עוברת; F, עוצמת הקרינה; au, יחידות שרירותיות; סריג, העברת אנרגיית תהודת פורסטר; ECFP, משופר חלבון פלואורסצנטי ציאן. עוצמת גירוי (כמו pשיעור hoto-isomerization ב 10 3 · P -1 לקונוס) · s:. 13.0 ו -12.8 לM- ו- S-opsins, בהתאמה, והוסיפו על רמת רקע (= נוריות כבויות, סריקת לייזר עירור) של ~ 10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig4.jpg" /> איור 4. ניתוח כמותי של מופת תגובות Ca 2 + קונוס האור עורר () Ca 2 + תגובות אור עורר (כΔR) ממסוף חרוט יחיד (ניסויים בודדים: עקבות אפורות, n = 16; ממוצע:. עקבות שחורות ) (פרמטרי B) שנקבעו לתגובה הממוצעת Ca 2 +:. מנוחה Ca (בסיס R רמת 2+) המייצג את הבסיס לפני גירוי אור, גודל התגובה כarEA-תחת-עקום (R) ומשרעת שיא (מגבר R), קינטיקה של תחילת תגובה (עליית t, מרווח זמן בין 20% ל 80% ממגבר R) וקיזז (ריקבון לא, מרווח זמן בין 80% 20% ממגבר R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig5.jpg" /> איור 5. הערכת ריכוז Ca 2 + מוחלט. ריכוז 2 + המנוחה Ca ([Ca 2 +], כיחס F / F D) נרשם במסופי האקסון 8 חרוט בעכבר TN-XL (חוגים, עם ממוצע ± סטיית תקן) לפתרונות שונים תאיים: פעמיים במדיום תאי סטנדרטי (Ctrl 1 ו -2), ולאחר מכן עם מינימאלי (&quot;אפס&quot;) [Ca 2 +] (10 מ&quot;מ EGTA)ד עם (מ&quot;מ 2.5) [Ca 2 +] גבוה, שני התנאים האחרונים בנוכחות 5 מיקרומטר ionomycin לאזן Ca התאי ו תאי 2 +. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר דינמיקת 2 + Ca במסופים האקסון של קולטני האור חרוט באמצעות הכנת פרוסה לשעבר vivo של רשתית העכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים מקיפים של איתות קונוס Ca 2 + במערכת מודל של יונקים חשוב, העכבר.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקליט אותות סידן המעוררים על ידי גירוי אור מהפוטורצפטורים מסוג קונוס (cone photoreceptors) ברשתית של עכבר באמצעות ביו-סנסור פלואורסצנטי. דבר זה מושג על ידי בידוד הרשתית מקו עכברים טרנסגני המבטא חיישן סידן מקודד גנטית באופן בלעדי בפוטורצפטורים מסוג קונוס. השלב השני הוא חיתוך פרוסות אנכיות של רקמת הרשתית.בשלב הבא, פרוסות הרשתינה מורכבות על לוחות כיסוי ומונחות תחת מיקרוסקופ פוטונים כפולים. השלב הסופי הוא הקלטת אותות סידן מהסיומות הסינפטיות הבודדות של פוטורצפטורי קונוס בתגובה לגירוי של אור. לבסוף, אותות הסידן שהוקלטו מנותחים באופן לא מקוון (offline).באמצעות שיטה זו, אנו יכולים להקליט את הפעילות של רספטורי תזונה רבים בתירס בו-זמנית ברזולוציה סוב-סלולרית. זהו היתרון המרכזי על פני טכניקות קיימות, כגון הקלטות חשמליות של תא בודד, שהן קשות יותר וגוזלות זמן רב יותר. לפיכך, השאלה שברצוננו לבחון היא האם וכיצד סידן מעורב בניוון של פטורצפטורים.שיטה זו מאפשרת לנו לקבוע אם זרימה פנימה של סידן היא זו שמניעה את דגנרציית הפוטורספטורים או שמא היא תוצאה של העובדה שהתא גוסס. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשרו בעיקר בשל הצורך לשמר את הרגישות של הרשתית לאור, ולכן יש לבצע את כל השלבים העדינים, כולל דיסקציה וחתך של הרשתית, תחת תאורה ירוקה או אדומה. כדי להתחיל בהליך זה, העבירו גלגל עין של עכבר לצלוחית פטרי המכילה תמיסה חוץ-תאית שחומצנה באמצעות פחמן דו-חמצני טרי.דקרו את גלגל העין בכל נקודה לאורך הגבול שבין הקרנית ללובן העין באמצעות מחט הזרקה חדה. לאחר מכן, אחזו את העין בחלק של לובן העין באמצעות פינצטה והחדירו בעדינות להב אחד של מספריים לתוך החור. גזרו לאורך ה-ora serrata כדי להפריד את החלק הקדמי של העין מגביע העין.לאחר מכן, חתוך את גביע העין באופן רדיאלי במיקום סימון העט המציין את המיקום הדורסלי ברשתית. לאחר מכן, מקם את גביע העין כך שהחתך הדורסלי פונה החוצה. אחז בסקלרה בצד שמאל ובצד ימין של גביע העין על ידי החדרת קצות הפינצטה בין הרשתית לסקלרה.לאחר מכן, נתקו את הרשתית על ידי היפוך עדין של חלק הסקלרה (luteal part) של ה-iica. לבסוף, חתכו את העצב האופטי כדי לשחרר את הרשתית מהסקלרה. החזיקו את קצה הרשתית בעזרת פינצטה והסירו בעדינות שאריות וגוף זגוגית מפני השטח של הרשתית באמצעות זוג פינצטות שני.כאשר פני השטח של הרשתית נקיים, בצעו שלושה חתכים רדיאליים קצרים נוספים. כעת טבלו באיטיות זכוכית כיסוי לתוך התמיסה החוץ-תאית בסמיכות לרקמה. משכו בעדינות את הרשתית אל על זכוכית הכיסוי כאשר הצד של תאי הגנגליון פונה כלפי מעלה, על ידי תפיסת הקצה, כדי לצמצם נזק מכני וקיפול של הרקמה.בשלב הבא, גזרו מלבן של כ-1 על ידי 2 מילימטרים מאזור הרשתית שנבחר באמצעות להב סקאלפל מעוקל ונגבו תמיסה עודפת מסביב לרקמה. לאחר מכן, הניחו את ממברנת סיבי הניטרוסלולוז שהוכנה מראש מעל פיסת הרשתית, כך שצד תאי הגנגליונים ייצמד לממברנה. הוסיפו מיד טיפה של מצע חוץ-תאי (extracellular medium) על הממברנה כדי להצמיד את הרקמה אליה בצורה חזקה.העבירו את רקמת הרשתית המעוגנת לממברנה אל תא החיתוך המכיל תמיסה חוץ-תאית טרייה. לאחר מכן, חתכו את הרשתית לפרוסות אנכיות בעובי 200 micrometer. באמצעות קוצץ רקמות, הדביקו פרוסה אחת המעוגנת לממברנה לזכוכית כיסוי שהוכנה מראש עם גריז ואקום גבוה.שמרו על פני השטח של הזכוכית מתחת לרשתית נקיים משומן. לאחר מכן, הוסיפו טיפה של תמיסה חוץ-תאית לכל פרוסה המותקנת על לבידה בתא ההחזקה בטמפרטורת החדר. הכניסו קרבוגן לתא על ידי ביבוע של מאגר מים קטן כדי לשמור על האטמוספירה בתא ההחזקה רטובה.הניחו לפרוסות לנוח בתא ההמתנה למשך 10 עד 15 דקות לפני העברתן אחת אחת לתא ההקלטה. העבירו פרוסה מתא ההמתנה לתא ההקלטה והתחילו מיד בביצוע פרפוזיה באמצעות תמיסה חוץ-תאית מוגזת. שמרו על קצב זרימה של הפרפוזיה של 2 mL לדקה ועל טמפרטורה של 37 °C.בתא ההקלטה. השתמש בעדשת שיקוע במים 20 x 0.95 NA ובמצלמת CCD בשילוב עם LED באינפרא-אדום מתחת לתא ההקלטה. כדי לאתר את פרוסת הרשתית, הפעל את מערכת הדימות הדו-פוטונית בהתאם להנחיות היצרן.בשלב הבא, הדליקו את הלייזר והגדירו אותו ל-860 nanometers. הפעילו את שני ערוצי הזיהוי לדימות פלואורסצנציה של ECFP ו-citrine. לאחר מכן, באמצעות תוכנת רכישת התמונות, הפעילו את מיקרוסקופ הפוטונים הכפולים כדי לסרוק ולבחור שורה של קצות קונוסים (cone terminals) להקלטה; הגדירו את רכישת התמונות לתמונות של 128 על 16 pixels או תצורה דומה, והגבילו את אזור הסריקה לקצות הקונוסים כדי למנוע הלבנה (bleaching) של פוטו-פיגמנטים במקטעים החיצוניים.הפעל את הלייזר. אפשר למסלולים (cones) להסתגל ללייזר הסריקה ולאור הרקע של הגירוי במשך 20 עד 30 שניות לפני הצגת גירויי אור או יישום של חומרים פרמקולוגיים. כעת התחל בהצגת הגירויים השרירותיים.הגירויים נוצרים על ידי מודולציה של עוצמת שתי נורות ה-LED לאורך זמן, באמצעות לוח מיקרו-מעבד הנשלט על ידי תוכנה מותאמת אישית. לאחר מכן, התחל בהקלטה של שני ערוצי הפלואורסצנציה בו-זמנית באמצעות תוכנת רכישת התמונות המתאימה. ההקלטות התמקדו בסיומות הסינפטיות של פוטורצפטורים מסוג קונוס (cone photoreceptors) בחתכי רשתית.זוהי דוגמה לאזור שהוקלט עם שבעה טרמינלים בודדים. הפלורסצנציה הוקלטה באמצעות שני ערוצים, אחד עבור ה-fre scepter citrine, ואחד עבור ה-fret donor.ECFP. מוצגים כאן שינויים בעוצמת הפלורסצנציה של citrine ו-ECFP שעוררו באמצעות אור והוקלטו באזור עניין (region of interest) בודד.וכאן מוצגות תגובות הסידן של קצה קונוס לסדרה של הבזקי אור בהיר למשך שנייה אחת במרווחים של חמש שניות. איור זה מציג ניתוח כמותי לדוגמה של תגובות סידן בקונוס המעוררות על ידי אור. וכאן מוצגות תגובות הסידן המעוררות על ידי אור מקצה קונוס בודד.איור זה מציג את קביעת תגובת הסידן הממוצעת. רמת הסידן במצב מנוחה מייצגת את קו הבסיס לפני גירוי באור, וגודל התגובה הוא ra, שהוא השטח שבין רמת הסידן במצב מנוחה לבין אמפליטודת השיא, ובין הקינטיקה של תחילת התגובה לסיומה. ניתן להרחיב הליך זה עוד יותר.לדוגמה, אותיות סידן בתאי פוטורספטורים עשויות להיות משמעותיות תחת תנאי גרייה רחבים ותנאים פרמקולוגיים מגוונים לצורך חקירה, כגון אדפטציה או לימוד מפורט של שלבים שונים בתהליך הפוטוטרנסדוקציה. טכניקה זו מאפשרת לחקור את דינמיקת הסידן בתאי פוטורספטורים מסוג קונוס תחת תנאים פיזיולוגיים נורמליים. דבר זה רלוונטי במיוחד להבנת דגנרציה ראשונית ושניונית של פוטורספטורים מסוג קונוס במחלות עיוורון אנושיות כגון acro topia או retinitis pigmentosa.

imaging-ca2-dynamics-cone-photoreceptor-axon-terminals-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנחנו נראה איך להקליט תגובות פלאש מן קונוסים עכבר בודד באמצעות אלקטרודה יניקה.

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית של transretinal electroretinogram (ERG) הקלטות להשגת photoresponses מוט חרוט מן הרשתית העכבר ללא פגע. גישה זו מנצלת את הבלוק של הולכה סינפטית מ photoreceptors לבודד תגובות אור שלהם ולהקליט אותם באמצעות אלקטרודות המונחות על פני שטח הרשתית שטוח רכוב מבודד.

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

מקור: Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina.  J. Vis. Exp. (2021). סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית רשתית in vivo באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני. עכברים מורדמים מוכנים להדמיה על ידי אבטחת ראשם, מריחת חומר סיכה לעיניים והנחת כיסוי על העין. תאי גנגליון רשתית (RGCs) המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים מוצגים לראשונה באמצעות אפיפלואורסצנציה ליישור. לבסוף, נעשה שימוש בהדמיה דו-פוטונית, המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של RGCs.

הדמיית שני פוטונים in vivo של רשתית העכבר

מקור: Kulkarni, M. et al. הדמיה Ca2+ דינמיקה במסופי אקסון קולטני אור חרוטים של רשתית העכבר. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ דו-פוטוני לניטור דינמיקת סידן בקולטני אור חרוטים של רשתית עכבר טרנסגנית. הוא מתאר את השלבים להכנת פרוסות רשתית, הדמיית חיישני סידן מבוססי FRET וניתוח שינויים פלואורסצנטיים כדי לכמת את רמות הסידן תחת תאורת רקע וגירוי אור.

מיקרוסקופיה דו-פוטונית לניטור דינמיקת סידן בקולטני אור של חרוט רשתית עכבר

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר באמצעות מיקרוסקופ פוטונים שני פוטונים in vivo בקו טרנסגני Thy1-GFP. גישה זו משולבת עם הזרקת נגיף הקשור לאדנו המבטא mCherry לתוך ההיפוקמפוס הגבי. טכניקות אלו מאפשרות ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

פרוטוקול זה מתאר איך ברזולוציה גבוהה טכניקות הדמיה כגון טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי, סריקת לייזר ophthalmoscopy יכול להיות מנוצל מכרסמים קטנים, באמצעות מערכת פלטפורמה אופטלמולוגיות הדמיה, כדי לקבל מידע על עובי רשתית, microglial תא הפצה, בהתאמה.

אין ויוו הדמיה של עכברים כתב Cx3cr1gfp/gfp עם תחומים הספקטרום טומוגרפיה אופטית קוהרנטית, סריקת לייזר Ophthalmoscopy

הדמיית in vivo היא כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה מתאר הדמיה טרנס-אימונית של רשתית העכבר באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי של שני פוטונים. הוא גם מדגים שיטות שונות של הדמיה חיה כדי לתייג פלואורסצנטיות קבוצות תאים מרובות של הרשתית.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר יצירת חלון גולגולתי גדול (6 x 3 מ"מ2) באמצעות עטיפת מזון, סיליקון שקוף וזכוכית כיסוי. חלון גולגולתי זה מאפשר ניסויים בהדמיית סידן בשדה רחב ובשני פוטונים באותו עכבר.

אין ויוו הדמיית סידן בשדה רחב ושני פוטונים מעכבר באמצעות חלון גולגולתי גדול

פרוטוקול זה מפרט את ההליך לדימות תגובות סידן בקוליקולוס העליון (SC) של עכברים ערים, כולל הדמיה של פעילות נוירון יחיד במיקרוסקופ של שני פוטונים תוך השארת קליפת המוח שלמה בעכברי בר, והדמיית ה-SC כולו במיקרוסקופ רחב שדה בעכברים מוטנטיים בעלי קליפת מוח חלקית.

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

מחקר זה מציג גישת הדמיה דו-פוטונית ב-in vivo להמחשת המבנים של טרמינלי אקסון בעלי סף נמוך (LTMR) בעור כף הרגל הקדמית של עכברים. באמצעות דימות חוזר ברזולוציה גבוהה של אקסונים בודדים, שיטה זו מספקת פלטפורמה חדשה לחקר מבנה ותפקוד המעגל החישי העור במהלך ההתפתחות ובמבוגרים.

הדמיה תוך-חיונית של שני פוטונים של מורפולוגיית אקסון חושי במגע בעור עכבר

למדו לרשום דינמיקת סידן בסופי קונים של רשתית עכבר באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים. שיטה זו מאפשרת מחקר מקיף של תאי עצב ברזולוציה תת-תאית.

ההדמיה Ca

גלה סרטונים נוספים