Name: גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: למד כיצד לבודד תאים ראשוניים מגידולי שד בעכברים ולהכין פיברובלסטים עובריים לחקר תהליכי גרורה בריאות. שיטות אלו מסייעות בחקר מנגנוני התפתחות סרטן השד ובהבנת ביולוגיית הגידול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות ל-NIH, LACaTS וקרן מרפאת אוקסנר על התמיכה הכספית.

כל ניסויי העכבר נעשו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי בעלי החיים המוסדיים הטיפול ושימוש בועדות (IACUC) של בית הספר לרפואה של LSU. כל המכשירים חייבים להיות autoclaved לפני הנתיחה. 1. הכנה של תאים ראשוניים מגידולי שד עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במודל עכבר שהונדס גנטי עם וירוס עכבר החלב גידול Polyoma התיכון T-Antigen (עכבר MMTV-PyMT-מהונדס), אשר באופן ספונטני לפתח גידולים כפי שתואר בעבר 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכברים עם Isoflurane (99.9%) ולרסס 75% אתנול כדי להבטיח סביבת סטרילית (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את העור מאזור פתח השופכה לצוואר עם מספריים. הצמד את העור כלפי מטה, כדי לאפשר גישה קלה לאיברים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הגידול בשד החלב ולשטוף עם פוספט סטרילי הקר שנאגרו (PBS) (pH 7.4) (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הגידול לצלחת תרבות 10 ס&quot;מ רקמות סטריליים וקוצצת אותו בסכין גילוח סטרילי ומספריים כ 1 מ&quot;מ 3 חתיכות. יש לבצע את הפעולות הבאות בזרימה למינרית סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמת גידול הקצוצה עם Collagenase מומס בתקשורת DMEM סרום ללא בריכוז סופי של 1 מ&quot;ג / מיליליטר על כיסא נדנדה לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ההשעיה רקמת גידול 3 דקות ב 200 x גרם. הערה: הדגירה Collagenase חיונית לניתוק האנזימטית של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולשטוף את המשקע 3 פעמים עם PBS (pH 7.4) על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 200 x גרם. לאחר לשטוף הסופי, למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend רקמות עם 2 מיליליטר של EDTA טריפסין במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס בזמן nutating. צנטריפוגה ההשעיה למשך 3 דקות ב XG 200 ולחזור על שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה הרקמה במדיום גידול רגיל (DMEM, 10% FBS, 2X עט / סטרפטוקוקוס) על צלחת 10 ס&quot;מ. שינויהתקשורת כל יום במשך 3 הימים הבאים. תרבות תאים עד מספר תא רצוי מתקבל. הערה: כ 1x10 7 תאים יהיו מבודדת מהליך זה. מודלים אחרים החלב עכבר tumorigenesis, כגון MMTV-Neu, נותנים תשואה נמוכה יותר של תאים בהשוואה לMMTV-PyMT. בעת שימוש במודלים המייצרים תשואה נמוכה יותר, זה מועיל להתחיל עם תאי גידול והתרבות גדולים יותר. </li></ol> 2. עכבר ריאות הפקה לדמיין ריאות גרורה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מיצוי ריאות, להסיר את הכבד והסרעפת. לעקור את הצלעות מבלי להפריע לריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג נאה של מספריים, לפתוח את החלק העליון של קנה הנשימה שהוא קרוב יותר לוריד הצוואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קטטר, להזריק סוכן כגון 1 מיליליטר של Z-תיקון או דיו הודו דרך קנה הנשימה כדי למלא את הריאות (איור 2 א). להטביע את Z-לתקן ריאות בפרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דה-להכתים את הריאות הוזרקו דיו הודו בפתרון של Fekete(אלכוהול 100 מיליליטר 70%, 10 מיליליטר של 10% שנאגרו פורמלין, ו 5 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית) במשך 5 דקות. הגדר גושים סרטניים באתרים משניים עם ≥ 0.5 מ&quot;מ קוטר, לקבוע את הגושים כגרורות. הערה: בשל חסימת הסמפונות וbronchiole על ידי הגידול, גושים סרטניים לא יכולים לספוג 15% דיו הודו, ובכך רקמת ריאה נורמלית תהיה בשחור, וגושי גידול יהיו בצבע לבן 7. זה יאפשר להדמיה של גושים בודדים גידול (איור 2). </li></ol> 3. הכנת fibroblasts העכבר העוברית (MEFs) מהעכבר עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכברים בהריון עם Isoflurane (99.9%) ולרסס 75% אתנול כדי להבטיח סביבת סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את העור מאזור פתח השופכה לצוואר עם מספריים ולבודד את העוברים מהרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היזהר שלא להפריע לעוברים בעת פתיחת העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קרן הרחם ולשטוף אותם בSTE הקרלהרגיז PBS (pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את העובר מהשליה שלה בזהירות רבה ועוברי מקום בצלחת 10 ס&quot;מ המכילות קרח הקר PBS (pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הראש, בכבד ובמעיים מן העובר ומניח את החלק שנותר בצלחת תרבית רקמה גם 12 המכילה PBS (pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את גוף העובר לעוד EDTA טריפסין המכיל 12 צלחת היטב ולחתוך לחתיכות קטנות (~ 1 מ&quot;מ 3) באמצעות סכין גילוח סטרילי ומספריים. דגירה החומר הקצוץ עם 5 מיליליטר של EDTA טריפסין במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית טריפסין על ידי הוספת 1 מיליליטר סרום שור עוברי (FBS) לעוברים הקצוצים. צנטריפוגה ההשעיה במהירות XG 200 במשך 10 דקות, להסיר בזהירות את supernatant, resuspend גלולה עם 1 מיליליטר של מדיום DMEM החם ולהעביר את כל התוכן לצלחת 10 ס&quot;מ המכילה FBS 10 מיליליטר של DMEM (עם 20% ו2X פניצילין / סטרפטומיצין ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות הבינוני בכל יום ליומיים. תרבות התאים עד תא רצוימספר מושגת. </li></ol>

<ol><li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Natur%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).</li>
<li>Poste, G., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Natur%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of cancer metastasis.</a> Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).</li>
<li>Wan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Metastasis+Moving+New+Biological+Insights+into+the+Clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic.</a> Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).</li>
<li>Bergers, G., Benjamin, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenesis+and+the+angiogenic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumorigenesis and the angiogenic switch.</a> Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).</li>
<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mouse+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Maximizing mouse cancer models.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).</li>
<li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene%3A+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).</li>
<li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Identification+of+Experimental+Pulmonary+Metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases.</a> J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).</li>
<li>Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tumor+immunity+and+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+using+dendritic+cells+transfected+with+messenger+RNA+amplified+from+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells.</a> Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).</li>
<li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+breast+cancer%3A+one+size+does+not+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li>
<li>Watts, A. M., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+Tumor+Foci+in+an+Experimental+Murine+Tumor+Model+Using+Computer-Assisted+Video+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioche%22%5BJournal%5D)">Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging.</a> Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+Established+Pulmonary+Metastases+and+Subcutaneous+Tumor+Mediated+by+the+Systemic+Administration+of+High-Dose+Recombinant+Interleukin+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Me%22%5BJournal%5D)">Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2.</a> J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).</li>
<li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Re%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Re. 8 (4), 212(2006).</li>
<li>Veer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+predicts+clinical+outcome+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer.</a> Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).</li>
</ol>

יש הסופרים לא גילויים.

פרוטוקול זה הוא לבידוד תאים ראשוניים מגידול עכבר טרי. Lysates הוכן משיטה זו שימושי לחלבון, DNA וניתוח RNA. תאים סרטניים מהגידול השד הראשוני לעתים קרובות לשלוח גרורות למוח, הריאות ועצמות 1. כלול הוא טכניקה כדי לחלץ את הריאות לגילוי של גרורות. מכתים את הריאות עם כתם דיו יאפשר להדמיה של גושים סרטניים כפי שניתן לראות באיור 2. תיקון הריאות בפתרון Z-תיקון יאפשר לנו להפוך את הקטעים של ריאות, ואת הכתם עם נוגדנים המתאימים ללמוד מנגנונים גרורתי. כמו כן, נכלל הוא ...

גרורות הן השלב האחרון בהתקדמות סרטן השד 1. זה כרוך בסדרה של שלבים שבהם תאים ממאירים משתחררים מהגידול הראשוני ומופצים לאיברים אחרים 2. התאים חייבים להיות מסוגלים לעבור לתוך כלי הדם, לשרוד במחזור הדם, להתפשט לאיברים מרוחקים ולשרוד במערכת האיברים החדשה 3. כל שלב בגידול נשלט באופן הדוק על ידי תאים באמצעות שינויים גנטיים ואפיגנטיים שונים 4. כדי לחקור את המנגנונים של גידול סרטן השד, נעשה שימוש במערכות מודל עכברים בשל תוחלת החיים הקצרה, גודלן הקטן וזמן הרבייה המהיר שלהן. כמה יתרונות עיקריים של שימוש במודלים של עכברים בחקר הסרטן הם הדמיון המולקולרי והפיזיולוגי שהם חולקים עם בני אדם 5. 
קווי תאים מבוססים של עכברים ובני אדם שימשו באופן נרחב בחקר סרטן השד. למרות שאנו יכולים לקבל מידע על השלבים בגרורות באמצעות תאים אלה, מודלים של בעלי חיים שעברו מניפולציה גנטית עם מדכאי גידולים/אונקוגנים יתנו הרבה יותר מידע על התפתחות הגידול והגרורות החל מהשלב העוברי. לפיכך, בעזרת מודלים עכבריים אלה, אנו יכולים להשיג ויסות גנטי והתפתחותי של צמיחת הגידול. יתר על כן, המיקרו-סביבה של הגידול ממלאת גם תפקיד חשוב בביטוי הגנים של תאי הגידול וזה יכול להיות קשה לחקות את אותו תרחיש עם מחקרים המשתמשים בקווי תאים מבוססים. גידולי חלב אנושיים ראשוניים יכולים לשמש גם לחקר גידולי חלב של עכברים. החיסרון העיקרי בשימוש בגידולי שד מבודדים הוא שלגידול החדש שהושתל אין את כלי הדם ורקמת הלימפה של העכבר. בעוד שמערכות המודל הגנטי של העכברים לחקר גידולי שד יאפשרו לנו לעקוב אחר שלבי הגרורות, לנתח את המיקרו-סביבה של הגידול וגישה לכל הגוף 5.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לחקור גידולי שד בעכברים. ידוע כי סרטן השד שולח בדרך כלל גרורות למוח, לריאות ולעצמות. פרוטוקול זה מאפשר בידוד של תאי גידול שד ראשוניים, כמו גם חקר גרורות סרטן השד לריאות. יתר על כן, כלול פרוטוקול נוסף לניתוח פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) מעובר העכבר. יחד, טכניקות אלה שימושיות בחקר גידולי חלב של עכברים.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td>חנות ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life&nbsp; טכנולוגיות</td><td>25300-062</td><td>חנות ב &ndash; 20 & deg; C</td></tr><tr><td>קולגנאז סוג IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>חנות ב &ndash; 20 & deg; C</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>חנות ב &ndash; 20 & deg; C</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Life&nbsp; טכנולוגיות</td><td>15140-122</td><td>חנות ב-4 מעלות; </td></tr><tr><td>C סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td>חנות ב &ndash; 80 & deg; חנות C</td></tr><tr><td>Z-fix</td><td></td> <td>ANATECH#174</td><td>בחנות RT</td></tr><tr><td>India</td><td>Ink Yasutomo</td><td></td><td>בחנות RT</td></tr><tr><td>AERRANE (Isoflurane)</td><td>Baxter</td><td>NDC 10019-773-60</td><td>חנות</td></tr> בחנות RT <tr><td>אתנול</td><td>EMD</td><td>AX0441-3</td><td>בחנות RT</td></tr></tbody></table>

גידול ראשוני ובידוד תא mef לחקר ריאות גרורה

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

בגידול שד, השלב הגרורתי של המחלה מהווה את האיום הגדול ביותר על האדם הפגוע. לתאי שד נורמליים עם גנוטיפים משתנים יש כעת את היכולת לפלוש ולשרוד ברקמות אחרות. בפרוטוקול זה מסירים גידולי שד של עכברים ומכינים תאים ראשוניים מגידולים. התאים המבודדים מהליך זה זמינים לאחר מכן לניסויי פרופיל גנים. כדי לשלוח גרורות מוצלחות, תאים אלה חייבים להיות מסוגלים לעבור לתוך כלי הדם, לשרוד במחזור הדם, להתפשט לאיברים מרוחקים ולשרוד במערכת האיברים החדשה הזו. הריאות הן המטרה האופיינית לגרורות סרטן השד. התגלתה קבוצה של גנים המתווכים את הסלקטיביות של גרורות לריאות. כאן אנו מתארים שיטה לחקר גרורות ריאה ממודל עכבר מהונדס גנטית. יתר על כן, כלול פרוטוקול נוסף לניתוח פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) מעובר העכבר. תאי MEF מאותו סוג בעל חיים מספקים רמז לביטוי גנים של תאים שאינם סרטניים. יחד, טכניקות אלה שימושיות בחקר גידול חלב של עכברים, מנגנוני האיתות הקשורים אליו ומסלולי החריגות בעוברים.

שלב התקדמות גידול שבלהקריב בעלי החיים תלויים במחקר המסוים והנחיות IACUC. באיור 1 א, C57BL / 6 עכבר בן 100 יום עם וירוס גידול עכבר החלב Polyoma התיכון T-Antigen (MMTV-PyMT) הוקרב בשלושה חודשים. העור נפתח מאזור פתח השופכה לצוואר עם המספריים והעור היה מרותק כדי לאפשר גישה קלה לאיברים כפי שמוצגים באיור 1. זה אפשר גישה קלה לגידול שהושג באיור 1 ג. התאים הראשוניים המתקבלים מהגידולים הם דמיינו באיור 1D. מאז גנים רבים לתוו...

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור גידולי שד. בטכניקה זו מסירים גידולי שד של עכברים ומכינים תאים ראשוניים מגידולים. פרוטוקול מיצוי ריאות כלול לחקר גרורות ריאות. יתר על כן, כלול פרוטוקול נוסף לניתוח פיברובלסטים עובריים של עכברים מעובר העכבר.

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

המטרה הכללית של נוהל זה היא לחקור אגנזה של גידולי סרטן השד בעכברים. ראשית, מודגמת הכנת תאים ראשוניים מגידולי שד של עכברים. לאחר מכן, מוצגת הדרך להוצאת ריאת העכבר לצורך ויזואליזציה של גרורות בריאה.לבסוף, מוצגת הכנת פיברובלסטים עובריים של עכבר מעוברים של עכבר, שכן שיטות אלו מדגימות כי ניתן להשתמש בעכברים טרנסגניים לאנטיגן T אמצעי של נגיף הפוליומה של נגיף הגידולי השד של העכבר כדי לחקור את התפתחות גידולי סרטן השד. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי סרטן השד, ניתן להחילה אותה גם לחקירת גידולים מוצקים אחרים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן חשוב לבודד רק גידולים ולא רקמות אחרות במהלך שלבי בידוד הגידול. התחל בשימוש במספריים כדי לפתוח את העור מהפתח השופכני ועד לצוואר של עכבר טרנסגני לאנטיגן T אמצעי של נגיף הפוליומה של נגיף הגידולי השד של העכבר.לאחר מכן, קבעו את העור ובודדו את גידול העלה של בלוטת החלב. שטפו את הגידול in situ באמצעות PBS קר והניחו את הגידול בצלחת תרבית רקמה סטרילית של 10 סנטימטרים. כעת, העבירו את הצלחת למנדף זרימה למינרית סטרילי והשתמשו בלהב תער ובמספריים סטריליים כדי לקצוץ את הגידול לחתיכות של מילימטר מעוקב אחד.דגרו את החלקים עם collagenase על נדנדה בטמפרטורה של 37 °C. לאחר שעתיים, סבבו במהירות גבוהה (spin down) את תרחיף רקמת הגידול שהתקבל. שטפו את המשקע שלוש פעמים נוספות ב-PBS Resus, והשעיו את המשקע בשני milliliters של tripsin EDTA לאחר השטיפה האחרונה למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 °C תוך써ערור.לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים נוספות והשעיו אותם שוב בתוך מצע גידול רגיל. לבסוף, דגרו את התאים בצלחת תרבית רקמות של 10 סנטימטר, והחליפו את המצע מדי יום במשך שלושת הימים הבאים עד להשגת מספר התאים הרצוי. לפני הוצאת הריאה, הסירו את הכבד ואת הסרעפת והזיזו את הצלעות.לאחר מכן פתחו את החלק העליון של הקנה, סמוך לווריד הג'גולרי (jugular vein), והשתמשו בקטטר להזרקת החומר המתאים דרך הקנה למילוי הריאות; הוציאו את הריאות, ואם משתמשים ב-Z fix, טמנו את הרקמה בפרפין. אם משתמשים בדיו סינית (India ink), השאירו את הרקמה בתמיסת פיקסציה למשך חמש דקות; רקמת הריאה הנורמלית תופיע בצבע שחור בעוד שקשרי הגידול יופיעו בצבע לבן. סווגו כל קשרי גידול שנצפו באתרים משניים שקוטרם גדול או שווה ל-0.5 millimeters כגרורות ליצירת פיברובלסטים עובריים של עכבר.ראשית, פתחו את עורו של עכבר הרייה מפתח השופכה ועד לצוואר כפי שהודגם כעת, תוך הקפדה שלא להפריע לעוברים. לאחר מכן, הוציאו את קרני הרחם ושטפו אותן ב-PBS סטרילי. לאחר מכן, הפרידו בזהירות את העוברים מהשליה, אחד אחד.הניחו כל עובר בצלחת תרבית של 10 סנטימטר המכילה PBS קר מאוד. לאחר הסרת הראש, הכבד ומערכת העיכול, שטפו את חלקו הנותר של העובר בבאר אחת של פלטת תרבית רקמות בעלת 12 בארות המכילה PBS, וחתכו את הגוף לחתיכות של מילימטר מעקבי. העבירו לבאר אחרת המכילה חמישה מיליליטר של tripsin EDTA והדגירו את הרקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר חמש דקות, הוסיפו 1 ml של FBS כדי לעכב את העיכול. לאחר מכן, סבבבו (spin down) את תרחיף התאים שנוצר והשביו את המשקע (pellet). ב-1 ml של DMEM חמים, העבירו לבסוף את התאים לצלוחית תרבית של 10 ס"מ המכילה 10 ml של DMEM מועשר באנטיביוטיקה, וגדלו את התאים עד להשגת מספר התאים הרצוי.שלב התקדמות הגידול שבו יש להקריב את בעל החיים תלוי במחקר הספציפי ובהנחיות ה-I-A-C-U-C. לדוגמה, עכבר FVB בן 100 ימים עם אנטיגן T אמצעי של פוליאומה מווירוס גידולי הענף של העכבר הוקרב שלושה חודשים לאחר בידוד גידול בשד העכבר, כפי שהודגם זה עתה. תאי גידול ראשוניים הופקו.מכיוון שגנים רבים מתווכים גרורות של סרטן השד לריאות, הריאות הוצאו גם הן, כפי שהודגם זה עתה, כדי לחקור את תהליך הגרורה. לאחר מכן, הריאות נופחו באמצעות Z fix ונצבעו בדיו סיני (India ink) כדי להמחיש את קשרי הגידול. כאן מוצגים פיברובלסטים עובריים של עכבר, שבודדו מעוברי עכברים מזן FVB.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים תאי גידול ראשוניים מעכבר ופיברובלסטים עובריים של עכבר, וכיצד מחלצים ריאה של עכבר. זכרו כי עבודה עם ISO fluorine עלולה להיות מסוכנת ביותר, ולכן יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון עבודה תמידית תחת מנדף כימיים בעת ביצוע פרוצדורה זו.

primary-tumor-and-mef-cell-isolation-to-study-lung-metastasis

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מאמר זה מתאר את הנהלים של assay גרורות ניסיוני המשמש כדי לקבוע את פוטנציאל גרורתי של שורות תאים סרטניים אנושיים.

גרורה ניסויית Assay

בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול בידוד אוכלוסיות מטוהרים מאוד של leukocytes כי החודרים גידולים. פרוטוקול זה הוא עיבוד ביוטק Miltenyi בפרוטוקול כדי לשפר את התשואה וטוהר לבידוד תאים של רקמת הגידול מורכב.

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

נויטרופילים ממלאים תפקיד חשוב לא רק בהגנה על המארח מפני מיקרואורגניזמים פולשים, אלא גם מעורבים במעקב חיסוני אחר תאי גידול. כאן, אנו מתארים טכניקות הקשורות לבידוד נויטרופילים בעלי תכונות אנטי-גידוליות ושיטות לניטור תפקוד נויטרופילים נגד גידול במבחנה וב-vivo.

בידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניים

כתב יד זה מתאר שיטה לכמת הצטברות תאים גידול בריאות במודל חיה של גרורות הגידול.

ריאות הגידול תא גיוס Assay

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית עבור הדמיה vivo לשעבר החי של אינטראקציות תא-stroma הגידול בתוך גרורות ריאה, ניצול כתבים ניאון בעכברים. באמצעות מיקרוסקופ confocal ספינינג-דיסק, טכניקה זו מאפשרת הדמיה של תאים חיים לפחות 4 שעות ויכול להיות מותאם ללמוד תנאים ריאות דלקתיות אחרות.

Ex vivo הדמיה חיה של ריאות גרורה microenvironment שלהם

כאן אנו מתארים את המודל והגישה לחקר הפונקציות של מקרופאגים מכתשית ריאתית בגרורות סרטניות. כדי להדגים את תפקידם של תאים אלה בגרורות, נעשה שימוש במודל הסינגני (4T1) של סרטן השד בשילוב עם דלדול המקרופאגים המכתשית עם ליפוזומים קלודרונאטיים.

לומד את התפקיד של מכתשיים מקרופאגים סרטן שד גרור

מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של הפרוטוקול וזמינותו גרורות בריאות (פומה). מודל זה מאפשר לחוקרים ללמוד אוסטאוסרקומה גרורתי (OS) גידול תאים של רקמת הריאה באמצעות קרינה פלואורסצנטית widefield או מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

במודל חיה יש צורך לפענח את התפקיד של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) בקידום קולוניזציה ריאות במהלך גרורות סרטן. . הנה, הקמנו, לבצע בהצלחה של ויוו assay לבדוק באופן ספציפי את הדרישה של הרכבה fibronectin פולימריים (polyFN) על CTCs ריאות קולוניזציה.

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

כאן, אנו מציגים עבור ex-vivo ריאות סרטן מודל מחקה את השלבים של התקדמות הגידול ומסייעת לבודד גידול ראשוני, פרוטוקול מחזורי תאים סרטניים נגעים גרורתי.

דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

מאמר זה נועד לספק פרוטוקול לבידוד ותרבות של פיברובלסטים הקשורים לסרטן ראשוני ממודל מורין סינגני של סרטן שד טריפל שלילי ויישומה למחקר פרה-אקליני של חלקיקים חדשניים שנועדו למקד את המיקרו-סביבה של הגידול.

בידוד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן ראשוני ממודל מורין סינגני של סרטן השד לחקר חלקיקים ממוקדים

אנו מציגים שיטה לחקר הפצה מחדש של תאי גידול מגרורות ריאה הכוללת פרוטוקול כירורגי להמרה סלקטיבית של גרורות ריאה, ולאחר מכן זיהוי תאי גידול מחודשים באיברים שלישוניים.

מעקב אחר הפצת תאי גידול מגרורות ריאה באמצעות פוטו-המרה

למד כיצד לבודד תאים ראשוניים מגידולי שד בעכברים ולהכין פיברובלסטים עובריים לחקר תהליכי גרורה בריאות. שיטות אלו מסייעות בחקר מנגנוני התפתחות סרטן השד ובהבנת ביולוגיית הגידול.

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

גלה סרטונים נוספים