Name: גזירה של שריר לב נקי במיוחד מתאי גזע האנושי המושרה pluripotent באמצעות בידול מאופנן מולקולה קטן ולאחר גלוקוז רעב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: למד פרוטוקול לגזירת שריר לב נקי מתאי גזע pluripotent אנושיים באמצעות בידול מושפע מולקולות קטנות ורעב גלוקוז. שיטה זו מאפשרת מידול מחלות לב וסקרינג תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי ה-NIH/NHBI (U01 HL099776-5), פרס החדשן החדש של מנהל ה-NIH (DP2 OD004411-2), המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה (RB3-05129), איגוד הלב האמריקאי (14GRNT18630016) ופרס חוקר הפקולטה מקרן לוסיל פקארד לילדים והמכון לחקר בריאות הילד בסטנפורד (ל-SMW). אנו מכירים גם בתמיכה במימון ממלגת קדם-דוקטורט של איגוד הלב האמריקאי 13PRE15770000, ותוכנית מלגות המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע DGE-114747 (AS).

הערה: מידע ספק לכל חומרים כימיים המשמשים בפרוטוקול זה כבר מופיע בטבלה 1 ו רשימת חומרים. כל הפתרונות והציוד הבאים במגע עם תאים חייבים להיות סטרילי, ויש להשתמש בי טכניקת ספטית בהתאם. לבצע את כל incubations התרבות בC ° 37 humidified, 5% CO 2 באינקובטור, אלא אם כן צוין אחרת. בפרוטוקול זה, כל הבידול מבוצע ב6-גם צלחות, שבי hiPSCs הם זורעים. בעקבות בידול וטיהור, יכולים להיות מנותקים תאים וreplated לשימוש במורד הזרם. 1. הכנה בינונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבינוני E8, להפוך את פתרון מניות עבור כל רכיב בינוני (NaHCO 3, חומצה אסקורבית L-2-פוספט, סלניט נתרן, transferrin, אינסולין, FGF2, TGFB1) ולאחסן את הפתרונות ב -20 ° C. הוספת הכמות מתאימה של פתרונות מניות לבקבוק DMEM / F12 ולסנן לעקר. Concentr הפתרוןניתן למצוא ation והתקנת תגובה לרכיבי המניות והבינוניים E8 בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון החוץ-התאי, להפשיר את מטריצת קרום במרתף (מסופקת בדרך כלל על 10 מ&quot;ג / מיליליטר) בשעה 4 ° CO / N. Matrigel משמש בדרך כלל לתרבות תאי גזע pluripotent כי תאי גזע pluripotent אדם יכולים לדבוק גם לחומר זה באמצעות integrin אלפא-6-beta-1 9. ברגע שהפשיר, לעשות aliquots 2.25 מ&quot;ג (250 μl) על קרח באמצעות טיפים pipet הקר כקרח וצינורות ולאחסן את aliquots ב -80 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר precoating צלחות עם ECMS, להפשיר וaliquot הפתרון תאי המטריצה ​​(ECMS) על קרח. מערבבים את ECMS ובינוני DMEM / F12 קר כקרח על יחס של 1: 200 על קרח. לשמור על קור רוח כדי למנוע התמצקות ECMS מוקדמת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לRPMI / B27 ללא בינוני אינסולין, להוסיף 10 מיליליטר של B27 מינוס אינסולין לתוך 500 מיליליטר של תקשורת RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לRPMI / B27 (עם אינסולין) בינוני, להוסיף 10 מיליליטר של תוסף B27 (עם insulin) ו -5 מיליליטר של אנטיביוטיקה פן-סטרפטוקוקוס לתוך 500 מיליליטר של תקשורת RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדיום גלוקוז הנמוך, להוסיף 10 מיליליטר של תוסף B27 ו -5 מיליליטר של אנטיביוטיקה פן-סטרפטוקוקוס לתוך 500 מיליליטר של תקשורת RPMI נטול גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבינוני / הקפאת ההקפאה, לערבב בסרום שור עוברי יחד עם dimethylsulfoxide (DMSO) בשעה 9: 1. מדיום ההקפאה ניתן לאחסן עד חודש 1 על 4 מעלות צלזיוס. הערה: יש לסנן כל כלי התקשורת ומאוחסן ב 4 ° C ושימוש בתוך 2 שבועות, אלא אם כן צוין אחרת. כל הכרכים מגיב / פתרון משמשים להלן מיועדים לבודד היטב בצלחת 6-היטב, אלא אם צוינו אחרת. </li></ol> 2. טרום ציפוי צלחות 6-גם עם ECMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך ECMS ידי ערבוב מטריצת מרתף קרום (למשל, Matrigel) עם תקשורת DMEM / F12 קר כקרח על יחס של 1: 200, ולאחר מכן להחיל 2 מיליליטר של ECMS הטרי היטב כל אחד לצלחת 6-היטב. כל טוב בצלחת 6-גם יקבל כ 90 מ&quot;ג ECMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ECMS מצופה צלחות עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. מייד לפני תאי ציפוי, לשאוב DMEM פתרון F12 / מכל טוב. אז הצלחות תהיה מוכנות לקבל תאים. </li></ol> 3. ההפשרה hiPSCs קפוא הערה: באופן קרוב בצע הליך זה כפי שהוא עשוי להוביל לculturing האופטימלי ובידול במורד הזרם של hiPSCs לhiPSC-CMS הבא מחזור ההקפאה / הפשרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוקון אחד של hiPSCs לכל טוב של 6-גם צלחת. הכן צינור חרוטי 15 מיליליטר עם 9 מיליליטר של מדיום E8 קר עם מעכבי ROCK (10 מיקרומטר) לכל בקבוקון. מעכב ROCK משפר הישרדות hiPSCs הבאה הקפאה 10. שמור את הצלוחיות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס להפשיר את התאים עד קרח קוטר גביש כ 5 מ&quot;מ שנשאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס החיצוני של צלוחיות עם 70% אתנול. נגב את הצלוחיות עם נייר טישו לפני שעברת אותם למכסה המנוע למינרית סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים לתוך צינור חרוטי מוכן. יש לשטוף tהוא בקבוקון פעם אחת עם 500 μl של מדיום E8 ולהעביר את המדיום המכיל את התאים המופשרים לאותו צינור חרוטי. צנטריפוגה ב RT למשך 4 דקות ב 200 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant לאחר צנטריפוגה ועדינות resuspend התא גלולה עם 2 מיליליטר של מדיום E8 עם מעכב ROCK (10 מיקרומטר). להעביר את תאי resuspended לאחד היטב צלחת 6-היטב מראש מצופה עם ECMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום עם מדיום E8 ללא מעכבי ROCK לאחר 24 שעות של culturing. תאים צריכים דבקו בזמן הזה. </li></ol> 4. Passaging של hiPSCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, hiPSCs מעבר לאחר שהגיע 75% confluency -80% בצלחת 6-היטב. לשאוב את מדיום התרבות. מהירות לשטוף בארות עם 1 מיליליטר של סטרילית, RT PBS. לשאוב PBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 0.5 mM EDTA או פתרון ניתוק תא 1x (לדוגמא, Accutase) ודגירה של 1-7 דקות ב RT. הזמן מתאים לדגירת EDTA משתנה עם קו hiPSC. מצפה לראות o מסתלסל גלויהעיבוי r של מושבות בקצוות, כמו זה מצביע על כך שפתרון EDTA או ניתוק תא מוכן להסרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב EDTA או פתרון ניתוק תא. הוסף 1 מיליליטר של מדיום E8 בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרומטר. לעקור מושבות hiPSC בהיטב על ידי pipetting שוב ושוב למעלה ולמטה וריסוס את מושבות עם טפטפת P1000. מושבות צריכה להיות מחולקות 5-10 גושי תא אחרי ההשלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המושבות שמושעות ב 1 מיליליטר של מדיום E8 עם מעכב ROCK לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את גושי תאים הגדולים לגושים קטנים במדיום E8. הוספת נפח מתאים של תקשורת E8 עם מעכב להשעית התא לדלל את התאים. נפח התקשורת להוסיף לדילול תלוי בצפיפות התאים ומספר הבארות שנזרע. באופן אידיאלי, 80% גם של hiPSCs אחת, ומחוברות צריכים להיות מדולל 01:12. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 11 מיליליטר בינוני E8 עם מעכב ROCK ל1 מיליליטר הקיים של ceפתרון ll בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל כאמור לקבלת דילול 01:12. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוסף triturate גושי תאים לרסיסי תא קטנים (סביב 50-200 תאים בכל בר הוא הטובים ביותר). הימנע על-triturating כמו זה מפחית הישרדות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ECMS מהצלחות מצופים מראש ולהוסיף 2 מיליליטר של תאי resuspended לתוך כל טוב. כ -100,000 תאים לכל גם צלחת 6-גם הוא אידיאליים. שואף לוותר התאים באופן שווה סביב היטב כדי למנוע הצטברות של תאים במרכז הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של culturing, להחליף בינוני עם בינוני E8 ללא מעכבי ROCK. לשנות את מדיום התרבות כל שעה 24 עד התאים להיות מחוברות 80%. לאחר מכן, התאים מוכנים למעבר שוב. זה בדרך כלל לוקח 3-6 ימים בין הקטעים להגיע 80% confluency. </li></ol> 5. hiPSCs הקפאה הערה: באופן קרוב בצע הליך זה כפי שהוא עשוי להוביל לculturing האופטימלי ובידול במורד הזרם של ירךמנג&#39;רים לhiPSC-CMS הבאים מחזור ההקפאה / הפשרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית צינורות קירור עם שם שורת התאים, סוג התא, מספר מעבר, ותאריך הקפאה. כקו מנחה כללי, להשתמש בבקבוקון אחד לכל גם צלחת 6 באר. הכן צינור חרוטי 15 מיליליטר מלא 9 מיליליטר של מדיום E8 עם מעכב ROCK (10 מיקרומטר). הכן הקפאה בינונית עם FBS 90% ו -10% DMSO, ולשמור בינוני על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תקשורת והתרבות, להוסיף 500 μl של 0.5 mM EDTA או פתרון ניתוק תא 1x ודגירה של 2-7 דקות ב RT. משך חשיפת פתרון EDTA או ניתוק תא משתנה משורת תאים לשורת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב EDTA או פתרון ניתוק תא. הוסף 1 מיליליטר של מדיום E8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקור מושבות hiPSC בהיטב על ידי pipetting מעלה ומטה וריסוס את מושבות עם טפטפת P1000. מושבות לא צריכים להיות מחולקות קטן יותר מ -100 גושי תא. להעביר את התאים מושעים לצינור חרוטי מוכן המכיל E8. צנטריפוגה בRT למשך 4 דקות ב 200 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ולהוסיף 500 μl של מדיום הקפאה קר לגלולה. Resuspend גלולה ידי pipetting 01:59 פעמים. הישרדות תא משתפרת על ידי שמירה על תאים בגושים גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי resuspended לתוך צינור קירור שכותרת. במהירות להזיז את הבקבוקונים לisopropanol הקפאת מיכל המכילה, אשר תאפשר לקירור הדרגתי. שמור את המכל עם תאים ב -80 ° C למשך 24 שעות, ולאחר מכן להעביר את תאי חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. </li></ol> 6. לב התמיינות של iPSC האדם הערה: כל התקשורת צריכה להיות לפחות ב RT כאשר הוסיפו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניתוק עם פתרון ניתוק תא EDTA או 1x, זרע כ -100,000 iPSCs האנושי על ECMS מצופה תרבות צלחות 6-גם לבידול (אותם צעדים כמו נהלי passaging תא). כאשר התאים מגיעים 85% confluency, לשנות את המדיום לRPMI / B27 ללא בינוני אינסולין עם 6CHIR99021 מיקרומטר מעכב GSK3-ביתא (CHIR) ולשמור במשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות, להחליף את מדיום התרבות CHIR המכיל עם RPMI / B27 ללא בינוני אינסולין ולהשאיר לבד למשך 24 שעות (עד יום 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, לשנות את התקשורת לRPMI / B27 ללא אינסולין עם 5 מיקרומטר Wnt מעכב IWR1 ולשמור במשך 48 שעות (עד יום 5). הערה: עיכוב Wnt יכול להיות גם ניסה באמצעות תרכובות מולקולה קטנות אחרות, כפי שתואר במחקרים קודמים 11. IWR1 נבחר על מעכבי Wnt מולקולה קטנה אחרים בשל הטווח המוגדל שבה הוכח כיעילים בעיכוב Wnt איתות 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 5, לשנות את המדיום חזרה לRPMI / B27 ללא בינוני אינסולין ולהשאיר למשך 48 שעות (עד יום 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 7, להחליף בינוני עם בינוני RPMI / B27 (עם אינסולין) ולהחליף בינוניים כל 3 ימים לאחר מכן עם אותו בינוני. מכות ספונטניות של שריר לב צריכה להיות גלויות ראשונה בכ היום 8 ליום10. </li></ol> 7. טיהור של cardiomyocytes האדם באמצעות הרעבת גלוקוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלאחר 10 בידול, לשנות את המדיום בכל טוב של 6-גם הצלחת 2 מיליליטר הבינוני גלוקוז הנמוך ולשמור על התאים במדיום הזה במשך 3 ימים (עד יום 13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 13, לחזור תאים למדיום RPMI / B27 (עם אינסולין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, replate cardiomyocytes לפני הסיבוב של רעב גלוקוז השני כדי לעזור לשחרר הלא cardiomyocytes מצלחת התרבות, המאפשר לניתוק קל של אי-cardiomyocytes במהלך רעב גלוקוז. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 13, בינוני לשאוב, לשטוף פעם אחת עם PBS, ולנתק את התאים לתאים בודדים באמצעות 500 μl של אנזים התנערות תא במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. באופן ספציפי, לאחר 5 דקות של טיפול אנזים, להשתמש פיפטה 1000 μl לנתק ידני cardiomyocytes מהצלחת 6-היטב על ידי משיכת שוב ושוב את אנזים התנערות תא וריסוס נגדו cardiomyomonolayer cyte. עד 30 חזרות pipetting ייתכן שיהיה צורך לנתק את cardiomyocytes לתוך תאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאים הם ניתקו והם בצורה חדה-תאית, לאסוף את כל התאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מלא 5 מיליליטר של מדיום RPMI / B27 עם אינסולין כדי לדלל את אנזים התנערות תא צנטריפוגות למשך 4 דקות ב 200 x g. לשאוב ולזרוק supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מחדש את התאים עם מדיום 2 מיליליטר RPMI / B27 וצלחת על צלחת 6-גם מצופה ECMS חדשה. בדרך כלל, confluency גבוה יותר של שריר לב מסייע בהישרדות תא במהלך replating. מטרת replate 2 מיליון תאים לכל צלחת 6-גם חדשה להישרדות אופטימלית במהלך replating. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 14, לשנות את המדיום חזרה ל -2 מיליליטר של מדיום גלוקוז הנמוך למעגל קיפוח גלוקוז שני. תרבות התאים במדינת גלוקוז נמוכה זה במשך 3 ימים נוספים. רוב הלא-cardiomyocytes ימותו במצב התרבות הנמוך של גלוקוז זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 17 ב, לשנות הבינוני עד 2 מיליליטר של Rבינוני PMI / B27 עם אינסולין. התאים הנותרים יהיו cardiomyocytes הנקי במיוחד. cardiomyocytes אלה יכול לשמש לניתוח ביטוי גנים, הקרנת סמים, ניתוח חילוף חומרים, ומבחנים במורד הזרם שונים אחרים. </li></ol>

<ol><li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150(2013).</li>
<li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+for+coxsackievirus+B3-induced+myocarditis+and+antiviral+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform.</a> Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).</li>
<li>Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+And+Development%22%5BJournal%5D)">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+de+novo+cardiomyocytes%3A+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li>
</ol>

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

קבלת כמות גדולה של שריר לב הנגזר hiPSC נקי במיוחד היא קריטית למחקר לב בסיסי, כמו גם יישומים קליניים וtranslational. פרוטוקולי בידול לב עברו שיפורים עצומים בשנים האחרונות, מעבר משיטות המבוסס על גוף embryoid ניצול צמיחת קרדיוגני גורמים 2, למטריצת שיטות כריך 12, ולבסוף לשיטות המבוססות monolayer-מווסת מולקולה קטנות ו5. מהפרוטוקולים האמורים, הפרוטוקול המתואר כאן מוצג הגבוה ביותר ואת יעילות בידול לב לשחזור ביותר לשורות תאי hiPSC שונות על ידי ויסות איתות ...

cardiomyocytes אדם מן המעלה הראשון הם קשה להשגה בגלל הדרישה לביופסיות לב פולשנית, קושי במתנער לתאים בודדים, ובגלל הישרדות תא לטווח ארוך עניה בתרבות. בהתחשב בזה חוסר cardiomyocytes האנושי הראשוני, cardiomyocyte מקורן בתאי גזע pluripotent אנושי הנגרם מטופל ספציפי טכנולוגיה (hiPSC-CM) כבר נחשבה כמקור עוצמה חלופי cardiomyocyte למחקר בסיסי, כמו גם יישומים קליניים וtranslational כגון דוגמנות מחלה ותרופה תגלית 1. מאמצים מוקדמים בתאי גזע pluripotent לcardiomyocytes מועסקים פרוטוקולי בידול באמצעות גופי embryoid (EBS), אך שיטה זו אינה יעילה בשריר לב בהפקת כי לעתים קרובות פחות מ -25% מתאים בEB מכים cardiomyocytes 2,3. יחסית, פרוטוקול בידול המבוסס על monolayer באמצעות ציטוקינים Activin וBMP4 מוצג יעילות גבוהה יותר מאשר EBS, אבלפרוטוקול זה הוא עדיין יחסית לא יעיל, דורש גורמים יקרים צמיחה, ופועל רק במספר מצומצם של שורות תאי גזע האנושי pluripotent 4. לאחרונה, פרוטוקול יעיל ביותר, המבוסס על monolayer hiPSC בידול cardiomyocyte פותח על ידי ויסות Wnt / β-קטנין איתות 5. אלה hiPSC-CMS להביע T לב טרופונין וactinin אלפא, שני חלבונים sarcomeric שהם סמנים סטנדרטיים של cardiomyocytes 6. הפרוטוקול מתאר כאן הוא עיבוד של,, 5,7 זה קטן על בסיס מולקולות תא מזין ללא הבחנה monolayer שיטה. אנו מסוגלים להשיג להכות cardiomyocytes מhiPSCs לאחר 7-10 ימים (איור 1). עם זאת, בעקבות בידול cardiomyocyte וכתוצאה מכך 50% הכו את התאים, immunostaining באופן עקבי מראה את קיומה של אוכלוסייה הלא-cardiomyocytes כי הם שליליים לסמני cardiomyocyte הספציפי כגון T טרופונין הלבבי ספציפי ואלפא-actinin. לפוrther לטהר cardiomyocytes ולחסל הלא cardiomyocytes, אוכלוסיות תאים מובחנות הטרוגנית היו נתונים לגלוקוז רעב תוך התייחסות אליהם עם מדיום תרבות גלוקוז נמוך מאוד במשך ימים רבים (איור 2). טיפול זה באופן סלקטיבי מבטל הלא cardiomyocytes בשל היכולת של שריר לב, אך לא בלתי-cardiomyocytes, לחילוף חומרים לקטט כמקור האנרגיה העיקרי על מנת לשרוד בסביבת גלוקוז נמוכה 8. לאחר שלב טיהור זה, עלייה של 40% בשיעור cardiomyocytes אי cardiomyocytes הוא ציין, (איור 3, איור 4) ותאים אלה יכולים לשמש לניתוח במורד הזרם ביטוי גנים, דוגמנות מחלה, ומבחני הקרנת סמים.

<table><tbody><tr><td>מטריג'ל (9-12 מ"ג/מ"ל)</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>מדיה RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td></td></tr><tr><td>ללא גלוקוז</td><td>מדיה RPMI Invitrogen</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>B27 מינוס אינסולין</td><td>Invitrogen</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27 (עם אינסולין)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה עט-סטרפטוקוקוס</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>BenchMark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>מעכב ROCK Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Thermo Fisher</td><td>508306</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>מרים תאים</td><td>פישר</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr>פישר<td>קריוביאלי</td><td>(צינורות NUNC)</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select אנזים</td><td>Invitrogen</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

גזירה של שריר לב נקי במיוחד מתאי גזע האנושי המושרה pluripotent באמצעות בידול מאופנן מולקולה קטן ולאחר גלוקוז רעב

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

cardiomyocytes מקורן בתאי גזע pluripotent אדם מושרה (hiPSC-CMS) הפך מקור תא חשוב להתייחס לחוסר cardiomyocytes העיקרי זמין עבור יישומי מחקר וtranslational בסיסיים. להבדיל hiPSCs לשריר לב, פרוטוקולים שונים, כוללים גוף embryoid (EB) בידול מבוסס ואינדוקצית גורם הגדילה פותחו. עם זאת, פרוטוקולים אלה אינם יעילים ומשתנים מאוד ביכולתם ליצור cardiomyocytes המטוהר. לאחרונה, אפנון פרוטוקול ניצול קטן על בסיס מולקולות איתות Wnt / β-קטנין הוצג לקידום בידול לב עם יעילות גבוהה. עם פרוטוקול זה, יותר מ -50% -60% מתאים מובחנים היו cardiomyocytes טרופונין חיובי לב נצפו באופן עקבי. כדי להגדיל את טוהר cardiomyocyte נוסף, התאים המובחנים היו נתונים לגלוקוז רעב לחסל במיוחד שאינו cardiomyocytes המבוסס על ההבדל מטבוליםים בין cardiomyocytes ולא cardiomyocytes. באמצעות אסטרטגית בחירה זו אנו באופן עקבי השגנו עלייה גדולה יותר מ -30% בשיעור cardiomyocytes אי cardiomyocytes באוכלוסייה של תאים מובחנים. cardiomyocytes הנקי במיוחד אלה צריכים לשפר את האמינות של תוצאות מאדם מבוסס iPSC בלימודי דוגמנות המחלה מבחנה ומבחני הקרנת סמים.

השינויים מורפולוגיים במהלך התמיינות hiPSC. HiPSC התרבותי בצלחות מזין ללא גדל מושבות שטוחות כמו, דו-ממדיות. לאחר שהגיע סביב 85% confluency, טופלו hiPSCs עם 6 מיקרומטר CHIR לבידול (איור 1 א). כמויות ניכרות של מוות של תאים, תופעה נורמלית ושכיחה, נצפו לאחר 24 שעות של טיפול CHIR. לאחר יומיים של טיפול CHIR, hiPSCs המשיך להבחין כלפי גורל mesodermal. בהשוואה לתאים במושבות hiPSC, גודל תא ...

כאן, אנו מתארים פרוטוקול חזק לגזירת קרדיומיוציטים אנושיים המשלב התמיינות לבבית מווסתת מולקולות קטנות וטיהור קרדיומיוציטים בתיווך חסך גלוקוז, המאפשר ייצור של קרדיומיוציטים מטוהרים למטרות מודלים של מחלות לב וכלי דם וסינון תרופות.

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק אוכלוסייה מטהרת של קרדיומיוציטים המופקים מתאי גזע אנושיים רב-עוצמה מושריים (hiPSCs). ראשית, מתאי גזע אנושיים רב-עוצמה מושריים נתרבים בשכבה חד-תאית עד להגעה לכ-85% התלכדות (confluency). לאחר מכן, מתווספת תרכובת של מולקולה קטנה המפעילה את מסלול האיתות Wnt, והתאים מדגרים במשך יומיים כדי להשרות את היווצרות המזודרם.בשלב הבא, מתווסף לתאים תרכובת של מולקולה קטנה המעכבת את נתיב השיגנלינג של Wnt כדי להגדיר דיפרנציאציה של מזודרם לבבי. לאחר מכן מדגרירים את התאים למשך יומיים נוספים. ביום השביעי, הקריוציטים המובחנים פועים; אוכלוסיית התאים המובחנים ההטרוגנית מדגג dals רה לאחר מכן במצע תרבית תאים עם ריכוז גלוקוז נמוך כדי לטהר באופן סלקטיבי את הקריוציטים.לבסוף, התאים נבדקים ויזואלית תחת מיקרוסקופ אור ונאלים באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לאשש את ייצורם של אוכלוסייה מטוהרת מאוד של קרדיומיוציטים פועמים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני פרוטוקולי התמיינות אחרים של קרדיומיוציטים המשתמשים במולקולות קטנות הוא שהיא כוללת שלב נוסף של הרעבת גלוקוז. שלב זה מאפשר לנו לטהר קרדיומיוציטים, המסוגלים לנצל מקורות אנרגיה תאיים אחרים מלבד גלוקוז.ניתן להסיר באופן סלקטיבי תאים שאינם קרדיומיוציטים מאוכלוסייה הטרוגנית זו של תאים מובחנים. לאחר מכן, ניתן להשתמש בקרדיומיוציטים למטרות המשך, כגון מידול מחלות in vitro או גילוי תרופות בסריקה רחבה (high throughput). הכנה לבדיקות: הכינו את הניסוי על ידי ציפוי מראש של פלטות עם שש בארות בתמיסת מטריצה חוץ-תאית (extracellular matrix solution) או ECMS, והפשרת בקבוקון של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מושריים קפואים, או HI PSCs, כפי שמתואר בטקסט המלווה.לאחר סבב צנטריפוגה, השהה את התאים שהופשרו ב-E eight עם מעכב ROCK. לאחר מכן, העבר את תוכן המבחנה לבאר אחת של פלטת שש בארות המצופה מראש ב-ECMS. הנח את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide.לאחר 24 שעות, התאים יהיו דבקים. החליפו את המצע למצע E eight ללא מעכב rock. המשיכו לגדל את התאים והחליפו את מצע ה-E eight מדי יום.כאשר ה-HI PSCs מגיעים ל-75 עד 80% צפיפות (confluency), הגיע הזמן להעביר אותם למצע חדש (passage). שאבו את מצע התרבית במהירות. שטפו את הבארים עם 1 ml של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר ושאבו את ה-PBS.לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של EDTA בריכוז 0.5 mM או תמיסה אחרת להפרדת תאים. דגרו במשך דקה אחת עד שבע דקות בטמפרטורת החדר; כאשר ניתן להבחין בקירוב או בעיבוי של קולוניות סביב השוליים באמצעות ניטור במיקרוסקופ, שאבו את תמיסת הפרדת התאים. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של מצע E8 מועשר ב-10 µM של מעכב ROCK באמצעות פיפט P1000, ובצעו פיפטינג חוזר למעלה ולמטה כדי להפריד לחלוטין את קולוניות ה-hiPSC מהפלטה, כך שייווצרו 5 עד 10 גושי תאים.לאחר מכן, העבירו את התרחוף לפ menutup של 15 מיליליטר כדי לפזר עוד יותר את גושי התאים הגדולים; שאיפו והוציאו את הנוזל בעזרת פיפטה עד להיווצרות גושים קטנים יותר, כפי שמוצג כאן. לאחר מכן, דללו את התאים ביחס של 1 ל-12 על ידי הוספת 11 מיליליטר של מצע E8 עם מעכב ROCK למיליליטר אחד של תרחוף התאים.בשלב הבא, שאבו את ה-ECMS מהלוחות שקודדו מראש. הוסיפו שתי מיליליטר של תאי שהושעו מחדש לכל באער; כ-100,000 תאים לבאער בלוח של שישה באערים הם אידיאליים. שאפו לחלק את התאים באופן שווה מסביב לבאער כדי למנוע הצטברות תאים במרכזו. הניחו את הלוח באינקובטור למשך 24 שעות.למחרת, החליפו את המצע ב-E eight שאינו מכיל מעכב רוק. החליפו את המצע מדי 24 שעות עד שהתאים יגיעו ל-80% התמזגות (confluent). בדרך כלל, התאים יהיו מוכנים למעבר (passage) נוסף בתוך שלושה עד שישה ימים לאחר הדיסוציאציה באמצעות EDTA או תמיסת הפרדה one Xcel. זרעו כ-100,000 תאי human I PSCs על פלטות תרבית של שישה בארות מצופות ב-ECMS לצורך דיפרנציאציה.בהתאם לשלבים שבוצעו עבור HI PSCs, כאשר התאים מגיעים ל-85% fluency, יש להחליף למדיום R-P-M-I-B 27, ללא אינסולין, אך עם שש micromolar של GSK three beta inhibitor, CHIR 9 9 0 2 1. דגרו את התאים למשך 48 שעות ובחנו את התאים תחת מיקרוסקופ מדי יום.ניתן להבחין בכמויות משמעותיות של מוות תאי לאחר 24 שעות של טיפול ב-CHIR. תופעה זו היא נורמלית ונפוצה לאחר יומיים של טיפול. תאי ה-HIPS גדלים בגודלם ובמספרם וממשיכים להבדיל לעבר גורל מזודרמלי.החליפו את מצע הגידול המכיל CHIR במצע R-P-M-I-B 27 עם אינסולין, והדגירו עד היום השלישי. ביום השלישי, החליפו את המצע למצע R-P-M-I-B 27 ללא אינסולין. הוסיפו מעכב Wnt מסוג IWR-1 בריכוז של 5 µM והדגירו את התאים למשך 48 שעות.ביום החמישי, בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ. התאים המזודרמליים אמורים להיות מכוונים לקו השבט הקרדיאלי ולהתחיל להתאחד וליצור מבנים דמויי ענפים אופייניים. החליפו את המצע בחזרה ל-R-P-M-I-B 27 ללא אינסולין והדגירו את התאים למשך 48 שעות.ביום השביעי, החליפו את המצע ב-R-P-M-I-B 27 המכיל אינסולין. החליפו למצע זהה מדי שלושה ימים לאחר מכן, וכן בין היום השמיני לעשירי. פעימות ספונטניות של cardiomyocyte ייראו לאחר 10 ימי דיפרנציאציה.יותר מ-50% משטחי התאים פועמים. עם זאת, יריעות תאים פועמים עשויות להיות מעורבבות עם תאים שאינם קרדיומיוציטים; ביום העשירי, מבנים דמויי ענפים יהיו בולטים מאוד. קרדיומיוציטים בעלי התמיינות סופית לא יתרבו מעבר לנקודה זו.ביום ה-10 לאחר הדיפרנציאציה, החליפו את המצע בכל באר של הפלטה בעלת שש הבאערים לשני מיליליטרים של מצע עם תכולת גלוקוז נמוכה, והחזיקו את התאים במצע זה למשך שלושה ימים עד ליום ה-13. ביום ה-13, החזירו את התאים למצע R-P-M-I-B 27 עם אינסולין, או לחלופין, כדי לבצע רפלואציה של התאים, המקלה על הדיסוציאציה של תאים שאינם קרדיומיוציטים במהלך הרעב לגלוקוז.שאבו את המצע ושטפו פעם אחת עם PBS. הוסיפו 500 µL של אנזים לפירוק תאים והדגירו את התאים למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות של טיפול באנזים, השתמשו ב-P 1000 כדי לפזר ידנית את התאים השריריים של הלב (cardiomyocytes) לתליה של תאים בודדים על ידי פיפוט למעלה ולמטה עד 30 פעמים. לאחר פירוק התאים, העבירו אותם לשפופרת קונית של 15 mL.מלאו חמישה מיליליטר של מצע R-P-M-I-B 27 עם אינסולין כדי לדלל את אנזים הפירוק התאי, וסובבו בצנטריפוגה למשך ארבע דקות ב-200 Gs. לאחר הסבוב, שאבו והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, השעיקו מחדש את התאים בשני מיליליטר של מצע R-P-M-I-B 27 והעבירו אותם לפלטת שש בארות חדשה מצופה ECMS. בדרך כלל, הישרדות התאים עולה עם רמת ההצפיפות (confluence); לצורך הישרדות תאים אופטימלית.זריעה מחדש של 2 מיליון תאים לבאר בצלחת שש בארות עבור תאים שלא נזרעו מחדש. ביום ה-14, החליפו את המצע חזרה לשני מיליליטר של מצע דל גלוקוז למחזור שני של תרבית בהחסרת גלוקוז. השאירו את התאים במצב דל גלוקוז זה למשך שלושה ימים נוספים.רוב התאים שאינם קרדיומיוציטים ימותו ביום ה-17. יש להחליף את המצע לשני מיליליטר של R-P-M-I-B 27 עם אינסולין. התאים שנותרו יהיו מטוהרים ברמה גבוהה. קרדיומיוציטים.ניתן להשתמש בתאים אלו לצורך ניתוח ביטוי גנים, סריקת תרופות, ניתוח מטבולי ומגוון בדיקות המשך אחרות כדי לבחון את טהרת התאים של ה-cardiomyocytes לאחר דיפרנציאציה וטיהור באמצעות שיטת הרעבת גלוקוז. תאים עם צביעה אימונוגנוסית נגד סמני cardiomyocytes, cardiac troponin ו-CTN T, אופיינו. מיקרוסקופיה של אימונופלורסנציה של אוכלוסייה לא מטוהרת של תאים מובחנים חשפה כי למרות שתאים רבים היו חיוביים ל-CTN T (מוצג בירוק), בתאים רבים היה חסר ביטוי של CTN T, מה שמעיד על נוכחות של תאים שאינם cardiomyocytes ביום 13. לעומת זאת, לאחר הרעבת גלוקוז למשך שלושה ימים שהחלה ביום 10, כמעט כל התאים היו חיוביים ל-CTNT ביום 13, מה שמעיד על טיהור מוצלח של ה-cardiomyocytes בעקבות הרעבת הגלוקוז.נתונים אלו תוממו עוד יותר באמצעות ניתוח ציטומטריה של זרימה. כפי שצוין באדום, כ-50% מהתאים שלא עברו הרעבת גלוקוז היו חיוביים ל-tn NT two. בעוד ש-90% מהתאים שהורעבו מגלוקוז היו חיוביים ל-tn NT two.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים של בני אדם לאוכלוסיות מטהרות מאוד של קרדיומיוציטים. ניתן להפיק תאים מטהרים אלו בשיטה של תפוקה גבוהה עבור מגוון יישומים של in vitro בשלבים מאוחרים יותר. בעת גידול תאי גזע פלוריפוטנטיים, זכרו כי אין לאפשר להם לגדול עד למאה אחוזי התרבות (confluency) לפני תחילת תהליך ההשראה.חלק מקווי תאי הגזע מבצעים דיפרנציאציה בצורה הטובה ביותר כאשר רמת השגשוג הראשונית של תאי הגזע הפלוריפוטנטיים נמוכה מ-85%. לבסוף, קווי תאי גזע מסוימים עשויים להגיב במהירות רבה יותר או בצורה חמורה יותר לשלב של מחסור בגלוקוז. יש לנטר תמיד פרמטרים אלה לפני עבודה עם קווי תאי גזע חדשים.

derivation-highly-purified-cardiomyocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הקמנו פרוטוקול לזירוז של cardioblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות לב האדם תפקודי הלב וכלי הדם cardiomyocytes עבור התיקון.

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

תאי גזע pluripotent, או גזע pluripotent (שב"ס) תאים עובריים או מושרה, מהווים מקור חשוב של תאים מובחנים אדם, כוללים שריר לב. כאן, אנו נתמקד באינדוקצית לב של תאי iPS, מראים כיצד להשתמש בם כדי להשיג cardiomyocytes האנושי מתפקד באמצעות פרוטוקול המבוסס על גופי embryoid.

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

המאמר מתאר את המתודולוגיה מפורטת להבחין ביעילות תאי גזע pluripotent אנושיים לשריר לב על ידי באופן סלקטיבי ויסות מסלול Wnt, ואחרי ניתוח cytometry זרימה של סמני התייחסות להעריך הומוגניות וזהותה של האוכלוסייה.

בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול התמיינות קרדיומיוציטים חזק, מהיר וניתן להרחבה עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). קרדיומיוציטים המופקים בשיטה בקנה מידה גדול זה יכולים לספק מספר תאים מספיק לשימוש יעיל בהם במודלים של מחלות לב וכלי דם בבני אדם, סינון תרופות בתפוקה גבוהה ויישומים קליניים פוטנציאליים.

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

אפיון אלקטרופיזיולוגי של cardiomyocytes הנגזר האדם בתאי גזע Pluripotent (hPSC-CMs) הוא קריטי עבור מודלים של מחלות לב ולקביעת תגובות סמים. פרוטוקול זה מספק את המידע הדרוש כדי לנתק צלחת hPSC-CMs על מערכים אלקטרודה רב, למדוד את פוטנציאל השדה שלהם, וכן שיטה לניתוח QT ו RR מרווחי.

ניתוח אלקטרופיזי של האדם Pluripotent גזע גזע נגזר Cardiomyocytes (hPSC-CMs) באמצעות מערכים אלקטרודה רב (MEAs)

מאמר זה מכיל קבוצה של פרוטוקולים לפיתוח של האדם המושרה הנגרמת לתאי גזע (היפנוsc-CM) רשתות המתורבתות על לוחות בעלי השפעה מרובת המידות כדי electroporate הפיך קרום התא עבור מדידות פוטנציאליות פעולה. הקלטות תפוקה גבוהה מתקבלות מאותם אתרי תא במשך ימים ברציפות.

האדם הנגזר iPSC האנטי נטוורקס רשתות על Multiwell מיקרו מערכים אלקטרודה לפעולה ונשנים הקלטות פוטנציאליות

כאן אנו מתארים ולאמת שיטה כדי ליצור בעקביות באופן עקבי הנגרמת האנושי המושרה תא גזע מושרה ולאפיין את תפקידם. טכניקות אלה עשויות לסייע בפיתוח תובנה מכניסטית למסלולי איתות, לספק פלטפורמה לסינון תרופות בקנה מידה גדול ומחלות לב באופן אמין.

הדור של היפנוציטים באיכות גבוהה והתרופות לאפיון הטיפול בסידן

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה קלה לשימוש כדי ליצור מערכי מיקרוטיסו לבביים תלת-ממדיים בהרכבה עצמית המורכבים מקרדיומיוציטים פלואוריפוטנטיים מובחנים מראש המושרים על ידי בני אדם, קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל. תא זה ידידותי למשתמש ונמוך הדורש טכניקה כדי ליצור microtissues לב ניתן ליישם עבור מידול מחלות ושלבים מוקדמים של פיתוח תרופות.

ייצור מערכי מיקרוטיסו לב תלת-ממדיים באמצעות קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם ב-IPSC, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל

שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון קיצור סרקומר באמצעות קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים עם חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים.

קיצור סרקומר של קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי ליצור ולהרחיב בחוזקה קרדיומיוציטים אנושיים מתאי דם היקפיים של מטופלים.

ייצור והרחבה של קרדיומיוציטים אנושיים מתאי דם היקפיים של מטופלים

למד פרוטוקול לגזירת שריר לב נקי מתאי גזע pluripotent אנושיים באמצעות בידול מושפע מולקולות קטנות ורעב גלוקוז. שיטה זו מאפשרת מידול מחלות לב וסקרינג תרופות.

גזירה של שריר לב נקי במיוחד מתאי גזע האנושי המושרה pluripotent באמצעות בידול מאופנן מולקולה קטן ולאחר גלוקוז רעב

גלה סרטונים נוספים