זיהום חיידקים מערכתי וחיסון ביטחון פנוטיפים ב

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק זיהומים חיידקיים חזקים וניתנים לחזרה לדרוזופילה, מלנוגסטר, ולאחר מכן למדוד את חומרת הזיהום ולכמת את התגובה החיסונית של המארח. זה מושג על ידי העברת הזיהום החיידקי לזבובים באמצעות מזרק ננו. ניתן לעקוב אחר התמותה לאחר ההדבקה לאורך זמן, וניתן לקבוע את העומס החיידקי המערכתי בכל נקודה על ידי הומוגניזציה של זבובים נגועים, ומדידת מספר החיידקים הקיימים.

ניתן לכמת את ההגנה החיסונית של המארח גם על ידי מדידת רמת הביטוי של גנים פפטידים אנטיבקטריאליים, ובסופו של דבר כימות ואפיון של זיהום חיידקי. בדרוזופילה, ניתן להשתמש במלנוגסטר כדי לבדוק כיצד גורמים גנטיים וסביבתיים משנים את היכולת החיסונית של הזבוב. השיטה הזו יכולה לשמש כדי לענות על שאלות מפתח בתחום חסינות החרקים, כמו למשל כיצד גורמים גנטיים וסביבתיים משפיעים על היכולת החיסונית של המארח או כיצד חיידקים שונים משתנים בזיהום שלהם. אף על פי שאנו משתמשים בשיטה הזו כדי למדוד את ההגנה החיסונית של דרוזופילה מלנוגסטר מפני זיהום חיידקי, היא יכולה להיות מיושמת גם על חרקים אחרים ויכולה לעשות שימוש בסוגים אחרים של פתוגנים כמו וירוסים או פטריות.

בעיה נפוצה שאנשים חווים כשהם לומדים לראשונה את השיטה הזו היא שהם עלולים לגרום לפגיעה רבה מדי בזבובים, מה שעלול לגרום לתמותה גבוהה מדי, אפילו בקבוצת הביקורת. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית ללימוד כיצד לבצע הדבקה עם מינימום נזק לזבוב. מכיוון שהמין המארח שלנו oph melanogaster הוא כל כך קטן, ההדבקה חייבת להיעשות תחת המיקרוסקופ, מה שמוסיף למורכבות הראשונית של הטכניקה.

עם זאת, אנו מאמינים שהדגמה קטנה של הטכניקה תהפוך אותה לנגישה גם למדענים שיש להם ניסיון מוגבל בלבד עם זבובים. כדי להתחיל בניסוי, בחר מושבה בודדת מצלחת מאסטר שהוכנה בעבר וחסן בקבוק של מדיום סטרילי. גדל את החיידקים בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עד לשלב נייח.

לאחר שהתרבית הגיעה לשלב נייח, גלולה בעדינות את התאים מ-600 מיקרוליטר של התרבית בצנטריפוגה שולחנית למשך שלוש דקות ב-5,000 פעמים. G, ואז השליכו את הרנה והרסוס. השעו את החיידקים ב-1000 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים עם פוספט או PBS.

לאחר מכן, יש לדלל את התאים המרחפים ב-PBS סטרילי כדי להשיג את הספיגה הרצויה של 600 ננומטר ולהשתמש בתרחיף זה כדי להדביק את הזבובים. הכן מחט זכוכית על ידי משיכת נימי זכוכית סיליקט מושאלים והשתמש במלקחיים כדי לנתק את קצה המחט ליצירת פתח בקוטר 50 מיקרומטר. לאחר מכן, הנח את טבעת ה-O של התקרה ואת המרווח הלבן כשהגומה הגדולה פונה החוצה על בוכנת המתכת של המזרק.

מלאו את מחט הזכוכית בשמן מינרלי בעזרת מזרק עם מחט בגודל 30. לאחר מכן הנח את מחט הזכוכית המלאה דרך הקולט והנח את טבעת ה-O הגדולה יותר סביב בסיסה מילימטר אחד מהקצה הקהה של המחט. החלק את המחט על בוכנת המתכת והברג בעדינות את הקולט עד שהוא מאובטח.

הוצא את השמן המינרלי מהמזרק, והשאיר נפח קטן של שמן במחט כדי לשמש כמחסום בין המזרק לתרחיף החיידקים. ודא שאין בועות אוויר בתוך השמן המינרלי, תרחיף החיידקים או בין שני הנוזלים. לאחר מכן הגדר את המזרק לנפח הרצוי להזרקה.

הכנס בזהירות את קצה המחט הנימים לתוך צינור של PBS סטרילי ולחץ על כפתור המילוי במזרק כדי למלא את מחט המזרק כדי ליצור בקרות פציעה. הזריקו זבובים מורדמים עם PBS סטרילי בבטן הקדמית על פני הגחון, הניחו את הזבובים המוזרקים לבקבוקונים טריים עם מדיה חדשה והניחו את הבקבוקונים על צידם כדי למנוע מהזבובים להידבק למזון לפני שהם מתאוששים מההרדמה שלהם. לאחר מכן, הוציאו את המדיה הסטרילית שנותרה מהמזרק ומלאו מחדש את אותה מחט בתרחיף החיידקים.

חזור על ההליך והזריק לזבובים את תרחיף החיידקים. לחלופין, הזיהום יכול להיות מועבר על ידי דקירת סיכת ספיגה. להכנת סיכת הזיהום, ממיסים את קצה קצה הפיפטה של 200 מיקרוליטר ומכניסים סיכת מנוצ'ין חרקים של 0.15 מילימטר לפלסטיק המותך.

אפשר לפלסטיק להתמצק כך שהסיכה מוחזקת במקומה עם 0.5 סנטימטרים של סיכה המשתרעת מהפלסטיק מרדימה זבובים עם פחמן דו חמצני ודוקרים את הזבובים בצלחת הצדר החזה של בית החזה בעזרת המחט, תוך הימנעות מאתרי ההצמדה של הכנפיים והרגליים. הסר את הזבובים מסיכת הפרטים בעזרת מלקחיים רכים. הקפידו לטבול את הסיכה בתרחיף החיידקים בין דקירת כל זבוב.

מניחים את הזבובים הדוקרים לתוך בקבוקון טרי עם מדיום זבוב חדש ומניחים את הבקבוקון על צדו עד שכל הזבובים מתאוששים מההרדמה. הנח תת-קבוצה של הזבובים הנגועים לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגות בודדים על קרח. הוסף 250 מיקרוליטר PBS לכל צינור והשתמש בעלי כדי להומוגניזציה של הזבובים.

הצלחת הבאה את ההומוגנאט על אוורור LB באמצעות פלטת ספירלה. לחלופין, לצלחת ההומוגנאט על ידי דילול סדרתי. העבירו כל זבוב הומוגני לשורה הראשונה של 96.

צלחת היטב ומלאו כל באר מהשורות הנותרות ב 90 מיקרוליטר PBS באמצעות פיפטה רב ערוצית. קח 10 מיקרוליטר מהשורה הראשונה המכילה הומוגנט זבוב והחלק את ההומוגנאט לשורה השנייה. מצננים אותו למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים כדי לערבב היטב את ההומוגנאט.

ואז קח 10 מיקרוליטר מההומוגנט והעביר אותו לשורה הבאה. חזור על הליך זה באמצעות השורות הנותרות החל מהשורה התחתונה. השתמש בפיפטה הרב-ערוצית כדי לקחת 10 מיקרוליטר מכל באר ולהפקיד אותה על צלחת LB.

ודא שהדגימות מחולקות ככתמים נפרדים שאינם נוגעים זה בזה. חזור על שלב זה עד שנדגמו כל הבארות מכל שורה, והחלק אותן בסדר יורד של דילול על לוח LB. לא משנה באיזו שיטת ציפוי משתמשים, הקפידו לא לגדל את הצלחות יתר על המידה כך שהמושבות יישארו קטנות ודיסקרטיות.

הסר את הצלחת מהחממה. לאחר שחיידקי הניסוי גידלו מושבות גלויות, אך לפני מושבות מהדרוזופילה, מיקרוביוטת המעיים נראית כ-24 שעות לאחר מכן עבור לוחות ספירליים. ספרו את המושבות הגדלות באמצעות מונה מושבות אוטומטי שיכול להעריך את עומס החיידקים למיליליטר הומוגנט על סמך מספר ומיקום המושבות בצלחת.

עבור לוחות נקודתיים, ספרו ידנית את המושבות עבור כל זבוב מכל דילול המכיל 30 עד 300 מושבות וחישבו את מספר החיידקים למיליליטר של הומוגנט מקורי. לזבובים הוזרקו 50 ננוליטר של תרחיפי חיידקים המכסים מגוון צפיפויות אופטיות ומינון הזיהום ההומוגני והמצופה מיד משתנה עם הצפיפות האופטית של תרחיף החיידקים המשמש להזרקה. עומסי חיידקים ראשוניים נמצאים בקורלציה חזקה עם OD ראשוני שהוזרק.

פרוטוקול זה מאפשר תצפית על סוגים שונים של זיהומים. זבובים נדבקו בפרובידנסיה ריי, שעלולה לגרום לזיהום תת-קטלני כרוני שנמשך 20 יום או יותר. זבובים הנגועים בקולי ינקו את הזיהום תוך שש שעות. לאחר הדבקה.

ניתן להעריך את השראת מערכת החיסון באמצעות בידוד RNA ולאחר מכן Q rtpcr R של תעתיק פפטיד אנטיבקטריאלי באופן אנלוגי, אך פחות כמותית זבובים המבטאים GFP תחת שליטת פפטיד אנטי-מיקרוביאלי. ניתן להשתמש במקדמי גנים כדי לדמיין אינדוקציה של מערכת החיסון לאחר שליטה. טכניקה זו יכולה לאפשר הדבקה של מאות זבובים בשעה.

ניתן להעלות על הדעת כל מספר של פנוטיפים שניתן למדוד בזבובים לאחר שהם נדבקים, כולל יכולת למידה, מצב מטבולי או למעשה כל תכונה אחרת שניתן לדמיין. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעביר זיהומים חיידקיים חזקים וחוזרים לדרוזופילה, מלנוגסטר, וכיצד למדוד לאחר מכן את חומרת הזיהום ולכמת את התגובה החיסונית של המארח. אל תשכח שחיידקים מסוימים יכולים לגרום לסיכונים לבריאות האדם.

ודא כי מקפידים על נהלי בטיחות ביולוגית נאותים וכי קיימים אמצעי בלימה נאותים כדי למנוע מזבובים נגועים לברוח. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.