עצבי פעילות הרבייה בהיפוקמפוס הכנה פרש בחודר מיקרו-אלקטרודה Array

פיתחנו היפוקמפוס פרש במבחנה השומר מערך CA1-CA3 של נוירונים. בשילוב עם מערך מיקרו-אלקטרודה החודרת, פעילות עצבית יכולה להיות במעקב בשתי אוריינטציות אורכי ורוחביות. שיטה זו מספקת יתרונות על פני הכנות פרוסה בהיפוקמפוס כמו ההתפשטות בכל היפוקמפוס ניתן להקליט בו זמנית.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להציג את התהליך של פתיחת היפוקמפוס מכרסמים והנחת תכשיר הרקמה השטוחה על מערך המיקרו-אלקטרודות החודר. להקלטה. זה מושג על ידי בידוד היפוקמפוס של עכבר ממחצית המוח שלו.

השלב השני הוא לפרוש את המבנה המעוקל של ההיפוקמפוס עם כלים מותאמים אישית. לאחר מכן, ההיפוקמפוס שנפרש מועבר לתא ההקלטה ומונח על מערך ההקלטה. השלב האחרון הוא להסיר את ההיפוקמפוס שנפרש מהמערך לאחר הניסוי.

בסופו של דבר, שיטת מיפוי נורמליזציה אינדיבידואלית משמשת בניתוח נתונים כדי להראות את התפשטות הפעילות העצבית שנרשמה על ידי מערך המיקרו-אלקטרודות החודר. ובכן, היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו להקליט פעילות עצבית בשני כיוונים רוחביים ואורכיים. כדי לראות את ההתפשטות האמיתית של הפעילות העצבית, אתה צריך היפוקמפוס שלם, לפרוש את צנצנות השקע ולהשכיב שטוח לתוך תא הקלטה, ואז ההתפשטות תתרחש הן בכיוונים רוחביים והן בכיוונים אורכיים.

ואז הצלחנו להבין את מהירות ההתפשטות של הרקמה. היינו בפעילות בשני הכיוונים, והצלחנו לחקור את מנגנוני ההתפשטות, במיוחד את המנגנונים הסינפטיים הלא-סינפטיים. הצלחנו לראות פעילות מתפשטת עם התמסורת הסינפטית הזו עם צמתי הפער הזה, ובגלל המהירות, אנחנו יודעים שזה לא דיפוזיה.

אז עכשיו אנחנו מנסים לפענח את המנגנונים האמיתיים של ההתפשטות הזו. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו בגלל ההליכים המאתגרים של פתיחת ההיפוקמפוס ומניחים את הכנת הרקמה השטוחה על מערך המיקרו-אלקטרודות החודר הזה מבלי לפגוע ברקמה או במערך. כדי להתחיל בהליך זה, הנח את ראש העכבר בסוכרוז מחומצן קר כקרח.

CSF משתמש במספריים עדינים כדי להסיר את עור הגולגולת. לאחר מכן, חותכים את הגולגולת לאורך קו האמצע ואת שני הקצוות ליד האונה הטמפורלית. לאחר מכן מקלפים את הגולגולת החתוכה לכיוון צידי הראש.

על מנת לחשוף את המוח הסר בזהירות את המוח מהגולגולת בעזרת המרית. לאחר מכן, הניחו את המוח על שלב כירורגי קר כקרח מכוסה בנייר סינון רטוב. הסר את המוח הקטן בעזרת להב צונן קרח.

לאחר מכן הפרד את שתי ההמיספרות על ידי חיתוך קו האמצע של המוח. לאחר מכן הניחו את שתי ההמיספרות המופרדות בכוס מלאה בסוכרוז קר כקרח. CSF בעבע עם 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני.

העבירו חצי כדור אחד לשלב הקר כקרח מכוסה בנייר פילטר. הניחו מגבות נייר רגילות או ניירות סינון סביב המוח כדי לספוג את התמיסה הנוספת. לאחר מכן, השתמשו בשתי פיפטות זכוכית מלוטשות אש כדי להפריד את קליפת המוח מהחלק המרכזי של המוח על מנת לחשוף את ההיפוקמפוס.

לאחר מכן, מרחו שתיים עד שלוש טיפות של CSF קר כקרח על הטישו, והסירו תמיסה נוספת. חתכו את הקשרים עם קליפת המוח בשני קצוות ההיפוקמפוס. לאחר מכן נתחו את ההיפוקמפוס מהמוח בעזרת כלי הזכוכית המלוטשים באש.

לאחר מכן הפרד את כל ההיפוקמפוס כשהצד החיצוני שלו פונה כלפי מעלה וחריץ ההיפוקמפוס פונה כלפי מטה יש למרוח במהירות שתיים עד שלוש טיפות של CSF קר קרח על הרקמה שוב, ולהסיר את התמיסה הנוספת סביבו. לאחר מכן השתמש בכלי הזכוכית המלוטשת באש כדי להפוך את כל ההיפוקמפוס. כדי לחשוף את הסולקוס, השתמש בלהב קר כקרח כדי לקצץ את קצוות המחיצה והרקתית של ההיפוקמפוס.

במידת הצורך, הכנס מחט זכוכית בהתאמה אישית לתוך הסולקוס וחתוך את מסלול הסיבים מ-DG לשלוש. לאחר מכן השתמשו בלולאת חוט מתכת כדי למשוך את ה-DG ולפרוש את ההיפוקמפוס. כל תהליך הניתוח נמשך בדרך כלל כשתי דקות.

מרחו עוד שתיים עד שלוש טיפות של סוכרוז קר כקרח A CSF על הרקמה והסירו את התמיסה הנוספת סביבה. לאחר מכן חתוך את שולי ההיפוקמפוס הפרוש עם להב קר כקרח. העבירו את התכשיר לתא ההתאוששות המלא ב-A CSF רגיל ומבעבע ב-95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורת החדר למשך שעה לפני העברתו לתא ההקלטה.

בהליך זה, מלאו בקבוק אחד ב-A CSF רגיל ובקבוק אחר בארבע בועות AP A CSF. התמיסות עם 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני מתחילת הניסויים. השתמש במחבר תלת-שסתומי כדי לשלוט בפתרון שייבחר במהלך ניסוי.

לאחר מכן, חבר צינור ואקום לשקע החדר. כדי להוציא את התמיסה למיכל אבק, יש לחמם את הצינור לפני העברת התמיסה לתא ההקלטה ולשמור אותה בטמפרטורה מבוקרת של 35 מעלות צלזיוס. לאחר סגירת הכניסה והיציאה של תא ההקלטה, השתמש בטפטפת פיפטה מזכוכית בהתאמה אישית כדי להעביר את ההיפוקמפוס שנפרש לתא ההקלטה.

מתחת למיקום המיקרוסקופ, ההיפוקמפוס הפרוש כשהצד האלווי שלו פונה כלפי מטה כאזור של שלושה הפונים הצידה ושדה אחד המצביע לכיוון החוקר שואב בזהירות את התמיסה בתא באמצעות פיפטת ואקום מקצה תא ההקלטה עד שהתא מתייבש והרקמה מונחת על המערך. לאחר מכן הנח בזהירות עוגן רקמה מותאם אישית על גבי הרקמה כדי להחזיק את ההיפוקמפוס הפרוש על המערך. מלאו מחדש את תא ההקלטה בכמה טיפות תמיסה.

פתח בהדרגה את הכניסה והיציאה כדי לכוונן את קצב הזרימה לכשתי טיפות לשנייה בתא הנסיעה לווריד. דגרו את הרקמה בתא ההקלטה עם CSF רגיל למשך כדקה. ואז החלף את הפתרונות.

החל על ארבעה AP מומס A CSF והתאם את קצב הזרימה כראוי. דגרו את הרקמה בארבעה AP מומס CSF למשך כחמש עד 10 דקות לפני ההקלטה. כדי להסיר את הרקמה מה-PMEA, שלוט בעוגן הרקמה על ידי מיקרו מניפולטור והרם בהדרגה את העוגן מתא ההקלטה.

כבה גם את הכניסה וגם את היציאה על מנת לעצור את הזרימה. בתא ההקלטה, השתמש במכחול קטן כדי להרים את פינת הרקמה. אם הרקמה אינה צפה בתמיסה, השתמש בצינור הוואקום כדי לייבש את החדר בזהירות כשהרקמה עדיין יושבת על המערך.

לאחר מכן פתח בזהירות את הכניסה כדי למלא מחדש את החדר בהדרגה וסגר את הכניסה כדי לעצור את הזרימה. כאשר תא ההקלטה מלא, השתמש במברשת הקטנה כדי להרים את פינת הרקמה. שוב. אם הרקמה צפה בתמיסה, השתמש בצינור הוואקום כדי לשאוב את הרקמה.

פתח את הזרימה בכניסה ואת הוואקום ביציאה. שוטפים את המערכת במים מזוקקים ומייבשים אותה. זוהי דוגמה לפעילות הספונטנית הנגרמת על ידי 100 מיקרומולרי ארבעה AP A CSF שהוקלטו מאחת האלקטרודות המיקרו הממוקמות באזור הדנדריטי הבסיסי עם יחס אות לרעש של 34.9 דציבלים.

והנה הפעילויות המוגדלות במלבן האדום. אלה הנתונים הגולמיים ממיקרו אלקטרודה אחרת הממוקמת קרוב יותר לסומטה עם יחס אות לרעש של 27.2 דציבלים המוצגים. הנה דוגמה נוספת להקלטה המתקבלת מאלקטרודה הממוקמת בתוך השכבה הסומטית.

בדוגמה זו, יחס האות לרעש הוא 18.53 דציבלים, והנה הרעש הבסיסי שנרשם ממיקרו אלקטרודה. לקו הבסיס יש בדרך כלל ערך שיא לשיא בין 150 ל -200 מיקרו וולט, והעכבה של אלקטרודה בודדת היא בסביבות 1 עד 2 מגה אוהם. סרטון זה מציג את ההתפשטות העצבית שהוקלטה עם המערך ולאחר מכן עובדה בשיטת נורמליזציה אינדיבידואלית.

בניתוח נתונים, כל ההתפשטות על פני הרקמה כולה נמשכת כ-100 אלפיות השנייה לאחר הליך זה. שיטות אחרות כמו דימות מוחי בהיפוקמפוס פרוש במבחנה יכולות להתבצע גם על מנת לענות על שאלות נוספות כמו תנועה של מוקדים עצביים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפרוש את ההיפוקמפוס במקום, את הכנת הרקמה השטוחה על מערך ההרצאות הקטן.