ויזואליזציה של Streptococcus pneumoniae בתוך Microlesions הלב וRemodeling לב לאחר

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים פרוטוקול הניתן לשחזור להיווצרות מיקרו נגעים לבביים של ESMO בתוך הלב של עכברים נגועים. זה מושג על ידי הדבקת עכברים ב- ESMO ומאפשר התפתחות של בקטרמיה, ובכך נותן לחיידקים גישה לכלי הדם הלבביים שם הם יכולים לפלוש לשריר הלב וליצור נגעים מיקרוסקופיים. לאחר מכן הלבבות מוטבעים ומוכתמים באופן קונבנציונלי או מקובעים בתרכובת OCT לצביעה אימונו-פלואורסצנטית.

הערכת החלקים המוכתמים יכולה להראות נגעי מיקרו לבביים המפוזרים באופן אקראי על פני משקעי הקולגן בשריר הלב והחלמת חלקי הלב שלי וכמוסות פנאומוקוק בתוך הנגע המיקרו הלבבי מדגים את ההליך. האם ארמנד בראון הוא סטודנט לתואר שני במעבדה שלי? למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ההשפעות המזיקות ללב של דלקת ריאות S במהלך מחלת פנאומוקוק פולשנית בעכברים.

ניתן ליישם אותו גם על דגימות לב ממערכות אחרות כגון פרימטים שאינם אנושיים או בני אדם. התחל עם גידול הזן ESMO Serotype 4 Tiger four במרק טוד יואיט לצפיפות אופטית של 0.5 ב-620 ננומטר. כאשר בצפיפות הנכונה גלולה את התרבות ב -3, 500 גרם למשך 10 דקות.

לאחר מכן הסר את הסופרנטנט באמצעות קו ואקום והשהה מחדש את החיידקים עם PBS סטרילי ב-10,000 יחידות יוצרות מושבה למיליליטר. כעת מורדמים עכברי שסתום C בני 10 עד 12 שבועות ומאשרים את מצבם המורדם עם צביטה עדינה של הבוהן מזוג פינצטה קהה, מזרק לוטוס עם תרחיף החיידקים וחיבור מחט בגודל 27 עד 30. לאחר מכן אחזו בעכבר מורדם ביד אחת תוך כדי הזרקה תוך-צפקית של 100 מיקרוליטר תרחיף ביד השנייה, החזירו כל עכבר לכלוב שלו.

העכברים מתעוררים בדרך כלל 30 עד 40 שניות לאחר ההזרקה. קבלת מינון נכון של דלקת ריאות S היא קריטית, או שהעכברים יכולים להתאושש מזיהום או להגיע למחלת פנאומוקוק פולשנית מהר מדי מכדי שהנגעים יתפתחו. מכיוון שלכל זן חיידקי יש רמות שונות של עדשות אוזניים, ייתכן שיידרש ניסוי וטעייה כדי לזהות את המינון הנכון.

אפשר לזיהום להמשיך לפחות 24 שעות לשלב מוקדם או עד 30 שעות לזיהום בשלב מתקדם. מאוחר יותר המתת חסד של כל עכבר נגוע. ראשית, קחו דגימת דם, חטאו את הזנב בעזרת ספוגית אלכוהול וחתכו קטע של שניים עד שלושה מילימטרים.

אוספים שני מיקרוליטרים של דם מאתר החיתוך. יש לדלל את הדם באופן סדרתי פי עשרה ב-PBS המכיל נתרן הפרין ביחידה אחת למיליליטר. צלחו חמש רמות של דילולים על צלחות אגר דם סויה טריפטיכון, ודגרו אותן למשך הלילה.

למחרת ספירת המושבות. המשך בקצירת הלב כמתואר בסעיף הבא. לחלופין, 30 שעות לאחר ההדבקה.

נסה להציל את העכבר על ידי מתן אמפיצילין אינטרפריטונאלי ב-100 מיקרוליטר מי מלח. המשיכו לספק אמפיצילין כל 12 שעות למשך 36 שעות ואספו לבבות בנקודות הזמן הרצויות. ראשית, קצרו את הלב.

קבעו את העכבר המומת בשכיבה על פלטפורמה כירורגית, ורססו את החזה באתנול 70% וייבשו בטפיחות. בעזרת מספריים ומלקחיים כירורגיים, פתח את חלל החזה. הסר את כלוב הצלעות וחצה את הסרעפת כדי לחשוף את הלב והריאות.

לאחר מכן חתכו את כלי הדם המחוברים ללב והשתמשו במלקחיים כדי לכרות בעדינות את הלב ללא חבורות. שטפו את הלב עם PBS והניחו אותו בקלטת איסוף דגימות רקמה לחיתוך עטרה. לאחר מכן העבירו את הקסטות לתמיסת פורמלין עם 10%, ולמחרת, שלחו להטמעת פרפין.

בשלבים מוקדמים ניתן לזהות נגעים לבביים על ידי שינוי במראה הצבע שלהם, ובמקרים מסוימים נוכחות של תאי חיסון. בנגעים מתקדמים, תאי החיסון יהיו נעדרים וגדולים. נגעים דמויי VA נמצאים במקומם.

בעזרת חתך לב של חמישה מיקרון על מגלשות זכוכית טעונות חיובית, הקפיאו תחילה את החלקים, ואז הפשירו אותם והניחו להם להתייבש באוויר. תקן את השקופיות בפורמין ניטרלי של 10% למשך 10 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הסר את הקיבוע עם שלוש כביסות ו-PBS למשך חמש דקות לכל כביסה.

לאחר מכן חדיר את הרקמה עם 0.2% טריטון X 100 ב-PBS למשך 15 דקות. הסר את חומר הניקוי בשלוש כביסות נוספות ב-PBS ישר. לאחר מכן חסום את הטישו עם סרום שכבה של 10% ב-PBS למשך שעה לאחר שטיפה ב-PBS, כסה את החלק בסרום למשך שעתיים בחום של 37 מעלות צלזיוס.

טפל בבקרות שליליות עם אנטי-סרום ארנב נאיבי מכיוון שרקמת הלב סופגת בקלות את הכתם האימונופלואורסצנטי XI מה שמוביל לרמות רקע גבוהות, סביר להניח שיהיה צורך לייעל את הריכוז בזמן הדגירה עבור סוגים שונים של נוגדנים שעתיים לאחר מכן, שטפו את סרום האנטי עם PBS. לאחר מכן החלף את התמיסה בנוגדנים משניים ותן לשקופיות לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כעת יש למרוח DPI בחמישה מיליגרם למיליליטר ולשטוף את השקופיות עם PBS.

לבסוף, הרכיבו את השקופיות ברצפה, שמרו ודמו אותן במיקרוסקופיה קונפוקלית. התחל בהסרת הפרפין ולחות חלקי הרקמה. השתמש בשטיפות קסילן ואחריו סדרה מדורגת של שטיפות אלכוהול.

לאחר מכן יש לרחוץ את החלקים בחומצה מטית של 0.2% פוספו למשך חמש דקות, ולאחר מכן לשטוף את הכתם הבא במים של 0.1% חומצה אדומה רצינית למשך שעתיים. לאחר מכן שטפו את החלקים בחומצה הידרוכלורית רגילה של 0.01 למשך שלוש דקות ושטפו אותם באתנול של 70% למשך דקה. כעת ייבשו את החלקים על ידי היפוך סדרת אמבטיות האלכוהול המדורגות, ואחריה שטיפות קסילן באמצעות תושבת מיקרוסקופ אור והעריכו את השקופיות.

עכברים פיתחו מחלת פנאומוקוק פולשנית בעקבות אתגר עם הנמר. ארבעה נגעים זעירים לבביים נצפו בחדרים ועלייה בגודל הנגע ובמספרו נצפתה בין 24 ל-30 שעות לאחר ההדבקה כדי לבדוק שדלקת ריאות אכן הייתה בתוך הנגעים. חלקים הוכתמו עבור הסרוטיפ ארבע פוליסכריד קפסולרי המיוצר על ידי טייגר ארבע.

זה אישר את נוכחותם של אגרגטים צפופים ודחוסים בתוך אתרי המיקרו-נגעים. צביעה אדומה חמורה של פירו בוצעה על חלקי לב מעכברים שחולצו עם אמפיצילין ובקרות לא נגועות. בחילוץ.

הייתה עלייה דרמטית בנוכחות ובעוצמת הכתם עם רצועות שזרמו ממה שנראה כאתרי נגע קודמים בחדרים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להדביק עכברים בשימוש מספיק בדלקת ריאות S כדי לאפשר לזיהום להימשך לפחות 28 עד 30 שעות, כך שלבקטרמיה ולנגעים זעירים לבביים יהיה מספיק זמן להיווצר.