Name: ויזואליזציה של Streptococcus pneumoniae בתוך Microlesions הלב וRemodeling לב לאחר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: חקור היווצרות מיקרו-פצעים לבביים בעכברים נגועים ב-Streptococcus pneumoniae באמצעות טכניקות צביעה מיקרוסקופיות. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של פגיעה לבבית ושיקום לאחר זיהום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק 13IRG14560023 מאיגוד הלב האמריקאי ומענקי NIH AI078972 ו-HL108054 ל-CJO. התמיכה ב-AOB הייתה מהמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום של NIH, NIH ULTR001120 ו-F31 A110417701.

הערה: כל ניסויי העכבר היו נבדקו ואושרו על ידי בעלי החיים המוסדיים הטיפול ושימוש בועדות אוניברסיטת טקסס למדעי בריאות המרכז בסן אנטוניו (# 13032-34-01C פרוטוקול). טיפול בבעלי חיים ופרוטוקולי ניסוי דבקו משפט ציבורי 89-544 (צער בעלי החיים Act), על תיקוניו, הנחיות שירותי בריאות ציבוריות, והמדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (ארה&quot;ב המחלקה לשירותי בריאות ואדם). 1. זיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג עכברי BALB / c משני המינים בין גילאי 10-12 שבועות של גיל. הערה: ס זן pneumoniae זן 4 TIGR4 הוא לבודד קליני ארסי שכבר רצף 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול TIGR4 במרק טוד יואיט על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 עד שמגיע צפיפות אופטית (OD) 620 של 0.5 (המקביל ל 1.0 x 10 8 יחידות מושבה להרכיב מיליליטר / [CFU]). גלולה תרבות דלקת הריאות על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 3, XG 500 ולהסיר את supernatant באמצעות קו ואקום. להשעות ולדלל חיידקים עם תמיסת מלח סטרילית פוספט שנאגרו (PBS) לריכוז סופי של 1.0 x 10 4 CFU / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בחדר אינדוקציה, להרדים עכברים עם 2.5% isoflurane מתאדה בחמצן. אשר מדינה בהרדמה על ידי קמצוץ הבוהן עדין עם פינצטה הבוטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את העכבר בהרדמה בעורף וזקוף עם יד אחת, להזריק כל עכבר intraperitoneally (IP) עם ש &#39;100 μl ההשעיה pneumoniae באמצעות מזרק עם מחט 27-30 מד (המקביל למינון אתגר של 1.0 x 10 3 CFU). הנח את גב העכבר בכלוב שלה. עכברים בדרך כלל מתעוררים 30-40 שניות לאחר הזרקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר הזיהום להמשיך לפחות 24 (מוקדמת) או 30 שעות (מתקדמות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים על ידי CO 2 מחנק. בצע נקע בצוואר הרחם על מנת להבטיח עכבר נפטר. המתת חסד הוא אישור נוסף על ידי ההסרהשל הלב בשלב 1.6. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את הזנב עם ספוגית אלכוהול ולגזור סעיף 2-3 מ&quot;מ. אסוף 2 μl דם וסדרתי לדלל את הדם של פי 10 בPBS המכיל הפרין סודיום 1 פעמים U / ml חמש. דילולים צלחת סידוריים על צלחת אגר דם סויה tryptic דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. להסיק למחרת ממושבה סופר את הרמה של בקטרמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשתק את העכבר במצב שכיבה על פלטפורמה כירורגית. תרסיס החזה עם 70% אתנול ומייבשים. בעזרת מספריים ומלקחיים כירורגיים לפתוח את חלל החזה, להסיר את כלוב הצלעות, ותחצה את הסרעפת כדי לחשוף את הלב וריאות. מספריים באמצעות לחתוך את כלי הדם קשורים ללב ולעדינות בלו הלב בזהירות כדי למנוע שטפי דם עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הלב עם PBS ולאחר מכן למקם לקלטות אוסף דגימת רקמה כך שסעיפי העטרה היו מתקבלים בחתך רקמה. להטבעת פרפין, PLACe הקלטות ב 10% פתרון שנאגר פורמלין ולמחרת לשלוח להטבעת פרפין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין הקפאת הבזק באמצעות מתחם אוקטובר בתוך cryomold שהושם על קרח יבש. </li></ol></li></ol> 2. ויזואליזציה של פצעים לב וPneumococci בתוך נגעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמצם את חלקי לב-מוטבע פרפין כך ש4 חדרי הלב גלויים בכל קטע רקמה. חותך שקופיות בעובי של 5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות Deparaffinize וכתם עם hematoxylin וeosin (H &amp; E) תוך שימוש בשיטות סטנדרטית 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה בH &amp; E מוכתמת חלקי לב באמצעות מיקרוסקופ אור בנמוך (100X, 200X) ו- (טבילת שמן: 400X, 1,000X) גבוהה בהגדלה. לאפיין את לב לנוכחות של microlesions בשריר הלב. כאן, לרכוש תמונות H &amp; E באמצעות מיקרוסקופ 2 Zeiss Axioskop מצויד במטרת הצמצם 1.3 Plan-NEOFLUAR מספרית 100X. הערה: בשלבים המוקדמים l לבesions מופלה על ידי הופעת ההפרש שלהם בצבע ובמקרים מסוימים הנוכחות של תאי מערכת חיסון (מונוציטים וגרנולוציטים) מה שנראים כמונוציטים. בנגעים מתקדמים, במיוחד אלה ראו בשעה 30, תאי מערכת חיסון הם נגעים כמו vacuole-נעדרו וגדולים הם נצפו במקום שלהם. חשוב לציין כי בעוד שזרם תא חיסון בשלבים המוקדמים של התפתחות נגע לב השלבים יכול להתרחש זה לא נראה דרישה. </li></ol> 3. Immunofluorescent מיקרוסקופי Pneumococci בתוך Microlesions <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לב סעיף בcryomolds עם microtome בעובי של 5 חלקי מיקרומטר ומקום על גבי שקופיות זכוכית טעונות חיובי. לאפשר סעיפי לב קפוא להפשיר ואוויר יבש. לתקן סעיפים במשך 10 דקות ב 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין (pH 6.8-7.2 של 25 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות (3x) בPBS במשך 5 דקות, permeabilize במשך 15 דקות ב0.2% Triton X-100 ב PBS, ולאחר מכן לשטוף שוב בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> secti רקמת בלוק<html> בשקופיות עם סרום עיזים 10% ב- PBS במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את שקופיות עם PBS, מכסים ודגירת סעיפי לב עם ארנב נגד זן 4 antiserum pneumococcus ב 1: 1000 ב- PBS עם סרום עיזים 10% לשעה 2 ב 37 ° C. הערה: לבקרות שליליות חוקרים צריכים להשתמש antiserum ארנב הנאיבי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה עם PBS, מכסים ודגירה קטעים עם עז 10% בסרום-PBS עם נוגדן מצומדות FITC נגד ארנב עז בשעה 1: 2,000 למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות ההוראה של היצרן, השתמש DAPI (4 &#39;, 6 Diamidino-2-Phenylindole) בשעה 5 מ&quot;ג / מיליליטר להדמיה של גרעינים אוקריוטים. לשטוף והר סעיפי רקמות עם FluorSave. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות ניאון באמצעות מערכת מיקרוסקופ confocal בהגדלה שניהם נמוכה וגבוהה. התאם את מספרי הצמצם בהתאם כדי להשיג תוצאות אופטימליות. כאן, לרכוש תמונות ניאון באמצעות מערכת confocal עם מטרת צמצם מספרית 60x 1.42. </li></ol>&quot;&gt; 4. אנטיביוטי הצלה של עכברים ספיגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתחיל עם ip הנגוע עכברים עם 1.0 x 10 3 CFU של TIGR4 כפי שצוין קודם לכן בשלב 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מהשעה 30 לאחר פגיעת שעות, לנהל ip אמפיצילין הכיתה תרופות (80 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף) ב100 מלוח μl כל 12 שעות במשך 36 שעות. לאסוף לבבות בנקודת הזמן הרצוי והתהליך כמתואר בשלב 1.6 להטבעת פרפין ורקמה, חתך. </li></ol> 5. קולגן הפקדת איתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בקסילן ושוטף אלכוהול מדורג עם קטעי מים, deparaffinize ורקמת מימה deionized תוך שימוש בשיטות סטנדרטית 17. פנק את החלקים עם 0.2% חומצת phosphomolybdic מימית במשך 5 דקות ולשטוף עם מים deionized במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי כתם עם 0.1% אדומים סיריוס בחומצה picric לשעה 2 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים ב0.01 N חומצה הידרוכלורית במשך 3 דקות ולשטוף באמצעות אתנול 70% דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dehydrate החלקים באמצעות זהה אך הפוך סדר שוטף שלהותווה ב5.1, ליבש חלקי לב בהגדלת ומדורגים ריכוזי אתנול אז קסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי רקמות הר עם פתרון הרכבה להערכה מיקרוסקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות אזורים של בתצהיר קולגן, לבחון קטעי רקמה צבעוניים לאזורים של מכתים קריאה עמוק בהגדלה נמוכה וגבוהה באמצעות מיקרוסקופ אור. אזור כלשהו בתוך חדרי הלב של הלב שהוא אדום הוא אזור שבו קולגן הופקד. אזורים ללא הכתם האדום הזה הם אתרים של רקמה בריאה החסרים בתצהיר קולגן. במסמך זה, לרכוש Picro סיריוס אדום תמונות מוכתמות באמצעות מיקרוסקופ מצויד מטרת צמצם מספרית 20X 0.5. הערה: הכתמים האדומים אטריום ברקמות בריאות. </li></ol>

<ol><li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia%3A+incidence%2C+timing%2C+risk+factors%2C+and+association+with+short-term+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality.</a> Circulation. 125, 773-781 (2012).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+bacterial+pneumonia+is+associated+with+the+occurrence+of+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes.</a> Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: a systematic review and meta-analysis of observational studies.</a> PLoS Med. 8, e1001048(2011).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+stratification+for+cardiac+complications+in+patients+hospitalized+for+community-acquired+pneumonia.+Mayo+Clin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc%22%5BJournal%5D)">Risk stratification for cardiac complications in patients hospitalized for community-acquired pneumonia. Mayo Clin.</a> Proc. 89, 60-68 (2014).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+11+common+viral+and+bacterial+pathogens+causing+community-acquired+pneumonia+or+sepsis+in+asymptomatic+patients+by+using+a+multiplex+reverse+transcription-PCR+assay+with+manual+%28enzyme+hybridization%29+or+automated+%28electronic+microarray%29+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection.</a> Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).</li>
<li>Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+pneumococcal+pneumonia+and+acute+cardiac+events%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The association between pneumococcal pneumonia and acute cardiac events.</a> Clin Infect Dis. 45, 158-165 (2007).</li>
<li>Brown, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+translocates+into+the+myocardium+and+forms+unique+microlesions+that+disrupt+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae translocates into the myocardium and forms unique microlesions that disrupt cardiac function.</a> PLoS Pathogens. In press, (2014).</li>
<li>Orihuela, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+receptor+initiates+bacterial+contact+with+the+blood+brain+barrier+in+experimental+meningitis+models%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).</li>
<li>Flick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+elimination+of+the+binding+motif+on+fibrinogen+for+the+S.+aureus+virulence+factor+ClfA+improves+host+survival+in+septicemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia.</a> Blood. 121, 1783-1794 (2013).</li>
<li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+play+in+four+acts%3A+Staphylococcus+aureus+abscess+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19, 225-232 (2011).</li>
<li>Arenal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+the+spatial+characteristics+of+myocardial+scar+tissue+determine+the+risk+of+ventricular+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Do the spatial characteristics of myocardial scar tissue determine the risk of ventricular arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 94, 324-332 (2012).</li>
<li>Deneke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+histopathology+of+electroanatomic+mapping+after+cooled-tip+radiofrequency+ablation+to+treat+ventricular+tachycardia+in+remote+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Human histopathology of electroanatomic mapping after cooled-tip radiofrequency ablation to treat ventricular tachycardia in remote myocardial infarction.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 1246-1251 (2005).</li>
<li>Bakker, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reentry+as+a+cause+of+ventricular+tachycardia+in+patients+with+chronic+ischemic+heart+disease%3A+electrophysiologic+and+anatomic+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation.</a> Circulation. 77, 589-606 (1988).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+successful+ablation+sites+and+the+scar+border+zone+defined+by+substrate+mapping+for+ventricular+tachycardia+post-myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).</li>
<li>Wu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+risk+for+ventricular+tachyarrhythmias+and+sudden+cardiac+death%3A+is+there+a+role+for+cardiac+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI.</a> Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).</li>
<li>Tettelin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+a+virulent+isolate+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae.</a> Science. 293, 498-506 (2001).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים במחקר זה.

בדוח זה, שיטה לשחזור מאוד כדי לגרום לS. pneumoniae תיווך microlesions לב בעכברים במהלך IPD והטכניקות להדמיה שלהם באו לידי ביטוי. עכברים נגועים במינון של חיידקים שעולה סף של המערכת החיסונית לקבלת אישור, שמוביל לבקטרמיה בדרגה גבוהה, דומה לזו המתרחשת במהלך אלח דם אדם, ומוביל לטרנסלוקציה חיידק לשריר הלב. מסיבות שעדיין לא ידועות, S. pneumoniae בלב הוא מסוגל לשכפל לא נרתע מהתגובה החיסונית המארח. זה הוא הנושא של חקירה מתמשכת ופרסום זה עשוי להקל על חוקרים אחרים במאמציהם ...

אשפוז של מבוגרים לנרכשו בקהילת דלקת ריאות (CAP) נושא סיכונים מתועדים לאירועים לבביים שליליים שתורמים לתמותה 1-4. במחקר שנערך לאחרונה על ידי אל-המדינה קוראלס et. סיבוכים לבביים נמצאו להיות קשורים ו / או אחראי למותם של 27% הקשורים לדלקת ריאות 3. Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), הגורם השכיח ביותר של CAP ואלח דם 5, נקשר ישירות עם אירועים לבביים שליליים בכמה ש-19% מהחולים מבוגרים הודה 6. אירועים לבביים חמורים הקשורים לדלקת ריאות כוללים כישלון חדש או הורע ספיקת לב, הפרעות קצב, ואוטם שריר לב כדי להקטין תדירות של 6. במאמר פתוגנים PLoS האחרון על ידי אל בראון ואח., S. pneumoniae נמצא מסוגל טרנסלוקציה דרך האנדותל של כלי דם של הלב, הכניסה לmyocardiuמ &#39;, והיווצרותם של הנגעים דיסקרטיים שאינם מוגלתיים מיקרוסקופיים (microlesions) מלאים בחיידקים בחדרי הלב במהלך מחלה פולשנית דלקת ריאות (IPD) 7. עדות להיווצרות microlesion לב נצפתה בדגימות לב מפרימטים שאינם בני אדם ואנשים שנכנעו לזיהום דלקת ריאות. כמו כן, עכברים נגועים בניסוי reproducibly פיתחו microlesions לב. בעכברים, גודל microlesion ומספר היה מתואם חיובי עם המשך והחומרה של בקטרמיה, רמות טרופונין הלבבי בסרום, וelectrophysiology לב חריג. טרנסלוקציה חיידקים ללב נמצאה להתרחש דרך אותם המנגנונים אחראים לטרנסלוקציה של pneumococcus פני מחסום דם-המוח וההתפתחות של דלקת קרום מוח דלקת ריאות, כלומר הפלישה, חלבון קושר כולין בתיווך של תאי האנדותל של כלי דם בקולט Laminin וטסיות דם אופן תלוי הקולטן לגורם -activating 8. Microlesהיווצרות היון נדרשה גם pneumolysin רעלן דלקת ריאות יוצרים הנקבובית שנמצא להרוג cardiomyocytes 7. microlesions לב דלקת ריאות נבדלים ממוגלתיות רקמות רכות ומורסות לב שנגרמות על ידי חיידקים גראם-חיובי אחרים, כולל Staphylococcus aureus. אלו מאופיינים במוקדים בודדים של חיידקים מוקפים נויטרופילים ו9,10 תצהיר הפיברין. Microlesions שהוקם על ידי ס &#39; pneumoniae הם קטנים בגודל, בפריסה לב מושפע, וחסר מחלחל תא חיסון. בשלבים המוקדמים של זיהום השלבים, microlesions נגרמים על ידי ס &#39; pneumoniae מופיע כאזורי של רקמה פגועה או מודלקת מזכירה את הסימנים פתולוגיים של cardiomyopathy. מונוציטים מסוימים עשויים להיות שנצפו בתקופה זו, אך נוכחותם היא קצרה מועד ונגעים הפכו במהירות נימקי במראה ומלא בחיידקים ובמקביל ממשיך משויףow בגודל עד מותו של בעלי החיים או התערבות מיקרוביאלית. חשוב לציין, בתוך 3 ימים של התערבות אנטיביוטיקה, חדירת תאי מערכת חיסון פזרני הוא ציין באתר הנגע לשעבר וזה מלווה בתצהיר קולגן חזק. שיפוץ לב דומה דווח להתרחש בעקבות אוטם יחד עם השלכות ארוכות טווח על תפקוד לב 11-15. לפיכך, microlesions מהווה הסבר אפשרי לאירועים הלבביים השלילי המתרחשים במהלך IPD ואולי השכיחות המוגברת של תמותה הקשורה ללב באנשי הבראה ששרדו את פרק המחלה. במסמך זה, הוראה מסופקת על מודל העכבר הניסיוני של IPD והיווצרות נגע לב ויזואליזציה של microlesions לב בזיהום המוקדם ומאוחר שלבים. הפרוטוקול לזיהוי של תצהיר קולגן בבעלי חיים שנשמרו על ידי התערבות מיקרוביאלית הפגין. המטרה של מאמר זה היא facilitate המחקר של חוקרים אחרים על פתולוגיה דלקת ריאות החשובה והרומן הזה.

<table><tbody><tr><td>מרק טוד-יואיט&nbsp;</td><td>תרכובת ניאוגן</td><td>7161A</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T&NBSP;</td><td>טישו-טק (סאקורה פינטק)&nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק (Acros)</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-סרוטיפ 4 פנאומוקוקוס אנטיסרום&nbsp;</td><td>Statens Serum Institut</td><td>16747</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב FITC נוגדן מצומד&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-096-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsave</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70104</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פוספומוליבדית 0.2%&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>26357-01</td><td></td></tr><tr><td>0.1% סיריוס אדום בחומצה פיקרית&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>26357-02</td><td></td></tr><tr><td>0.01 N חומצה הידרוכלורית&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>26357-03</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ רקמות שקופיות</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>משחה וטרינרית פרלובה</td><td>Dechra</td><td>12920060</td><td></td></tr><tr><td>ערכת צביעת המטוקסילין ואאוזין</td><td>לא מוגדרת&nbsp;</td><td></td><td>תקן</td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של<em&gt; streptococcus pneumoniae</em&gt; בתוך microlesions הלב וremodeling לב לאחר

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

במהלך בקטרמיה Streptococcus pneumoniae יכול translocate פני האנדותל של כלי הדם לשריר הלב ויוצר פגיעות מלאות חיידקים דיסקרטיים מיקרוסקופיות (microlesions) כי הם ראויים לציון בשל היעדר חדירת תאי מערכת חיסון. בשל שחרורם של מוצרי cardiotoxic, S. pneumoniae בתוך microlesions הם חשבו לתרום לאי ספיקת הלב שלעתים קרובות נצפתה במהלך המחלה דלקת ריאות פולשנית רועמת במבוגרים. מסמך זה בא לידי ביטוי בפרוטוקול לזיהום עכבר ניסיוני שמוביל להיווצרות לשחזור microlesion לב בתוך 30 שעות. הדרכה ניתנת על זיהוי microlesion בhematoxylin &amp; Eosin חלקי לב מוכתמים והבחנות מורפולוגיות בין microlesions המוקדם והמאוחר מודגשים. הדרכה ניתנת על פרוטוקול לאימות של ס &#39; pneumoniae בתוך microlesions באמצעות נוגדנים נגד פוליסכריד קופסית דלקת ריאות ומיקרוסקופיה immunofluorescent. אחרון, פרוטוקול להתערבות אנטיביוטי שמציל עכברים נגועים ולזיהוי וההערכה של היווצרות צלקת בלבם של עכברי הבראה מסופק. יחד, פרוטוקולים אלה יקלו על החקירה של המנגנונים המולקולריים שבבסיס פלישת דלקת ריאות לב, מות cardiomyocyte, שיפוץ לב כתוצאה מחשיפה לS. pneumoniae, ואת התגובה החיסונית לpneumococci בלב.

ויזואליזציה של Microlesions על ידי H &amp; E microlesions לב נצפה בחדרי הלב של H &amp; E המוכתמות חלקי לב מעכברים עם IPD הבא אתגר ה- IP שלהם עם TIGR4. איור 1 מדגימה את העלייה בגודל של נגעים אלה בין פוסט-זיהום 24 ו -30 שעות (HPI), עם מספר גדול יותר של hematoxylin pneumococci -stained (כחול-סגול כלומר,) גלוי בתוך הנגע. Microlesions התאפיינו במורפולוגיה כמו vacuole-, צפוף eosin (אד...

Streptococcus pneumoniae יוצר נגעים מיקרוסקופיים נפרדים שאינם מוגלתיים בלב. מתואר הפרוטוקול למודל עכברי של היווצרות מיקרו-נגעים לבביים. ניתנת הדרכה על הדמיית מיקרו-נגעים באמצעות מיקרוסקופיה, הבחנה בין מיקרו-נגעים מוקדמים ומאוחרים, ושיטות לאיתור שיפוץ לב בלבבות של בעלי חיים מחלימים.

ויזואליזציה של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; בתוך Microlesions הלב וRemodeling לב לאחר

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים פרוטוקול הניתן לשחזור ליצירת מיקרו-נגעים לבביים של ESMO בתוך לבם של עכברים מזוהמים. דבר זה מושג על ידי הדבקת עכברים ב-ESMO ומתן אפשרות להתפתחות בקטרימיה, ובכך מתאפשר לבקטריות גישה לכלי הדם של הלב, שם הן יכולות לפלוש לשריר הלב (myocardium) וליצור נגעים מיקרוסקופיים. לאחר מכן, הלבבות מוטמעים בפרפין ונצבעים באופן קונבנציונלי, או מקובעים בתרכובת OCT לצורך צביעה אימונופלואורסצנטית.בדיקה של החתכים הצבועים עשויה להראות נגעים מיקרוסקופיים בלב המפוזרים באופן אקראי ברחבי המיוקרדיום, שקיעות קולגן וחתכי שריר לב בהחלמה, וכן קפסולות פנומוקוקיות בתוך הנגע המיקרוסקופי בלב, המדגימות את ההליך. האם Armand Brown הוא סטודנט לתואר מתקדם במעבדה שלי? שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי השפעות הנזק ללב שגורם S pneumonia במהלך מחלה פנומוקוקית פולשנית בעכברים.ניתן ליישם זאת גם על דגימות לב ממערכות אחרים, כגון פרימטים שאינם בני אדם או בני אדם. התחילו בגידול של זן ESMO Serotype four Tiger four בתוך מצע Todd Hewitt עד לצפיפות אופטית של 0.5 ב-620 nanometers. כאשר התרבית מגיעה לצפיפות הנכונה, השקיעו אותה ב-3,500 G למשך 10 דקות.לאחר מכן, הסירו את העלייה באמצעות קו ואקום והחזירו את החיידקים לתליה ב-PBS סטרילי בריכוז של 10,000 colony forming units per milliliter. כעת, הרדימו עכברי valve C בני 10 עד 12 שבועות ואשרו את מצב ההרדמה באמצעות צביטה עדינה של בהונות עם פינצטה קהה, מלאו מזרק עם תליית החיידקים וחברו מחט בכיול 27 עד 30 gauge. לאחר מכן, אחזו בעכבר המורדם בעורף ביד אחת, ובזמן זה הזריקו 100 µL מהתליה לתוך הפריטונאום (intraperitoneal) באמצעות היד השנייה, והחזירו כל עכבר לכלובו.העכברים בדרך כלל מתעוררים 30 עד 40 שניות לאחר ההזרקה. קביעה מדויקת של המינון של S pneumonia היא קריטית, שכן אחרת העכברים עלולים להחלים מהזיהום או לפתח מחלה פנומוקוקית פולשנית במהירות רבה מדי מכדי שנגעים יספיקו להתפתח. מכיוון שלכל זן חיידקי רמות שונות של virulent, ייתכן שיידרשו ניסיונות וטעויות כדי לזהות את המינון הנכון.אפשרו לזיהום להימשך במשך 24 שעות לפחות לשלב מוקדם, או עד 30 שעות לשלב זיהום מתקדם. לאחר מכן, בצעו המתה לכל עכבר מזוהם. ראשית, קחו דגימת דם, חטאו את הזנב בעזרת מטלית אלכוהול וגזרו קטע באורך של שני עד שלושה מילימטרים.אספו שני µL של דם מאתר הגזירה. בצעו דילול סדרתי של הדם פי עשרה ב-PBS המכיל סודיום הפרין בריכוז של 1 unit/mL. זרעו חמישה שלבי דילול על צלחות אגר דם סויה טריפטיק, והדגירו אותן למשך לילה.ביום למחרת בצעו ספירת מושבות. המשיכו בקצירת הלב כפי שמתואר בסעיף הבא. לחלופין, 30 שעות לאחר ההדבקה.נסו להציל את העכבר על ידי מתן ampicillin באופן תוך-peritoneal ב-100 µL של תמיסת מלח. המשיכו במתן ampicillin מדי 12 שעות למשך 36 שעות ואספו את הלבבות בנקודות הזמן הרצויות. ראשית, בצעו קציר של הלב.קבע את העכבר שהורגע בסיכה (euthanized) בתנוחה גבנית על פלטפורמה כירורגית, ורסס את החזה ב-70% ethanol וייבש בעדינות. בעזרת מספריים ופינצטה כירורגיים, פתח את חלל החזה. הסר את כלוב הצלעות וחתור את הסרעפת כדי לחשוף את הלב והריאות.לאחר מכן, חתוך את כלי הדם המחוברים ללב והשתמש בפינצטה כדי להוציא בעדינות את הלב ללא גרימת חבלות. שטוף את הלב ב-PBS והנח אותו בתוך קסטה לאיסוף דגימות רקמה לצורך חיתוך קורונלי. לאחר מכן, העבר את הקסטות לתמיסת פורמלין buffered בריכוז 10%, וביום למחרת, שלח אותן לקיבוע בפרפין.בשלבים מוקדמים, ניתן לזהות נגעים לבביים על פי שינוי במראה הצבע שלהם, ובמקרים מסוימים על פי נוכחות של תאי מערכת החיסון. בנגעים מתקדמים, תאי מערכת החיסון יהיו חסרים וגדולים. במקומם נמצאים נגעים דמויי VA.בשימוש בחתכים לב של חמישה מיקרון על שקופיות זכוכית טעונות חיובית, הקפיאו תחילה את החתכים, לאחר מכן הפשירו אותם והניחו להם להתייבש באוויר. קיבעו את השקופיות ב-10% neutral buffered formalin למשך 10 דקות ב-25 °C. לאחר מכן, הסירו את המקבע באמצעות שלושה שטיפות ב-PBS למשך חמש דקות לכל שטיפה.בצעו פרמיליזציה לרקמה באמצעות 0.2%tritton X 100 ב-PBS למשך 15 דקות. הסירו את הדטרגנט באמצעות שלושה שטיפות נוספות ב-PBS נקי. לאחר מכן, חסמו את הרקמה באמצעות 10%coat serum ב-PBS למשך שעה; לאחר שטיפה ב-PBS, כסו את החתך באנטי-סרום למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 °C.טפל בביקורות שליליות באמצעות אנטיסרום של ארנב נאיבי. מכיוון שרקמת לב סופגת בקלות את הצביעה האימונופלורסצנטית של XI, מה שמוביל לרמות רקע גבוהות, סביר להניח שיהיה צורך לבצע אופטימיזציה לריכוז ולזמן האינקובציה עבור סוגים שונים של נוגדנים. לאחר שעתיים, שטוף את האנטיסרום באמצעות PBS. לאחר מכן, החלף את התמיסה בנוגדן משני והשאר את השקופיות להדגרה ב-37 °C למשך 30 דקות. כעת מרח DPI בריכוז של 5 mg/mL ושטוף את השקופיות ב-PBS.לבסוף, רכבו את הפלטים, שמרו אותם ודמיינו אותם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. התחילו בהסרת הפאראפין ובהידרציה של חיתוכי הרקמה. השתמשו בשטיפות של xylene ולאחריהן בסדרה מדורגת של שטיפות אלכוהול.לאחר מכן, השרו את החתכים ב-0.2% phospho metic acid למשך חמש דקות, ולאחר מכן שטפו במים למשך חמש דקות; לאחר מכן, צבעו ב-0.1% serious red ו-ric acid למשך שעתיים. שטפו את החתכים ב-0.01 normal hydrochloric acid למשך שלוש דקות ושטפו אותם ב-70% ethanol למשך דקה אחת. כעת, בצעו דהידרטציה לחתכים על ידי מעבר הפוך בסדריית רחצות אלכוהול בריכוזים מדורגים, ולאחר מכן בשטיפות xylene; רכבו את השקופיות והעריכו אותן באמצעות מיקרוסקופ אור.עכברים פיתחו מחלה פנומוקוקית פולשנית בעקבות חשיפה לזן tiger four. מיקרו-נגעים לבביים נצפו בחדרים, ונרשמה עלייה בגודל ובמספר הנגעים בין 24 ל-30 שעות לאחר ההדבקה. כדי לוודא ש-S. pneumonia אכן נמצאים בתוך הנגעים, נצבעו חתכים עבור הפוליסכריד הקפסולרי של סרוטיפ 4 המיוצר על ידי Tiger four.תוצאה זו אישרה את נוכחותם של אגרגטים דחוסים וצפופים בתוך אתרי המיקרו-נגעים. צביעת Piro serious red בוצעה בחתכים של לב מעכברים שקיבלו טיפול מציל באמפיסילין ובביקורות לא מזוהמות. בקבוצות הטיפול המציל.חלה עלייה דרמטית בנוכחות ובעוצמת הצביעה, עם פסים הזורמים ממה שנראה כאתרי נגעים קודמים בחדרי המוח. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להדביק את העכברים בכמות מספקת של S pneumonia כדי לאפשר לזיהום להימשך לפחות 28 עד 30 שעות, כך שלבקטרימיה ולנגעים זעירים בלב יהיה מספיק זמן להיווצר.

visualization-streptococcus-pneumoniae-within-cardiac-microlesions

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מקור: בראון, א. או. ואחרים. הדמיה של Streptococcus pneumoniae בתוך מיקרו-נגעים לביים ועיצוב מחדש של הלב לאחר מכן. J. Vis. Exp. (2015).הסרטון הזה מדגים את ההדמיה המיקרוסקופית של נגעים מיקרו-חיידקיים ברקמת לב העכבר. הלב של עכבר שנדבק ב-Streptococcus pneumoniae נקטף, נשטף ומקובע לפני שהוא מעובד לביצוע חתכים קורונליים. קטעים אלו מוצבעים בהמטוקסילין ואאוזין ונבדקים תחת מיקרוסקופ כדי להמחיש חיידקים החיים בתוך המיקרו-נגעים.

הדמיה מיקרוסקופית של מיקרונגעים חיידקיים ברקמת לב העכבר

מקור: בראון, א. או., ואוריואלה, ס. ג'. הדגשה של סטרפטוקוקוס ריאות בתוך מיקרו-נגעים לביים ושיפוץ לב לאחר מכן. J. Vis. Exp. (2015)הסרטון מדגים צביעת חיסון של חתכי רקמת הלב של העכברים הקבועים כימית כדי להמחיש חיידקים פתוגניים הממוקמים בתוך מיקרו-נגעים שנגרמו מזיהום. התהליך כולל שטיפת רקמות, חדירות ממברנה, חסימת אתרים לא ספציפיים, סימון נוגדנים, צביעת נגד גרעינית ומיקרוסקופיה קונפוקלית לזיהוי ואיתור אשכולות חיידקים.

צביעת חיסון של מיקרונגעים מלאי חיידקים בחתך רקמת לב של עכבר להדמיה

מחקר זה מדגים את ההקמה המוצלחת של הדמיית מיקרוסקופיה תהודה מגנטית ככלי לא פולשני להערכת הפרעות לב בעכברים הסובלים מדלקת שריר הלב האוטואימונית.  הנתונים מצביעים על כך שניתן להשתמש בטכניקה כדי לעקוב אחר התקדמות המחלה בבעלי חיים חיים.

הערכה לא פולשנית של לב חריגות בניסויית אוטואימוניות דלקת שריר לב על ידי תהודה מגנטית מיקרוסקופית הדמיה בעכבר

מוצגת כאן שיטה להמחשת מבנה אולטרה-מבנה של מטריצה חוץ-תאית ברקמות לב נטולות תאים.

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של רקמות macerated לדמיין את תאי מטריקס

הערכת תוצאה אמינה ומדויקת היא המפתח לתרגום של טיפולים פרה-קליניים לתוך טיפול מרפאתי. המאמר הנוכחי מתאר כיצד להעריך שלושה פרמטרים התוצאה העיקרית רלוונטיות קלינית של ביצועי הלב ונזק במודל אוטם לבבי חריף חזיר.

הערכת התוצאה העיקרית במודל חזיר של באוטם שריר הלב

כאן, אנו מתארים גישה מיקרוסקופית אור גיליון לדמיין את הלב CD45 + ליקוציט לחדור במודל Murine של שריר הלב, שריר הלב, אשר נגרמת על ידי טיפול דיפריה intraracheal intrachecheal של עכברים CD11c.DTR.

ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור

כאן אנו מציגים פרוטוקול להצפנה אינדוקציה של שמאל cryoinjury חדרית ואחריו ההשתלה של תיקון שריר הלב, נגזר iPS-התא האנושי cardiomyocytes במודל של שפן.

השרשת נגזר hiPSC תיקונים שריר הלב לאחר פציעה שריר הלב במודל שפן

פרוטוקול זה מתווה את השלבים לגרימת אוטם שריר הלב בעכברים תוך שמירה על קרום הלב ותכולתו.

מודל מכרסם איסכמי שלם של קרום הלב

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקבלת תמונות טומוגרפיה ממוחשבות מיקרו ברזולוציה גבוהה של לבבות שלמים של יונקים גדולים בריאים ופתולוגיים עם שיפור ניגודיות סלקטיבית של קולגן.

טכניקות הכנת רקמות להדמיית טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו משופרת ניגודיות של מודלים לבביים של יונקים גדולים עם מחלות כרוניות

שחזור תלת מימדי (תלת מימדי) של נזק לבבי באוטם שריר הלב החריף (repAMI) מאפשר כימות נאמן ולוקליזציה משותפת של דפוסים המשפיעים על המחלה הקשורים. כאן, ניתנת גישת הדמיה מונחית יריעת אור אוטומטית למדידה בו-זמנית של נזק לבבי, אזור בסיכון ותגובת תאי חיסון.

ניתוח תלת מימד סימולטני של נזק לבבי ותגובה חיסונית באוטם שריר הלב החריף באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור

חקור היווצרות מיקרו-פצעים לבביים בעכברים נגועים ב-Streptococcus pneumoniae באמצעות טכניקות צביעה מיקרוסקופיות. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של פגיעה לבבית ושיקום לאחר זיהום.

ויזואליזציה של

גלה סרטונים נוספים