Name: זיהום חיידקים מערכתי וחיסון ביטחון פנוטיפים ב דרוזופילה melanogaster (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: למד שיטה לזיהום חיידקי מערכתי ב-Drosophila melanogaster באמצעות ננו-אינג'קטור או דקירה ספטית. מדוד עומס חיידקי, תמותה ותגובת חיסון כדי לחקור גורמים גנטיים וסביבתיים המשפיעים על תפקוד החיסון הטבעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות לכל מעבדת לזרו, ובמיוחד לסוזן רוטשייפר, על עזרתם הן בסקירה והן בבדיקה של פרוטוקולים אלה. זה תוצר של המומחיות המצטברת שלהם. העבודה במעבדת לזארו נתמכת על ידי מענקים R01 AI083932 ו-R01 AI064950 מהמכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב.

<ol><li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual review of immunology. 25, 697-743 (2007).</li>
<li>Dionne, M. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+infectious+diseases+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Models of infectious diseases in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Disease models & mechanisms. 1 (1), 43-9 (2008).</li>
<li>Rutschmann, S., Jung, A. C., Hetru, C., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Ferrandon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rel+protein+DIF+mediates+the+antifungal+but+not+the+antibacterial+host+defense+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The Rel protein DIF mediates the antifungal but not the antibacterial host defense in Drosophila.</a> Immunity. 12 (5), 569-580 (2000).</li>
<li>Ayres, J. S., Freitag, N., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Drosophila+mutants+altering+defense+of+and+endurance+to+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of Drosophila mutants altering defense of and endurance to Listeria monocytogenes infection.</a> Genetics. 178 (3), 1807-1815 (2008).</li>
<li>Cronin, S. J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+identifies+genes+involved+in+intestinal+pathogenic+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen identifies genes involved in intestinal pathogenic bacterial infection.</a> Science. 325 (5938), 340-343 (2009).</li>
<li>Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+Drosophila+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to study Drosophila immunity.</a> Methods. , (2014).</li>
<li>Dionne, M. S., Pham, L. N., Shirasu-Hiza, M., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+and+FOXO+dysregulation+contribute+to+infection-induced+wasting+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+CB%22%5BJournal%5D)">Akt and FOXO dysregulation contribute to infection-induced wasting in Drosophila.</a> Current biology CB. 16 (20), 1977-1985 (2006).</li>
<li>McKean, K. a, Yourth, C. P., Lazzaro, B. P., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+costs+of+immunological+maintenance+and+deployment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+evolutionary+biology%22%5BJournal%5D)">The evolutionary costs of immunological maintenance and deployment.</a> BMC evolutionary biology. 8 (1), 76(2008).</li>
<li>Kuo, T. -H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+triggered+by+an+immune+response+in+Drosophila+is+regulated+by+the+circadian+clock+and+requires+the+NFkappaB+Relish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish.</a> BMC neuroscience. 11, 17(2010).</li>
<li>Panayidou, S., Ioannidou, E., Apidianakis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pathogenic+bacteria%2C+fungi%2C+and+viruses+in+Drosophila%3A+disease+modeling%2C+lessons%2C+and+shortcomings%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Human pathogenic bacteria, fungi, and viruses in Drosophila: disease modeling, lessons, and shortcomings.</a> Virulence. 5 (2), 253-269 (2014).</li>
<li>Keebaugh, E. S., Schlenke, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+natural+host%E2%80%93parasite+interactions%3A+The+Drosophila+model%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights from natural host–parasite interactions: The Drosophila model.</a> Developmental & Comparative Immunology. 42 (1), 111-123 (2014).</li>
<li>Howick, V. M., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+and+diet+shape+resistance+and+tolerance+across+distinct+phases+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+evolutionary+biology%22%5BJournal%5D)">Genotype and diet shape resistance and tolerance across distinct phases of bacterial infection.</a> BMC evolutionary biology. 14 (1), 56(2014).</li>
<li>Babin, A., Kolly, S., Kawecki, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+bacterial+infection+improves+aversive+learning+performance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+behavior%2C+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Virulent bacterial infection improves aversive learning performance in Drosophila.</a> Brain, behavior, and immunity. , (2014).</li>
<li>Chambers, M. C., Song, K. H., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+infection+causes+metabolic+shifts+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes infection causes metabolic shifts in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 7 (12), e50679(2012).</li>
<li>Fellous, S., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+food+quality+affects+adult+%28but+not+larval%29+immune+gene+expression+independent+of+effects+on+general+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+ecology%22%5BJournal%5D)">Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition.</a> Molecular ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).</li>
<li>Stone, E. F., Fulton, B. O., Ayres, J. S., Pham, L. N., Ziauddin, J., Shirasu-Hiza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+protein+timeless+regulates+phagocytosis+of+bacteria+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila.</a> PLoS pathogens. 8 (1), e1002445(2012).</li>
<li>Chambers, M. C., Jacobson, E., Khalil, S., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thorax+injury+lowers+resistance+to+infection+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Thorax injury lowers resistance to infection in Drosophila melanogaster.</a> Infection and immunity. , (2014).</li>
<li>Rich, J. T., Neely, J. G., Paniello, R. C., Voelker, C. C. J., Nussenbaum, B., Wang, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+understanding+Kaplan-Meier+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology--head+and+neck+surgery+official+journal+of+American+Academy+of+Otolaryngology-Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">A practical guide to understanding Kaplan-Meier curves.</a> Otolaryngology--head and neck surgery official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 143 (3), 331-336 (2010).</li>
<li>Freeman, W. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSokal%2C+RR+%22Biometry%22">Biometry</a>. , (1995).</li>
<li>Frydman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+bacterial+infection+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Wolbachia bacterial infection in Drosophila.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (2), 158(2007).</li>
<li>Kuo, T. -H., Handa, A., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+the+immune+response+and+sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of the immune response and sleep in Drosophila.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (70), e4355(2012).</li>
<li>Vodovar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+host+defense+after+oral+infection+by+an+entomopathogenic+Pseudomonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila host defense after oral infection by an entomopathogenic Pseudomonas species.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (32), 11414-11419 (2005).</li>
<li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+bacterial+intestinal+infections+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster.</a> PLoS pathogens. 3 (11), e173(2007).</li>
<li>Jaenike, J., Polak, M., Fiskin, A., Helou, M., Minhas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecific+transmission+of+endosymbiotic+Spiroplasma+by+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Interspecific transmission of endosymbiotic Spiroplasma by mites.</a> Biology. 3 (1), 23-25 (2007).</li>
<li>Kanbar, G., Engels, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+bacterial+infection+of+wounds+in+honey+bee+%28+Apis+mellifera%29+pupae+punctured+by+Varroa+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and bacterial infection of wounds in honey bee ( Apis mellifera) pupae punctured by Varroa mites.</a> Parasitology research. 90 (5), 349-354 (2003).</li>
</ol>

לאף אחד מהכותבים אין אינטרסים מתחרים או אינטרסים מנוגדים.

ההליך המתואר כאן מניב זיהום איכות קפדנית וגבוה של תסיסנית melanogaster. דוגמאות מאוירות התמקדו בעיקר בזיהום עם Providencia rettgeri וא coli, אך הפרוטוקול הוא ישים מאוד ויכול להיות מיושם לזיהומים בחיידקים שונים על פני טווח של תנאי גידול מארח ותחזוקה. הפרטים של גישה ניסויית אופטימלית יהיו תלויים בחיידק המשמש לזיהום, גנוטיפ של המארח, ותנאי ניסוי הכוללים. מומלץ מאוד למבחן טייס כל תנאי ניסוי חדשים לפני ביצוע פרויקטים שאפתניים יותר. נקודת התחלה טובה היא לבדוק שלוש מנות זיהום על פני טווח של פי 100. מאוד פתוגנים ארסיים לעתים קרובות הציגו הטוב ביותר במינונים נמוכים מאוד מדבקים, בסדר הגודל של 10-100 תאי חיידקים לזבוב. ניתן להזריק פתוגנים מתונים יותר במינונים גבוהים יותר של כ -1,000 חיידקים לfly, ולא פתוגנים ניתן להזריק במינונים גבוהים כמו 10,000 חיידקים לזבוב. זה לעתים קרובות מאלף להגדיר קינטיקה של זיהומי רומן על ידי מעקב עומס הפתוגן, תמותת מארח, ופעילות מערכת חיסונית על סדרת אורך זמן. בגלל מדידה של עומס הפתוגן וביטוי גני המארח הם מבחני הרסניים, יש צורך להדביק זבובים שונים בתחילת הניסוי עבור כל נקודת זמן שיימדד. כאשר מחליטים אם להשתמש בדקירת סיכה או הזרקה מבוססת microcapillary, חשוב לשים לב שיש יתרונות ומגבלות לכל גישה. הזרקת נימים מציגה נפח של נוזל לתוך הזבוב, ששניהם בצניעות מגביר לחצו טורגור ומציג מלחים או מולקולות אחרות שמושעות או מומסים במנשא. הזרקת נימים דורשת גם גישה למתקן הזרקה או רכישה של הציוד הנדרש. דקירת סיכה ספיגה לא דורשת ציוד מיוחד ומציגתקשורת זניחה לזבוב, והוא בדרך כלל יעילה יותר להדבקת מספר גדול של זבובים. עם זאת, זיהומי דקירת סיכה אינם מאפשרים שליטה המדויקת במינון זיהום שניתן להשיג עם הזרקת נימים. הפרוטוקול הנוכחי התמקד במנגנון הזרקה מכאנית שמסדיר עוצמת זריקה, אבל יש גם מערכות הזרקה מבוססת על פעימות של אוויר דחוס בדידות. 20,21 אלה הם בדרך כלל יקרים יותר מאשר מנגנון ההשתתפות כאן ודורשים כיול של דופק האוויר לכל מחט כדי להבטיח כרכי הזרקה עקביים. יש ויכוח רב אבל מעט מאוד נתונים על איך הזבובים להיות מערכתי נגועים בחיידקים בטבע. חוקרים אחדים להניח שרוב הזיהומים טבעיים להתרחש כאשר תסיסנית לבלוע חיידקים פתוגניים והחיידקים לאחר מכן הצליחו להימלט הבטן להקים זיהום מערכתי. עם זאת, יש פה מאודחיידקי w הידועים כדי להיות מסוגלים לחצות את בטנו של ד &#39; melanogaster, ואלה שיש לי יכולת זו שהם קטלני ביותר לזבובי 22,23. תאוריה חלופית היא שטס באופן קבוע לקיים פציעות cuticular דרך בריחה מניסיונות טריפה נכשלו או התקפה על ידי קרדית ectoparasitic. השערה זו נתמכת על ידי האוסף התכוף של ד הפראי melanogaster נושאות כתמי melanization שמעידים על פצעים הגלידו (תצפיות לא פורסמו). קרדית הוכח להעביר זיהומים חיידקיים בדרוזופילה 24 ופצעים שהותירו קרדית יכולים להיות נגועים באופן משני על ידי חיידקים בדבורים דבש 25. עם זאת, התדירות בטבע של זיהום מונע קרדית או אחר האופורטוניסטי של ד melanogaster דרך פרצות ציפורן אינו ידוע. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר הקדמה של חיידקים ישירות לתוך hemolymph באמצעות הזרקה כמותיים שעוקף כל מחסומי אפיתל או אימונוגלובולינ התנהגותאינסופיות. שיטות האכלה חיידקים פתוגניים לד melanogaster תוארו בVodovar et al. 22 וNehme et al. 23. חיידקי entomopathogenic רבים מהווים סיכון לבריאות אדם קטן או לא, מאפשרים לחוקרים לעבוד איתם בנוחות. יתר על כן, יש מעט מאוד חיידקים היכולת להדביק תסיסנית על קשר ללא התערבות ניסיונית, כך הסיכון של התפשטות &quot;מגיפה&quot; של זיהום חיידקים דרך מעבדה באמצעות משטחים מזוהמים או נמלטו זבובים הוא בדרך כלל נמוך מאוד. עם זאת, מומלץ לוודא שצעדי בלימה הולמים נמצאים במקום כדי למנוע זבובים נגועים לברוח ולתפוס מחדש לכל נמלט זבובים. המעבדה צריכה להיות לבוש ברמת בטיחות ביולוגית בקנה אחד עם זו של פתוגנים בשימוש, ושיטות עבודה מומלצות סטנדרטית במיקרוביולוגיה צריכה להיות מועסקות. Infecti הניסיוניבשיטה המתוארת כאן מאפשר זיהומים של דרוזופילה melanogaster עם כל מינון של כל חיידק שרירותי. ברגע שהזיהום כבר נקבע, זה פשוט למדוד את קינטיקה של התפשטות או אישור חיידקים, כדי לעקוב אחר תמותת מארח, וassay אינדוקציה של המערכת החיסונית המארח. בקלות יכולים להיות נתונה זבובים נגועים למבחני פנוטיפי אחרים, כוללים בדיקות של תפקודים פיסיולוגיים שעשויות לעצב או להיות מעוצב על ידי הזיהום. הנהלים המתוארים הם זולים, דורשים ציוד מיוחד קטן יחסית, והם בקלות למדו, מה שהופך אותם נוחים לשימוש בפרויקטים מגוונים ברחבי לרוחבה של מעבדות מחקר והוראה.

זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster הוא אחד יצורים המודל המוביל ללימוד הפונקציה והאבולוציה של הגנה חיסונית. דרוזופילה הם זולים וקלים לאחוריים, הם נוחים מאוד למניפולציה ניסויית, ומגובים על ידי קהילה מדעית נרחבת שהתפתחה רחב מערך של כלי מחקר. היבטים של חסינות מולדת רבים נשמרים בין חרקים ויונקים, כוללים העברת אותות בתיווכו של קולטני-כמו אגרה וגורמי שעתוק משפחת NF-kB, איתות JAK / STAT, ותגובות מסלול JNK. 1,2 הפונקציה של גנים והמסלולים יכולים אלה תשאול בד melanogaster באמצעות מוטציות או RNAi knockdowns פעילויות עלייה או ירידת מסלול ש-- 3. 6 בנוסף, תסיסנית יכולה לשמש כדי לחקור את ההשלכות הפיזיולוגיות של זיהומים ומחלות, כולל בהקשר של תאוריה האבולוציונית היסטורית חיים 7.- 9 כל המחקרים כאלה, לעומת זאת, תלויים ביכולת להדביק באופן מהימן זבובים ניסיוניים בתנאי טיפול מוגדרים. ההליך המתואר כאן מציג מסגרת המתודולוגית להעברת זיהומים חיידקיים חזקים ודיר לתסיסנית melanogaster ולאחר מכן מדידת חומרת זיהום וכימותי התגובה החיסונית המארח. תסיסנית יכולה להיות נגועה באופן טבעי וניסיוני על ידי מגוון רחב של טפילים ופתוגנים, כוללים חיידקים, פטריות, וירוסים, נמטודות וצרעות טפילות. הפרוטוקול הנוכחי מתמקד באספקת זיהום חיידקים מערכתי. חיידקים רבים ושונים יכולים לשמש כדי להדביק זבובים, והבחירה של הנסיין צריכה להיות מבוססת על השאלות המדעיות המדויקות שבקשה. לדוגמא, המבודדים קלינית בבני אדם יכול להיות מועסק ללמוד מנגנוני אלימות של חיידקי 10, או מבחינה אקולוגית מבודדים רלוונטיים עשוי להיות preferreד למחקר האבולוציוני. 11 חיידקים חלקם פתוגנים המוסמכים של ד melanogaster, מתרבים על זיהום וגרימת מחלה מארח או מוות. חיידקים אחרים מנוהלים ביעילות על ידי המערכת החיסונית המארח ופינו תוך כמה ימים. בהפגנה זו, rettgeri Providencia ישמש כמחולל מחל שגשוג שיכול לגרום לתמותת מארח ונמשך במארחים ששרדו. Coli Escherichia ישמש כאינו פתוגן שאינו מסומנת על ידי המערכת החיסונית המארח. זיהום יוקם על ידי הקדמה של חיידקים ישירות לתוך חלל הגוף של הזבוב. גישה זו עוקפת מחסומי אפיתל והתנהגויות מגוננות, המאפשרת חקירה של זיהום מערכתי ללא קשר למצב הטבעי של שידור. קיימות שתי שיטות עיקריות לניסוי הקמת זיהום מערכתי. בתחילה, מחטי nanoinjector ונימי זכוכית משך משמשות להזריק מספרם מדויק שלחיידקים לזבוב. לשיטה זו היתרונות של מאפשר טווח דינמי גדול של מנות זיהום ולהיות כמותית הדיר מאוד. הגישה השנייה היא לספק זיהום עם דקירת סיכה ספיגה. גישה זו יש יתרונות של להיות מהירים ואינו דורשים ציוד מיוחד. ברגע שהזיהומים הוקמו, הוא הופך להיות אפשרי למדוד עומס מערכתי הפתוגן, תמותת מארח, ופעילות מערכת חיסון מושרה. כמובן, כל מספר של פנוטיפים נוספים יכול להעלות על הדעת להימדד בד הנגוע melanogaster, כולל פוריות 12, יכולת למידה לאחר זיהום 13, מצב המטבולי 14, או כמעט כל תכונה אחרת שאפשר להעלות על דעת.

<table><tbody><tr><td>Incubator</td><td>Powers Scientific, Inc</td><td>DROS52SD</td><td></td></tr><tr><td>מכחול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צבע CO2 Flypads</td><td>FlyStuff</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD FG50</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila rearing mix&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 גרם בקבוקים תחתונים מרובעים, פוליפרופילן</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>כדורי כותנה גדולים במיוחד Nosterile</td><td>מותג פישר</td><td>22-456-882</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס תאגיד</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני דרוזופילה פוליסטירן</td><td>VWR בינלאומי</td><td>89092-720</td><td></td></tr><tr><td>כדורי כותנה גדולים נוסטריליים</td><td>מותג פישר</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק 2 ליטר</td><td>VWR international</td><td>89000-370</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי עם מכסים שקופים, רכס מוגבה; 100 x 15 מ"מ;</td><td>VWR international</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Innoculing Loop</td><td>VWR international</td><td>80094-488</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Clasic Pipettes בגדלים שונים 0.1 & micro; l עד 2 ומיקרו; l, 2 ומיקרו; l עד 20 ומיקרו; l, 20 ומיקרו; l עד 200 ומיקרו; l, 100 ומיקרו; l עד 1,000 ומיקרו; l</td><td>Rainin</td><td>PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000</td><td></td></tr><tr><td>קצות מיקרופיפטה (גדלים שונים)</td> <td>VWR international</td><td>30128-376 53503-810 16466-008</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth Base, Miller</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תרבית חד פעמיים זכוכית בורוסיליקט</td><td>VWR international</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>S-500 Orbital שייקר</td><td>VWR בינלאומי</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>VWR בינלאומי</td><td>37001-300</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 10X</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 ספקטרופוטומטר</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>חצי מיקרונפח Cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>חולץ נימי אנכי</td><td>מחט Kopf חולץ</td><td></td><td></td>פיפטה</tr><tr><td>3.5 אינץ' נימי זכוכית חלופיים עבור Nanojet II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי, לבן,</td><td>בהיר מקרון Fine Chemicals</td><td>6358-10</td><td></td></tr><tr><td>פיני Minutein Fine</td><td>Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל&nbsp; צינורות מיקרוצנטריפוגה; סיל רייט</td><td>ארה"ב סיינטיפיק בע"מ</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>עלי ממונע; Talboys מעבדה Stirrer</td><td>Troemner</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>Talboys הומוגנייזר תפוקה גבוהה</td><td>OPS Diagnostics</td><td>930145</td><td></td></tr><tr><td>5/32 אינץ' כדורי שחיקה</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 156-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>Scientific indurstries inc.</td>פיפטור רב-ערוצי <td>G560</td><td></td></tr><tr><td>(10 &mu; l - 300 &mu; l)</td> <td>Sartorius</td><td>730360</td><td></td></tr><tr><td>WASP2 Whitley פלטת ספירלה אוטומטית</td><td>מיקרוביולוגיה בינלאומית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProtoCOL מונה מושבה אוטומטי / מונה צלחות/ קורא צלחות&nbsp;</td><td>מיקרוביולוגיה בינלאומית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>צינורות qPCR; רצועות 8 שפופרות בפרופיל נמוך של 0.2 מ"ל</td><td>Bio-Rad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>qPCR; רצועות אופטיות שטוחות 8 כובעים</td><td>Bio-Rad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNase ללא RNase</td><td>Promega</td><td>m610a</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>Promega</td><td>m170b</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1240</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; SsoAdvanced SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5260</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect מערכת זיהוי PCR בזמן אמת</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5200</td><td></td></tr><tr><td>RNasin מעכב ריבונוקלאז</td><td>Promega</td><td>N2115</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהום חיידקים מערכתי וחיסון ביטחון פנוטיפים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster הוא אחד יצורים המודל המוביל ללימוד הפונקציה והאבולוציה של הגנה חיסונית. היבטים של חסינות מולדת רבים נשמרים בין חרקים ויונקים, ומאז תסיסנית יכולה בקלות להיות מניפולציות גנטית וניסיוני, הם רבי עוצמה ללימוד תפקוד מערכת חיסונית ואת ההשלכות הפיזיולוגיות של מחלה. ההליך הפגין כאן מאפשר זיהום של זבובים על ידי הקדמה של חיידקים ישירות לתוך חלל הגוף, תוך עקיפת מחסומי אפיתל וצורות פסיביות יותר של הגנה ומאפשר התמקדות בזיהום מערכתי. ההליך כולל פרוטוקולים לשיעורי תמותה של מדידת מארח, עומס הפתוגן מערכתי, ותואר של אינדוקציה של המערכת החיסונית המארח. הליך זיהום זה הוא זול, חזק וכמותית הדיר, וניתן להשתמש בו במחקרי גנטיקה תפקודית, ההיסטוריה האבולוציונית חיים, ופיזיולוגיה.

סעיף זה ממחיש תוצאות שניתן להשיג לאחר זיהום חיידקים של תסיסנית melanogaster. איור 1 מראה כי מינון זיהום משתנה עם צפיפות אופטית של ההשעיה חיידקים המשמשת להזרקה, וכי המינון נמסר ניתן לאמוד באופן מהימן על ידי homogenizing וציפוי עף מייד לאחר הזרקה . כפי שמודגם באיור 2, פתוגנים שונים יכולים לגרום לרמות של תמותת מארח (איור 2 א) ותמותת מארח שונות יכול להיות תלוי מינון (איור 2). חשוב לציין, פרוטוקול זה מאפשר לסוגים שונים של זיהומים שיושגו: rettgeri Providencia יכול לגרום לזיהום כרוני, תת-קטלני שנמשך במשך 20 ימים או (איור 3 א) ארוכים יותר. עם זאת, חיידקים אחרים כמו coli Escerichia יהיו בעיקר להיות מסומנות על ידי זבוב המארח בתוך שש שעות לאחר פגיעה (איור 3). אינדוקציה של sys חיסוניTEM ניתן לאמוד באמצעות בידוד RNA וqRT-PCR הבא של תמלילי אנטיבקטריאלי פפטיד (איור 4 א &#39;וב&#39;). באנלוגיה אבל פחות כמותית, זבובים להביע GFP בשליטת יזמי גן פפטיד מיקרוביאלית יכול לשמש כדי לחזות אינדוקציה של המערכת החיסונית (איור 4C). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig1.jpg" /> . איור 1: זבובים קביעת זיהומיות מנה הוזרקו 50 NL של השעיות חיידקי מכסים מגוון של צפיפויות אופטיות (.0001-0.05). הזבובים היו הומוגני ומייד מצופים כדי לקבוע את מספר החיידקים שהוצג על ידי ההזרקה. עומס חיידקים ראשוני מאוד בקורלציה עם OD הראשוני מוזרק (r 2 = 0.96) <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig2.jpg" /> <s<html> טרונג&gt; איור 2:. הישרדות לאחר הזרקה עם חיידקים פתוגנים חמישה לשבעה ישנים זכרים היום הוזרקו 50 NL של שתי השעיה חיידקים או מדיה סטרילית ופיקוח על הישרדות. (א) זבובי סוג בר הוזרקו כ -5,000 חיידקים משל אחד משלושה מינים שונים. שיעור תמותת מארח תלוי במידה רבה על מיני חיידקים המשמשים לזיהום. זבובי סוג (B) Wild הוזרקו שלושה מינונים שונים של faecalis Enterococcous - 50, 500, ו5,000 חיידקים לזבוב. זבובים למות מהר יותר כאשר נגועים במינונים גבוהים יותר זיהומיות (C) מוטציה מערכת חיסונית וקו שליטת isogenic הפראי-סוגה הוזרקו כ -500 cepacia Burkholderia. השוואה התחבר דרגה pairwise מראה כי זבוב wild-type שורד את הזיהום משמעותי יותר מאשר המוטציה (χ 2 = 59.02, df = 1, p &lt;0.0001). FO: לשמור-together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig3.jpg" /> איור 3:. עומס חיידקים לאחר הזרקת זבובים הוזרק כ () 5,000 פ rettgeri (ב) 3,400 א coli. עומס חיידקים נקבע מייד לאחר הזרקה ובנקודתי זמן שלאחר מכן שונות. כל נקודת נתונים מייצגת את עומס החיידקים של זבוב אחד. א coli מנוקה במהירות ממארחים תיגר תוך פ rettgeri נמשך לשארית חייו של המארח ,. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig4.jpg" /> איור 4: אינדוקציה של ביטוי גני החיסון לאחר הזרקה. זבובים () הוזרקו 50 NL של פ PBS rettgeri או סטרילי באו הבטן או חזה, או נותרו unmanipulated מלבד CO <sUB&gt; 2 הרדמה. שש שעות לאחר ההדבקה, זבובים נאספו עבור בידוד RNA וביטוי של Diptericin גן נקבע באמצעות qRT-PCR. רמות ביטוי () הם בגרף כיחס Diptericin תמליל לתמליל rp49 וטפסו באופן שהשליטה CO 2 מוגדרת כבעל רמת ביטוי של 1. הברים מייצגים את הממוצע וסטיית התקן של יחסים מכל מצב (n = 4). רמות ביטוי (ארוחת בוקר) בגרף כΔΔCT 2 עם ערך C T הממוצע מזבובי שליטת 2 aesthesia CO משמשים כתנאי uninduced הסטנדרטי. הברים מייצגים את השגיאה הממוצעת וסטנדרטית של ΔΔC T מכל מצב (n = 4). אמנם אין הבדל באינדוקצית תמליל בשל אתר הזרקה, השוואה של לוחות A ו- B מראה כיצד שיטת ΔΔC T עלולה להפריז בהערכת רמות אינדוקציה. (C) זבובים להביע GFP בשליטה של Diptericin אמרגן הוזרק 50 NL של פ rettgeri (OD = 0.1) ולאחר מכן צילם 7 ימים לאחר מכן. פנל ה- GFP מראה ביטוי של ה- GFP בגוף שומן הבטן של זבובים נגועים, המצביע על הפעלה של Diptericin אמרגן בזבובי bacterially נגועים אך לא שולט מוזרק תקשורת. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> גן </td><td> קדימה </td><td> הפוך </td></tr><tr><td> rp49 (המכונה גם rpL32) </td><td> 5 &#39;AGGCCCAAGATCGTGAAGAA 3&#39; </td><td> 5 &#39;GACGCACTCTGTTGTCGATACC 3&#39; </td></tr><tr><td> Diptericin </td><td> 5 &#39;GCGGCGATGGTTTTGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;CGCTGGTCCACACCTTCTG 3&#39; </td></tr><tr><td> Drosomycin </td><td> 5 &#39;CTGCCTGTCCGGAAGATACAA 3 &#39; </td><td> 5 &#39;TCCCTCCTCCTTGCACACA 3&#39; </td></tr><tr><td> Defensin </td><td> 5 &#39;GAGGATCATGTCCTGGTGCAT 3&#39; </td><td> 5 &#39;TCGCTTCTGGCGGCTATG 3&#39; </td></tr><tr><td> Attacin </td><td> 5 &#39;CGTTTGGATCTGACCAAGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;AAAGTTCCGCCAGGTGTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Metchnikowan </td><td> 5 &#39;AACTTAATCTTGGAGCGATTTTTCTG 3&#39; </td><td> 5 &#39;ACGGCCTCGTATCGAAAATG 3&#39; </td></tr></tbody></table> טבלה 1: צבעי יסוד לqRT-PCR.

Drosophila melanogaster הוא אורגניזם מודל יוצא דופן לחקר מערכות חיסון מולדות וההשלכות הפיזיולוגיות של זיהום ומחלות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לספק זיהומים חיידקיים חזקים וניתנים לחזרה כמותית ל-D. melanogaster, וכיצד למדוד לאחר מכן את חומרת הזיהום ולכמת את התגובה החיסונית של המארח.

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק זיהומים חיידקיים חזקים וניתנים לחזרה לדרוזופילה, מלנוגסטר, ולאחר מכן למדוד את חומרת הזיהום ולכמת את התגובה החיסונית של המארח. זה מושג על ידי העברת הזיהום החיידקי לזבובים באמצעות מזרק ננו. ניתן לעקוב אחר התמותה לאחר ההדבקה לאורך זמן, וניתן לקבוע את העומס החיידקי המערכתי בכל נקודה על ידי הומוגניזציה של זבובים נגועים, ומדידת מספר החיידקים הקיימים.ניתן לכמת את ההגנה החיסונית של המארח גם על ידי מדידת רמת הביטוי של גנים פפטידים אנטיבקטריאליים, ובסופו של דבר כימות ואפיון של זיהום חיידקי. בדרוזופילה, ניתן להשתמש במלנוגסטר כדי לבדוק כיצד גורמים גנטיים וסביבתיים משנים את היכולת החיסונית של הזבוב. השיטה הזו יכולה לשמש כדי לענות על שאלות מפתח בתחום חסינות החרקים, כמו למשל כיצד גורמים גנטיים וסביבתיים משפיעים על היכולת החיסונית של המארח או כיצד חיידקים שונים משתנים בזיהום שלהם. אף על פי שאנו משתמשים בשיטה הזו כדי למדוד את ההגנה החיסונית של דרוזופילה מלנוגסטר מפני זיהום חיידקי, היא יכולה להיות מיושמת גם על חרקים אחרים ויכולה לעשות שימוש בסוגים אחרים של פתוגנים כמו וירוסים או פטריות.בעיה נפוצה שאנשים חווים כשהם לומדים לראשונה את השיטה הזו היא שהם עלולים לגרום לפגיעה רבה מדי בזבובים, מה שעלול לגרום לתמותה גבוהה מדי, אפילו בקבוצת הביקורת. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית ללימוד כיצד לבצע הדבקה עם מינימום נזק לזבוב. מכיוון שהמין המארח שלנו oph melanogaster הוא כל כך קטן, ההדבקה חייבת להיעשות תחת המיקרוסקופ, מה שמוסיף למורכבות הראשונית של הטכניקה.עם זאת, אנו מאמינים שהדגמה קטנה של הטכניקה תהפוך אותה לנגישה גם למדענים שיש להם ניסיון מוגבל בלבד עם זבובים. כדי להתחיל בניסוי, בחר מושבה בודדת מצלחת מאסטר שהוכנה בעבר וחסן בקבוק של מדיום סטרילי. גדל את החיידקים בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עד לשלב נייח.לאחר שהתרבית הגיעה לשלב נייח, גלולה בעדינות את התאים מ-600 מיקרוליטר של התרבית בצנטריפוגה שולחנית למשך שלוש דקות ב-5,000 פעמים. G, ואז השליכו את הרנה והרסוס. השעו את החיידקים ב-1000 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים עם פוספט או PBS.לאחר מכן, יש לדלל את התאים המרחפים ב-PBS סטרילי כדי להשיג את הספיגה הרצויה של 600 ננומטר ולהשתמש בתרחיף זה כדי להדביק את הזבובים. הכן מחט זכוכית על ידי משיכת נימי זכוכית סיליקט מושאלים והשתמש במלקחיים כדי לנתק את קצה המחט ליצירת פתח בקוטר 50 מיקרומטר. לאחר מכן, הנח את טבעת ה-O של התקרה ואת המרווח הלבן כשהגומה הגדולה פונה החוצה על בוכנת המתכת של המזרק.מלאו את מחט הזכוכית בשמן מינרלי בעזרת מזרק עם מחט בגודל 30. לאחר מכן הנח את מחט הזכוכית המלאה דרך הקולט והנח את טבעת ה-O הגדולה יותר סביב בסיסה מילימטר אחד מהקצה הקהה של המחט. החלק את המחט על בוכנת המתכת והברג בעדינות את הקולט עד שהוא מאובטח.הוצא את השמן המינרלי מהמזרק, והשאיר נפח קטן של שמן במחט כדי לשמש כמחסום בין המזרק לתרחיף החיידקים. ודא שאין בועות אוויר בתוך השמן המינרלי, תרחיף החיידקים או בין שני הנוזלים. לאחר מכן הגדר את המזרק לנפח הרצוי להזרקה.הכנס בזהירות את קצה המחט הנימים לתוך צינור של PBS סטרילי ולחץ על כפתור המילוי במזרק כדי למלא את מחט המזרק כדי ליצור בקרות פציעה. הזריקו זבובים מורדמים עם PBS סטרילי בבטן הקדמית על פני הגחון, הניחו את הזבובים המוזרקים לבקבוקונים טריים עם מדיה חדשה והניחו את הבקבוקונים על צידם כדי למנוע מהזבובים להידבק למזון לפני שהם מתאוששים מההרדמה שלהם. לאחר מכן, הוציאו את המדיה הסטרילית שנותרה מהמזרק ומלאו מחדש את אותה מחט בתרחיף החיידקים.חזור על ההליך והזריק לזבובים את תרחיף החיידקים. לחלופין, הזיהום יכול להיות מועבר על ידי דקירת סיכת ספיגה. להכנת סיכת הזיהום, ממיסים את קצה קצה הפיפטה של 200 מיקרוליטר ומכניסים סיכת מנוצ'ין חרקים של 0.15 מילימטר לפלסטיק המותך.אפשר לפלסטיק להתמצק כך שהסיכה מוחזקת במקומה עם 0.5 סנטימטרים של סיכה המשתרעת מהפלסטיק מרדימה זבובים עם פחמן דו חמצני ודוקרים את הזבובים בצלחת הצדר החזה של בית החזה בעזרת המחט, תוך הימנעות מאתרי ההצמדה של הכנפיים והרגליים. הסר את הזבובים מסיכת הפרטים בעזרת מלקחיים רכים. הקפידו לטבול את הסיכה בתרחיף החיידקים בין דקירת כל זבוב.מניחים את הזבובים הדוקרים לתוך בקבוקון טרי עם מדיום זבוב חדש ומניחים את הבקבוקון על צדו עד שכל הזבובים מתאוששים מההרדמה. הנח תת-קבוצה של הזבובים הנגועים לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגות בודדים על קרח. הוסף 250 מיקרוליטר PBS לכל צינור והשתמש בעלי כדי להומוגניזציה של הזבובים.הצלחת הבאה את ההומוגנאט על אוורור LB באמצעות פלטת ספירלה. לחלופין, לצלחת ההומוגנאט על ידי דילול סדרתי. העבירו כל זבוב הומוגני לשורה הראשונה של 96.צלחת היטב ומלאו כל באר מהשורות הנותרות ב 90 מיקרוליטר PBS באמצעות פיפטה רב ערוצית. קח 10 מיקרוליטר מהשורה הראשונה המכילה הומוגנט זבוב והחלק את ההומוגנאט לשורה השנייה. מצננים אותו למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים כדי לערבב היטב את ההומוגנאט.ואז קח 10 מיקרוליטר מההומוגנט והעביר אותו לשורה הבאה. חזור על הליך זה באמצעות השורות הנותרות החל מהשורה התחתונה. השתמש בפיפטה הרב-ערוצית כדי לקחת 10 מיקרוליטר מכל באר ולהפקיד אותה על צלחת LB.ודא שהדגימות מחולקות ככתמים נפרדים שאינם נוגעים זה בזה. חזור על שלב זה עד שנדגמו כל הבארות מכל שורה, והחלק אותן בסדר יורד של דילול על לוח LB. לא משנה באיזו שיטת ציפוי משתמשים, הקפידו לא לגדל את הצלחות יתר על המידה כך שהמושבות יישארו קטנות ודיסקרטיות.הסר את הצלחת מהחממה. לאחר שחיידקי הניסוי גידלו מושבות גלויות, אך לפני מושבות מהדרוזופילה, מיקרוביוטת המעיים נראית כ-24 שעות לאחר מכן עבור לוחות ספירליים. ספרו את המושבות הגדלות באמצעות מונה מושבות אוטומטי שיכול להעריך את עומס החיידקים למיליליטר הומוגנט על סמך מספר ומיקום המושבות בצלחת.עבור לוחות נקודתיים, ספרו ידנית את המושבות עבור כל זבוב מכל דילול המכיל 30 עד 300 מושבות וחישבו את מספר החיידקים למיליליטר של הומוגנט מקורי. לזבובים הוזרקו 50 ננוליטר של תרחיפי חיידקים המכסים מגוון צפיפויות אופטיות ומינון הזיהום ההומוגני והמצופה מיד משתנה עם הצפיפות האופטית של תרחיף החיידקים המשמש להזרקה. עומסי חיידקים ראשוניים נמצאים בקורלציה חזקה עם OD ראשוני שהוזרק.פרוטוקול זה מאפשר תצפית על סוגים שונים של זיהומים. זבובים נדבקו בפרובידנסיה ריי, שעלולה לגרום לזיהום תת-קטלני כרוני שנמשך 20 יום או יותר. זבובים הנגועים בקולי ינקו את הזיהום תוך שש שעות. לאחר הדבקה.ניתן להעריך את השראת מערכת החיסון באמצעות בידוד RNA ולאחר מכן Q rtpcr R של תעתיק פפטיד אנטיבקטריאלי באופן אנלוגי, אך פחות כמותית זבובים המבטאים GFP תחת שליטת פפטיד אנטי-מיקרוביאלי. ניתן להשתמש במקדמי גנים כדי לדמיין אינדוקציה של מערכת החיסון לאחר שליטה. טכניקה זו יכולה לאפשר הדבקה של מאות זבובים בשעה.ניתן להעלות על הדעת כל מספר של פנוטיפים שניתן למדוד בזבובים לאחר שהם נדבקים, כולל יכולת למידה, מצב מטבולי או למעשה כל תכונה אחרת שניתן לדמיין. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעביר זיהומים חיידקיים חזקים וחוזרים לדרוזופילה, מלנוגסטר, וכיצד למדוד לאחר מכן את חומרת הזיהום ולכמת את התגובה החיסונית של המארח. אל תשכח שחיידקים מסוימים יכולים לגרום לסיכונים לבריאות האדם.ודא כי מקפידים על נהלי בטיחות ביולוגית נאותים וכי קיימים אמצעי בלימה נאותים כדי למנוע מזבובים נגועים לברוח. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.

systemic-bacterial-infection-immune-defense-phenotypes-drosophila

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

טפיל (טפילים) צרעות מהווים שיעור גדול של אויבים טבעיים של חרקים רבים,...

מבוא של צרעות טפיליות<em&gt; תסיסנית</em&gt; ואת התגובה החיסונית Antiparasite

כדי להבין את קשר בין התגובה החיסונית ובהתנהגות, שאנו מתארים שיטה למדידת התנהגות רצוניים...

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה<em&gt; דרוזופילה</em

סרטון זה מדגים את הזרקת הננו-הזרקה של תרחיף חיידקי לחלל גוף הזבוב, וכתוצאה מכך התרבות חיידקים וזיהום. התגובה החיסונית של הזבוב מנקה חלק מהחיידקים, בעוד שאחרים בורחים מפינוי חיסוני ושורדים בתוך הפונדקאי וגורמים לזיהום.

הדבקת זבובים בתרחיף חיידקי באמצעות ננו-מזרק

סרטון זה מדגים טכניקה להדביק דרוזופילה על ידי החדרת חיידק פתוגני ישירות לחלל גופם. שיטה זו עוקפת מחסומי אפיתל ומנגנוני הגנה פסיביים אחרים, ומאפשרת השראת זיהום מערכתי. עם ההדבקה, התגובה החיסונית המתקבלת מוערכת על ידי ניטור תמותת זבובים וביצוע בדיקות במורד הזרם.

טכניקת דקירה ספטית להחדרת זיהום חיידקי מערכתי בזבובים

בסרטון זה אנו מדגימים טכניקה למדידת עומס חיידקי E. coli לאחר הזרקת E. coli לבית החזה של Drosophila melanogaster.

מדידת עומס חיידקי E. coli ב- Drosophila melanogaster בעקבות זיהום E. coli

שיטה לגידול תסיסנית בתנאי axenic ו gnotobiotic מוצגת. עוברי זבובים הם dechorionated ב חומצת נתרן, הועברו בסביבה נקיה מחיידקים לתזונה סטרילי, וגדלו במיכלים סגורים. ייחסתי דיאטה ועובר עם חיידקים מובילים עמותות gnotobiotic, ונוכחות חיידקים אושר על ידי ציפוי homogenates תסיסנית הגוף כולו.

גידול זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em&gt; בתנאי Axenic ו Gnotobiotic

שיטה זו מדגימה כיצד להמחיש הפתוגן הפלישה לתוך תאים חרקים עם דגמים תלת ממדיים (3D). Hemocytes של הזחלים דרוזופילה נדבקו בנגיף פתוגנים נגיפי או חיידקי, או vivo לשעבר או ויוו. Hemocytes נגוע היו לאחר מכן קבועה, צבעונית עבור הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, עוקבות שיחזור תאי תלת-ממד.

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי לחשוף ולהדביק את זבוב הפירות הים דרוזופילה melanogaster עם פתוגנים חיידקיים אורלית, וכדי למדוד את מספר חיידקים זיהומיות המחסן בעקבות זיהום במעיים. בהמשך נתאר את ההשפעה של החיסון מוטציות על הישרדות לעוף בעקבות זיהום חיידקי הפה.

זיהום חיידקי הפה ו Shedding ב דרוזופילה melanogaster

פרוטוקול זה מתאר וזמינותו של phagocytosis ויוו ב מבוגרים דרוזופילה melanogaster לכמת פגוציט הכרה ואישור של זיהומים חיידקים.

הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay

פרוטוקול זה מתאר בvivo של פאיגוציטוזה המשמש להערכת ולכמת את היכולת של דרוסופילה מלאנוזוזה בגיל צעיר ומיושן לחיידק הפאגוציטוז.

הערכת היכולת הייחודית ביותר לגיל מיוחד למבוגרים דרוזופילה מלאנוטציטים באמצעות שיטת בVivo פגוציטוזה

זבובים בוגרים של Drosophila melanogaster נוצלו בהרחבה כאורגניזמים מודל כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התגובות החיסוניות המולדות של המארחים ואסטרטגיות זיהום מיקרוביאליות. כדי לקדם את שלב הזחלים D. melanogaster כמערכת מודל נוספת או חלופית, מתוארת טכניקת הזרקת זחלים.

Drosophila melanogaster פרוטוקול הזרקת זחלים

למד שיטה לזיהום חיידקי מערכתי ב-Drosophila melanogaster באמצעות ננו-אינג'קטור או דקירה ספטית. מדוד עומס חיידקי, תמותה ותגובת חיסון כדי לחקור גורמים גנטיים וסביבתיים המשפיעים על תפקוד החיסון הטבעי.

זיהום חיידקים מערכתי וחיסון ביטחון פנוטיפים ב

גלה סרטונים נוספים