ויזואליזציה של

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים פרוטוקול הניתן לשחזור ליצירת מיקרו-נגעים לבביים של ESMO בתוך לבם של עכברים מזוהמים. דבר זה מושג על ידי הדבקת עכברים ב-ESMO ומתן אפשרות להתפתחות בקטרימיה, ובכך מתאפשר לבקטריות גישה לכלי הדם של הלב, שם הן יכולות לפלוש לשריר הלב (myocardium) וליצור נגעים מיקרוסקופיים. לאחר מכן, הלבבות מוטמעים בפרפין ונצבעים באופן קונבנציונלי, או מקובעים בתרכובת OCT לצורך צביעה אימונופלואורסצנטית.

בדיקה של החתכים הצבועים עשויה להראות נגעים מיקרוסקופיים בלב המפוזרים באופן אקראי ברחבי המיוקרדיום, שקיעות קולגן וחתכי שריר לב בהחלמה, וכן קפסולות פנומוקוקיות בתוך הנגע המיקרוסקופי בלב, המדגימות את ההליך. האם Armand Brown הוא סטודנט לתואר מתקדם במעבדה שלי? שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי השפעות הנזק ללב שגורם S pneumonia במהלך מחלה פנומוקוקית פולשנית בעכברים.

ניתן ליישם זאת גם על דגימות לב ממערכות אחרים, כגון פרימטים שאינם בני אדם או בני אדם. התחילו בגידול של זן ESMO Serotype four Tiger four בתוך מצע Todd Hewitt עד לצפיפות אופטית של 0.5 ב-620 nanometers. כאשר התרבית מגיעה לצפיפות הנכונה, השקיעו אותה ב-3,500 G למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הסירו את העלייה באמצעות קו ואקום והחזירו את החיידקים לתליה ב-PBS סטרילי בריכוז של 10,000 colony forming units per milliliter. כעת, הרדימו עכברי valve C בני 10 עד 12 שבועות ואשרו את מצב ההרדמה באמצעות צביטה עדינה של בהונות עם פינצטה קהה, מלאו מזרק עם תליית החיידקים וחברו מחט בכיול 27 עד 30 gauge. לאחר מכן, אחזו בעכבר המורדם בעורף ביד אחת, ובזמן זה הזריקו 100 µL מהתליה לתוך הפריטונאום (intraperitoneal) באמצעות היד השנייה, והחזירו כל עכבר לכלובו.

העכברים בדרך כלל מתעוררים 30 עד 40 שניות לאחר ההזרקה. קביעה מדויקת של המינון של S pneumonia היא קריטית, שכן אחרת העכברים עלולים להחלים מהזיהום או לפתח מחלה פנומוקוקית פולשנית במהירות רבה מדי מכדי שנגעים יספיקו להתפתח. מכיוון שלכל זן חיידקי רמות שונות של virulent, ייתכן שיידרשו ניסיונות וטעויות כדי לזהות את המינון הנכון.

אפשרו לזיהום להימשך במשך 24 שעות לפחות לשלב מוקדם, או עד 30 שעות לשלב זיהום מתקדם. לאחר מכן, בצעו המתה לכל עכבר מזוהם. ראשית, קחו דגימת דם, חטאו את הזנב בעזרת מטלית אלכוהול וגזרו קטע באורך של שני עד שלושה מילימטרים.

אספו שני µL של דם מאתר הגזירה. בצעו דילול סדרתי של הדם פי עשרה ב-PBS המכיל סודיום הפרין בריכוז של 1 unit/mL. זרעו חמישה שלבי דילול על צלחות אגר דם סויה טריפטיק, והדגירו אותן למשך לילה.

ביום למחרת בצעו ספירת מושבות. המשיכו בקצירת הלב כפי שמתואר בסעיף הבא. לחלופין, 30 שעות לאחר ההדבקה.

נסו להציל את העכבר על ידי מתן ampicillin באופן תוך-peritoneal ב-100 µL של תמיסת מלח. המשיכו במתן ampicillin מדי 12 שעות למשך 36 שעות ואספו את הלבבות בנקודות הזמן הרצויות. ראשית, בצעו קציר של הלב.

קבע את העכבר שהורגע בסיכה (euthanized) בתנוחה גבנית על פלטפורמה כירורגית, ורסס את החזה ב-70% ethanol וייבש בעדינות. בעזרת מספריים ופינצטה כירורגיים, פתח את חלל החזה. הסר את כלוב הצלעות וחתור את הסרעפת כדי לחשוף את הלב והריאות.

לאחר מכן, חתוך את כלי הדם המחוברים ללב והשתמש בפינצטה כדי להוציא בעדינות את הלב ללא גרימת חבלות. שטוף את הלב ב-PBS והנח אותו בתוך קסטה לאיסוף דגימות רקמה לצורך חיתוך קורונלי. לאחר מכן, העבר את הקסטות לתמיסת פורמלין buffered בריכוז 10%, וביום למחרת, שלח אותן לקיבוע בפרפין.

בשלבים מוקדמים, ניתן לזהות נגעים לבביים על פי שינוי במראה הצבע שלהם, ובמקרים מסוימים על פי נוכחות של תאי מערכת החיסון. בנגעים מתקדמים, תאי מערכת החיסון יהיו חסרים וגדולים. במקומם נמצאים נגעים דמויי VA.

בשימוש בחתכים לב של חמישה מיקרון על שקופיות זכוכית טעונות חיובית, הקפיאו תחילה את החתכים, לאחר מכן הפשירו אותם והניחו להם להתייבש באוויר. קיבעו את השקופיות ב-10% neutral buffered formalin למשך 10 דקות ב-25 °C. לאחר מכן, הסירו את המקבע באמצעות שלושה שטיפות ב-PBS למשך חמש דקות לכל שטיפה.

בצעו פרמיליזציה לרקמה באמצעות 0.2%tritton X 100 ב-PBS למשך 15 דקות. הסירו את הדטרגנט באמצעות שלושה שטיפות נוספות ב-PBS נקי. לאחר מכן, חסמו את הרקמה באמצעות 10%coat serum ב-PBS למשך שעה; לאחר שטיפה ב-PBS, כסו את החתך באנטי-סרום למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 °C.

טפל בביקורות שליליות באמצעות אנטיסרום של ארנב נאיבי. מכיוון שרקמת לב סופגת בקלות את הצביעה האימונופלורסצנטית של XI, מה שמוביל לרמות רקע גבוהות, סביר להניח שיהיה צורך לבצע אופטימיזציה לריכוז ולזמן האינקובציה עבור סוגים שונים של נוגדנים. לאחר שעתיים, שטוף את האנטיסרום באמצעות PBS. לאחר מכן, החלף את התמיסה בנוגדן משני והשאר את השקופיות להדגרה ב-37 °C למשך 30 דקות. כעת מרח DPI בריכוז של 5 mg/mL ושטוף את השקופיות ב-PBS.

לבסוף, רכבו את הפלטים, שמרו אותם ודמיינו אותם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. התחילו בהסרת הפאראפין ובהידרציה של חיתוכי הרקמה. השתמשו בשטיפות של xylene ולאחריהן בסדרה מדורגת של שטיפות אלכוהול.

לאחר מכן, השרו את החתכים ב-0.2% phospho metic acid למשך חמש דקות, ולאחר מכן שטפו במים למשך חמש דקות; לאחר מכן, צבעו ב-0.1% serious red ו-ric acid למשך שעתיים. שטפו את החתכים ב-0.01 normal hydrochloric acid למשך שלוש דקות ושטפו אותם ב-70% ethanol למשך דקה אחת. כעת, בצעו דהידרטציה לחתכים על ידי מעבר הפוך בסדריית רחצות אלכוהול בריכוזים מדורגים, ולאחר מכן בשטיפות xylene; רכבו את השקופיות והעריכו אותן באמצעות מיקרוסקופ אור.

עכברים פיתחו מחלה פנומוקוקית פולשנית בעקבות חשיפה לזן tiger four. מיקרו-נגעים לבביים נצפו בחדרים, ונרשמה עלייה בגודל ובמספר הנגעים בין 24 ל-30 שעות לאחר ההדבקה. כדי לוודא ש-S. pneumonia אכן נמצאים בתוך הנגעים, נצבעו חתכים עבור הפוליסכריד הקפסולרי של סרוטיפ 4 המיוצר על ידי Tiger four.

תוצאה זו אישרה את נוכחותם של אגרגטים דחוסים וצפופים בתוך אתרי המיקרו-נגעים. צביעת Piro serious red בוצעה בחתכים של לב מעכברים שקיבלו טיפול מציל באמפיסילין ובביקורות לא מזוהמות. בקבוצות הטיפול המציל.

חלה עלייה דרמטית בנוכחות ובעוצמת הצביעה, עם פסים הזורמים ממה שנראה כאתרי נגעים קודמים בחדרי המוח. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להדביק את העכברים בכמות מספקת של S pneumonia כדי לאפשר לזיהום להימשך לפחות 28 עד 30 שעות, כך שלבקטרימיה ולנגעים זעירים בלב יהיה מספיק זמן להיווצר.