פרוטוקולים לקבלת Zygotic וסומטי עוברים ללימוד תקנה של פיתוח העובר מוקדם בקטניות הדגם Medicago truncatula

המטרה הכוללת של ההליכים הבאים היא להדגים כמה עוברי טולה מטען ניתן להשיג בשלבי התפתחות שונים כדי לחקור את הבקרה הגנטית של העובר בצמחים, ניתן להשיג זאת על ידי קישור מורפולוגיה של תרמילים עם שלבי ההתפתחות השונים של עוברים זיגוטיים, ועל ידי תרבית עלים להשגת עוברים סומטיים בשלבים השונים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש ב-PCR כמותי ובטא גלוקורונידאז כדי להעריך את ביטוי הגנים במהלך האמבריוגנזה בשלבי ההתפתחות הספציפיים המעניינים. היתרונות של טכניקות אלה הם שתיוג של פרחים בודדים אינו נדרש לניסויים in vivo, והם מותאמים להליכי מבחנה, מספקים גישות ניסיוניות משלימות.

הדגמה חזותית של הליך התרבות חשובה מכיוון שהיא מאפשרת לעקוב מקרוב אחר פרטי המניפולציות. הדגמת ההליך in vivo תהיה של וואנג ואילו קים נולאן תדגים את ההליך במבחנה. כדי להקל על התפתחות העובר הזיגוטי, חודרים את פני שכבות הזרעים של זרעים מצמח משולש מטען מונטה ומשרים את הזרעים למשך הלילה, מכוסים לחלוטין במים.

למחרת, זרעו שלושה זרעים בכל אחד מ -10 סירים בקוטר 15 ס"מ בתערובת עציצים והעבירו את הסירים לבית זכוכית. גדלו את הצמחים בתקופת צילום של 14 שעות עם טמפרטורת לילה של 23 עד 19 מעלות צלזיוס, תוך שמירה על השתילים הבריאים ביותר לאחר הנביטה כך שיהיה צמח אחד לכל עציץ והקיפו את השתילים בסבכה כדי שגבעולי הצמח יטפסו כאשר מופיעים תרמילים. אסוף בשלבים המתאימים המתוארים בטבלה הראשונה ובאיור הראשון כדי להשיג את שלב התפתחות העובר המוקדם הרצוי.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי לבודד את הלס מהתרמילים. לחלופין, עבור מיקרוסקופיה מעודנת יותר, צלולה לחלוטין בתמיסת הוייר, ניתן לאשר את שלבי העובר על ידי הדמיית העוברים במיקרוסקופ מורכב סטנדרטי. לאחר מכן אסוף את מספר ה-UL הנדרש לניסוי מהאזור המרכזי של התרמיל ואחסן אותם בטמפרטורה המתאימה לניתוח במורד הזרם להתפתחות עובר סומטי.

במבחנה קוטפים עלונים מעלה הטאט האחרון, המורחב כמעט במלואו, של גבעול מוארך של זן טראן אטולה המסוגל ליצור בקלות עוברים בתרבית. שמור את עלי הטייט על מגבת נייר לחה בסיר תרבית כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן עבדו בארון בטיחות ביולוגית מעוקר UV, הנחו את העלים לתוך כדור הרשת של חליטת תה אביב חיטוי.

אינפוזר שקוע ב-70% אתנול במכסה בורג של 250 מיליליטר. סיר תרבית פוליקרבונט לאחר 30 שניות, מסננים את רקמת העלים ולאחר מכן טובלים את האינפוזר בתמיסת אקונומיקה מדוללת אחת עד שמונה למשך 10 דקות. עם מערבולת עדינה מדי פעם, מערבבים בעדינות את הסיר ומסננים את עודפי המים.

לאחר מכן שטפו את האינפוזר. פעם נוספת במים טריים נטולי יונים בסיר חדש. כעת השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את העלים מחליטת התה לתרבית טרייה, סיר של בורג מים מזוקקים סטרילי נטול יונים על הפקק הסטרילי.

לאחר מכן שוטפים את העלים על ידי היפוך ומערבולת. לאחר מכן אפשר לעלונים לצוף על המים הסטריליים כדי לצלחת את השתלים. חתוך את הקצוות של העלונים המעוקרים הבודדים בטכניקה סטרילית.

לאחר מכן חותכים את המלבן הנותר לשניים או שלושה, שמונה עד 10 על שלושה עד חמישה מילימטר עם הווריד האמצעי במרכז כל צלחת X. שישה x explants לכל אגר מצע תרבית מוצק בקוטר תשעה סנטימטרים. צלחות פטרי עם צד חותם ABA כלפי מטה כדי לשמור על כיוון העלים הרגיל.

לאחר מכן אטמו את צלחות הפטרי עם פרפיל ודגרו את הצלחות בחושך בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס בחדר טמפרטורה מבוקרת. לאחר שלושה שבועות, השתמש במרית נירוסטה סטרילית ובמלקחיים כדי לתת-תרבית את החור המבדיל על מדיום טרי. יש לצפות בעוברים הראשונים בעוד כארבעה שבועות כאשר מתרחשת יבלת, והיבלת עולה על גודל האקספלן הגדול ביותר המוצג כאן.

העבר רק 50% מהיבלת הבודדת כאשר תת-תרבות למדיום טרי. לבסוף, השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי לאסוף את שלבי העובר השונים לאורך תקופת דגירה של ארבעה עד שמונה שבועות, ועבד את האקספלנטים בהתאם למטרות הניסוי. לאחר קצירת עוברים זיגוטיים כפי שהודגם זה עתה במורד הזרם ב-C ניתן להשתמש בשתי הכלאות או אסטרטגיות מתאימות אחרות מעניינות במיוחד כפי שמודגם בתמונות אלה, ניתן לראות את הייחודיות של SSIS וספנסר על ידי ביצוע תוכניות ה-X המצופות.

במהלך שבועות ארבעה עד שמונה ניתן לאתר ולבחור עוברים סומטיים בשלבים דיסקרטיים לניתוח מיידי. לדוגמה, נתונים אלה ממחישים כיצד עוברים בשלב המוקדם של Olein מציגים ביטוי של סוג אחד של גן Medicago Tula eoin, אך לא אחר. יתרון מיוחד של מערכת העוברים הסומטית הוא שניתן לבצע טרנספורמציה של היבלת מבלי לחדש צמח שלם.

אכן, כפי שהודגם כאן. ניתן להשתמש בבטא גלוקורונידאז כדי להמחיש ביטוי גנים בשלבים השונים של האמבריוגנזה. לאחר צפייה בסרטון, אתה אמור להבין היטב כיצד לבחור ולפרק תרמיל כדי להשיג אנדרס.

אתה צריך גם להבין היטב כיצד להכין וצלחת אקספלור סטרילי לאמבריוגנזה סומטית לאחר התפתחותם. טכניקות אלו אפשרו לחקור את ויסות השעתוק של השלבים המוקדמים של האמבריוגנזה ביחס להתפתחות גדילת העובר ואחסון חומרים מזינים.