גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה
20 במאי 2015
מטרת פרוטוקול זה היא לחקור גידולי שד. בטכניקה זו מסירים גידולי שד של עכברים ומכינים תאים ראשוניים מגידולים. פרוטוקול מיצוי ריאות כלול לחקר גרורות ריאות. יתר על כן, כלול פרוטוקול נוסף לניתוח פיברובלסטים עובריים של עכברים מעובר העכבר.
המטרה הכללית של נוהל זה היא לחקור אגנזה של גידולי סרטן השד בעכברים. ראשית, מודגמת הכנת תאים ראשוניים מגידולי שד של עכברים. לאחר מכן, מוצגת הדרך להוצאת ריאת העכבר לצורך ויזואליזציה של גרורות בריאה.
לבסוף, מוצגת הכנת פיברובלסטים עובריים של עכבר מעוברים של עכבר, שכן שיטות אלו מדגימות כי ניתן להשתמש בעכברים טרנסגניים לאנטיגן T אמצעי של נגיף הפוליומה של נגיף הגידולי השד של העכבר כדי לחקור את התפתחות גידולי סרטן השד. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי סרטן השד, ניתן להחילה אותה גם לחקירת גידולים מוצקים אחרים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן חשוב לבודד רק גידולים ולא רקמות אחרות במהלך שלבי בידוד הגידול. התחל בשימוש במספריים כדי לפתוח את העור מהפתח השופכני ועד לצוואר של עכבר טרנסגני לאנטיגן T אמצעי של נגיף הפוליומה של נגיף הגידולי השד של העכבר.
לאחר מכן, קבעו את העור ובודדו את גידול העלה של בלוטת החלב. שטפו את הגידול in situ באמצעות PBS קר והניחו את הגידול בצלחת תרבית רקמה סטרילית של 10 סנטימטרים. כעת, העבירו את הצלחת למנדף זרימה למינרית סטרילי והשתמשו בלהב תער ובמספריים סטריליים כדי לקצוץ את הגידול לחתיכות של מילימטר מעוקב אחד.
דגרו את החלקים עם collagenase על נדנדה בטמפרטורה של 37 °C. לאחר שעתיים, סבבו במהירות גבוהה (spin down) את תרחיף רקמת הגידול שהתקבל. שטפו את המשקע שלוש פעמים נוספות ב-PBS Resus, והשעיו את המשקע בשני milliliters של tripsin EDTA לאחר השטיפה האחרונה למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 °C תוך써ערור.
לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים נוספות והשעיו אותם שוב בתוך מצע גידול רגיל. לבסוף, דגרו את התאים בצלחת תרבית רקמות של 10 סנטימטר, והחליפו את המצע מדי יום במשך שלושת הימים הבאים עד להשגת מספר התאים הרצוי. לפני הוצאת הריאה, הסירו את הכבד ואת הסרעפת והזיזו את הצלעות.
לאחר מכן פתחו את החלק העליון של הקנה, סמוך לווריד הג'גולרי (jugular vein), והשתמשו בקטטר להזרקת החומר המתאים דרך הקנה למילוי הריאות; הוציאו את הריאות, ואם משתמשים ב-Z fix, טמנו את הרקמה בפרפין. אם משתמשים בדיו סינית (India ink), השאירו את הרקמה בתמיסת פיקסציה למשך חמש דקות; רקמת הריאה הנורמלית תופיע בצבע שחור בעוד שקשרי הגידול יופיעו בצבע לבן. סווגו כל קשרי גידול שנצפו באתרים משניים שקוטרם גדול או שווה ל-0.5 millimeters כגרורות ליצירת פיברובלסטים עובריים של עכבר.
ראשית, פתחו את עורו של עכבר הרייה מפתח השופכה ועד לצוואר כפי שהודגם כעת, תוך הקפדה שלא להפריע לעוברים. לאחר מכן, הוציאו את קרני הרחם ושטפו אותן ב-PBS סטרילי. לאחר מכן, הפרידו בזהירות את העוברים מהשליה, אחד אחד.
הניחו כל עובר בצלחת תרבית של 10 סנטימטר המכילה PBS קר מאוד. לאחר הסרת הראש, הכבד ומערכת העיכול, שטפו את חלקו הנותר של העובר בבאר אחת של פלטת תרבית רקמות בעלת 12 בארות המכילה PBS, וחתכו את הגוף לחתיכות של מילימטר מעקבי. העבירו לבאר אחרת המכילה חמישה מיליליטר של tripsin EDTA והדגירו את הרקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר חמש דקות, הוסיפו 1 ml של FBS כדי לעכב את העיכול. לאחר מכן, סבבבו (spin down) את תרחיף התאים שנוצר והשביו את המשקע (pellet). ב-1 ml של DMEM חמים, העבירו לבסוף את התאים לצלוחית תרבית של 10 ס"מ המכילה 10 ml של DMEM מועשר באנטיביוטיקה, וגדלו את התאים עד להשגת מספר התאים הרצוי.
שלב התקדמות הגידול שבו יש להקריב את בעל החיים תלוי במחקר הספציפי ובהנחיות ה-I-A-C-U-C. לדוגמה, עכבר FVB בן 100 ימים עם אנטיגן T אמצעי של פוליאומה מווירוס גידולי הענף של העכבר הוקרב שלושה חודשים לאחר בידוד גידול בשד העכבר, כפי שהודגם זה עתה. תאי גידול ראשוניים הופקו.
מכיוון שגנים רבים מתווכים גרורות של סרטן השד לריאות, הריאות הוצאו גם הן, כפי שהודגם זה עתה, כדי לחקור את תהליך הגרורה. לאחר מכן, הריאות נופחו באמצעות Z fix ונצבעו בדיו סיני (India ink) כדי להמחיש את קשרי הגידול. כאן מוצגים פיברובלסטים עובריים של עכבר, שבודדו מעוברי עכברים מזן FVB.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים תאי גידול ראשוניים מעכבר ופיברובלסטים עובריים של עכבר, וכיצד מחלצים ריאה של עכבר. זכרו כי עבודה עם ISO fluorine עלולה להיות מסוכנת ביותר, ולכן יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון עבודה תמידית תחת מנדף כימיים בעת ביצוע פרוצדורה זו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטות לבדיקה של תהליכי תומורגנזה בשחלה בעכברים. הוא כולל טכניקות להכנת תאים ראשוניים מגידולי העשן של העכבר והוצאת רקמת ריאה לבדיקת גרורות.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- מחקר על סרטן השד
- אונקולוגיה
- מודלים של עכברים טרנסגניים
רקע
- סרטן השד הוא גורם מוביל למוות הקשור לסרטן.
- הבנת התהליך התורטמורגני (tumorigenesis) חיונית לפיתוח טיפולים יעילים.
- מודלים של עכברים חיוניים לחקר הביולוגיה של הסרטן.
- עכברים טרנסגניים יכולים לספק תובנות לגבי מנגנוני סרטן ספציפיים.
מטרת המחקר
- לחקור את התהליך התומוריגני של סרטן השד באמצעות מודלים של עכברים.
- לנתח גרורות בריאות הקשורות לגידולי שד.
- להכין פיברובלסטים עובריים של עכבר למחקרים המשכיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תאים ראשוניים מגידולי שד של עכבר.
- פרוטוקול לחילוץ ריאות לצורך הדמיה של גרורות.
- בידוד פיברובלסטים עובריים של עכבר מעוברים.
- שימוש בעכברים טרנסגניים המבטאים את האנטיגן polyoma middle T.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של תאי מקור מגידולי שד.
- הדגמה של טכניקה יעילה להוצאת ריאות.
- השגת הכנה של פיברובלסטים עובריים.
- ניתן ליישם את השיטות למחקר של גידוליים מוצקים אחרים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק תובנות בעלות ערך לגבי הביולוגיה של סרטן השד.
- ניתן להתאימה את השיטות למגוון יישומים במחקר סרטן.
- הדגמה ויזואלית משפרת את ההבנה של הטכניקות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
בידוד תאי גידול ראשוניים ופיברובלסטים עובריים של עכבר (MEFs) ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית מאפשר בחינה מכניסטית של התקדמות גרורתית, ובמיוחד של התנחלות בריאות בסרטן הש স্তים. זרימת עבודה זו תומכת בביטחון ניבוי בתיקוף מטרות ובניתוח מסלולים עבור גרורות, ומספקת מידע ישיר לנקודות השבחה במחקר תרגומי ובשלבי הגילוי המוקדמים. הגישה מספקת פלטפורמה לשימוש חוזר עבור פרופיל גנים ומחקרים השוואתיים בין אוכלוסיות של תאי גידול ותאים שאינם תאי גידול.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ניתוח תפקודי של גנים המתווכים גרורות ספציפיות לאיבר, ובכך תומך בתיקוף של מטרות טיפוליות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי השוואת פרופילי ביטוי גנים של גידולים לעומת רקמות שאינן גידוליות.
- תומך במחקרים מונחי-השערה על סלקטיביות גרורתית ומסלולי התקדמות הגידול.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק אוכלוסיות מאושרות של גידול ראשוני ותאי MEF עבור בדיקות פרופילינג של גנים בהמשך התהליך.
- מאפשר הכנה הדירה של חומר ביולוגי עבור ניתוחים כמותיים והשוואתיים.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי בידוד סוגי תאים מוגדרים ממודלים עקביים גנטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה לצורך חקר פיזור גרורתי לריאה.
- מאפשר רציפות משלב אפיון גנים בשלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני של גורמים מניעים לגרורות.
- תומך בהקדמה מותאמת סיכון על ידי הבהרת מסלולים המעורבים בגרורות ספציפיות לאיבר.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת בידוד של תאי גידול ראשוניים ותאי בקרה למחקרי ביטוי גנים וגרורות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על מנגנוני גרורות ותפקודי גנים in vivo.
- סריקה: מספק מקורי תאים הניתנים לשחזור עבור פרופיל גנים כמותי ובדיקות השוואתיות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של הבדלים בביטוי גנים בין תאי גידול לתאי MEF, דבר המקדם ניתוח של מסלולים ביולוגיים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תוצרי פרופיל גנים למודלים פרה-קליניים של גרורות ריאה.
- שימוש חוזר ארגוני: קובע זרימת עבודה סטנדרטית לבידוד תאים ראשוניים ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באישור של מטרות גרורתיות ובבירור של מסלולים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מספק פרוטוקולים סטנדרטיים וניתנים לשחזור לבידוד תאים, לצורך השוואה בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשכיות הפרויקט (go/no-go) על ידי הבהרת מנגנונים גרורתיים ותפקוד גנים.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעוד ותיעדוף מותאם סיכון של מטרות ומסלולים גרורתיים לצורך פיתוח והמשך מחקר.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בעכברים, בניתוח רקמות ובטכניקות סטריליות של תרביות תאים.
- נדרשת גישה למושבות של עכברים טרנסגניים ולתשתית מתאימה לתרביות רקמה ולניתוח.
- נדרש סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח הדירות בבידוד תאים ובבדיקות המשך.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מודלים שונים של גידולים או מחקרים של גרורות ספציפיות לאיבר.
- מגבלות מעשיות כוללות שיקולי רווחת בעלי חיים ואופטימיזציה של הפרוטוקול עבור שאלות מחקר ספציפיות.
