Name: פרוטוקולים לקבלת Zygotic וסומטי עוברים ללימוד תקנה של פיתוח העובר מוקדם בקטניות הדגם Medicago truncatula (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: חקור את תהליך האמבריוגנזה המוקדמת ב-Medicago truncatula באמצעות קישור מורפולוגיית הפרי לשלבי עובר זיגוטיים ותרבית רקמות ליצירת עוברים סומטיים. שיטות אלו מאפשרות ניתוח ביטוי גנים ב-qPCR ובהדמיה חזותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי CEO348212 המענקים של מועצת המחקר האוסטרלית ואוניברסיטת ניוקאסל. הסיוע של ד"ר סם ז'אנג זוכה להכרה.

1. פיתוח העובר Zygotic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומר צמחי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול Medicago truncatula סוג בר Jemalong או isogenic הקרוב, מאוד מחדש generable גנוטיפ Jemalong 2HA 13 (המכונה 2HA) בחממה עם photoperiod 14 שעות ו / 19 ° טמפרטורת יום / לילה C 23 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירס פני השטח של קליפת הזרע (עם מחט G 23) לפני זריעת הזרע כך המים שהורשו להיכנס לזרע ולספוג במים למשך הלילה. להוסיף מספיק מים כדי לכסות את הזרע באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרוע זרעים 3 בכל סיר בקוטר 15 סנטימטר (כולל של 10 סירים) בתערובת שתילה (חול, פרלייט, קויר-כבול הגס (1: 1) בתוספת 5 גרם של תקן Osmocote מדויק:: 1 דשן שחרור איטי) והעברה ל חממה. שמור השתיל הבריא לאחר נביטה ולכן יש צמח 1 לסיר ולהקיף ידי סבכה למפעל נובע לטפס. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרמילי קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תרמילים מwסוג הכשרת היישוב Jemalong או 2HA להשיג שלבי עובר המוקדם המתאימים כמתואר 9 ראשון. הערה: שלבי התרמיל השונים מוצגים באיור 1 ושלבי עובר המקביל מוצגים באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את השלבים השונים בתרמיל הקציר באמצעות קריטריונים לפי טבלת 1. מדוד את הזמן שחלף מהשלב 6 כדי לעזור שלבים נפרדים 6 ו -7 (טבלה 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח ביציות מתרמילים ובדיקת שלב העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד ביציות מתרמילים באמצעות מלקחיים עדינים לבד או מיקרוסקופ לנתח סטריאו ומלקחיים בהתאם לצורך. אם נדרש שלב העובר ניתן לבדוק במהירות באמצעות מיקרוסקופ מתחם סטנדרטי (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן שונה הפתרון של Hoyer מכיל 7.5 גרם מסטיק ערבי, 100 כלורל גרם, 5 מיליליטר גליצרול, 60 מיליליטר deionized מים מזוקקים. ממיסים על ידי ערבוב במשך 3-5 שעות או לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך יותר לחדדמיקרוסקופיה ד לנקות את הביציות גזור ב15,16 הפתרון של Hoyer שונה. בזהירות להרים את הביציות ללא פגע ומקום בנפח קטן של הפתרון של Hoyer (מספיק כדי לכסות את הביצית) בטמפרטורת חדר עד ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה דגימות עם התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) אופטיקה. ללכוד תמונות iwth מצלמה דיגיטלי 9 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג ביציות אחידות ביותר מאזור התרמיל המרכזי ולצבור את המספר הנדרש. דוגמא מוצגת באיור 3 א. לאסוף את הביציות על קרח ולאחסן בטמפרטורה הנדרשת (חומצות -80 ° C לגרעין) לניתוח נוסף. הערה: לפרטים על ניתוח סעיפים היסטולוגית, מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים, וכלאה באתר אנא ראה ניירות 8,9. </li></ol></li></ol> 2. פיתוח העובר סומטי במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מ &#39; לא זן truncatulaכובע הוא מסוגל ליצור בקלות עובר בתרבות. לפרוטוקול זה לexplants העלה להשתמש בצמחי 2HA 13,17 שישנים 2-4 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח עלונים מעלו trifoliate האחרון כמעט הרחיבו באופן מלא של גזע מתארך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העלים trifoliate על מגבת נייר לחה בסיר תרבות כדי למנוע התייבשות. הערה: לאחר העלים trifoliate נקצרים הם צריכים להיות מנוצלים עם עיכוב מינימאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של מדיום התרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 10 P4: 4: 1: 5 בינוניים באגר (0.8% w: V) ב9 סנטימטרים צלחות פטרי. הערה: 10 P4: 4: 1: 5 בינוניים מורכב של מדיום בסיס P4 18 בתוספת 10 חומצת 1 מיקרומטר-naphthaleneacetic (NAA), 4 מיקרומטר 6-benzylaminopurine (BAP), 1 מיקרומטר חומצת abscisic (ABA) ו -5 מיקרומטר gibberellic חומצה (GA). השימוש בGA + ABA מאיץ היווצרות עובר וגורם לעליות מהותיות במספר עובר 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכיבים את מדיום בסיס P4 בL 1; בהיקף של מלחים גדול (לעשות calciuמ &#39;עד בנפרד), מלחי קטין וויטמינים (לוח 3), ברזל chelated (לפצות בנפרד), casamino חומצות (hydrolyzate קזאין), 30 גרם סוכרוז, 8 אגר ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות מניות חנות של מלחים גדול, סידן, חומצות casamino, מלחים ויטמינים וקטין ב -20 מעלות צלזיוס aliquots המתאים. אחסן ברזל chelated ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכיבים את ברזל chelated (200x) על ידי המסת 7.44 גרם של Na 2 EDTA • 2H 2 O בכ 900 מיליליטר של מים מזוקקים deionized תוך ערבוב, ואז להביא את הפתרון ל98-99 מעלות צלזיוס תוך הוספת 1.853 גרם של 4 FeSO • 7H 2 א &#39; לבסוף לעשות עד 1 ליטר כאשר המרכיבים מומסים. חנות בענבר צבעונית בקבוקים ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכיבים את מדיום בסיס P4 עם פתרונות המניות כבטבלה 4. ההורמונים במדיום הם 10 מיקרומטר NAA, 4 BAP מיקרומטר, ABA 1 מיקרומטר, 5 מיקרומטר GA (ראה טבלת טבלה 4 וחומרים ספציפיים). הוסף את NAAוBAP לפני מעוקר ולהוסיף ABA וGA לאחר המעוקר וקירור לכ -55 מעלות צלזיוס, באמצעות עיקור מסנן עם 0.22 מיקרומטר סינון מצורף מזרק. מערבבים היטב על ידי מתערבל עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את התקשורת לpH 5.8 עם 1 M KOH לפני מעוקר. החיטוי בC ° 121 במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המעוקר להוסיף ABA המסנן מעוקר וGA, ויוצקים כ 25 מיליליטר של תקשורת ל9 סנטימטרים צלחות פטרי סטרילי בזרימה למינרית או ארון Biohazard. מגניב ולתת את אגר קבע עם המכסה. ואז לשים על המכסה ולוודא שאין עיבוי על המכסה. תווית כנדרש ולאחסן ב 4 ° C (בקופסא קרטון כדי למנוע עיבוי מכסה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיקור של רקמת העלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבוד בזרימה למינרית עיקור UV או ארון Biohazard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום משאיר לרשת הכדור של infuser אביב תה autoclaved בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את infuser תה המכיל את העלים ב -70% (v: v) אתנול ברחוב ללאסיר ture למשך 30 שניות. הערה: לכל השלבים בהליך זה משתמשים 250 מיליליטר בורג סירי תרבות פוליקרבונט כובע שautoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים ולאחר מכן להעביר ולטבול את רקמת עלה 1: 8 (v: v) אקונומיקה מדוללת (כלור 0.5%) במשך 10 דקות. מערבולת בעדינות מהעת לעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את אקונומיקה ולהעביר את infuser התה בסיר תרבות המכיל מים מזוקקים deionized סטרילית. מערבולת בעדינות וניקוז מים עודפים. חזור עוד פעם אחת עם סיר תרבות טרי של מים מזוקקים deionized סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר עלים מinfuser התה עם מלקחיים סטריליות לסיר תרבות טרי של מים מזוקקים deionized סטרילית. ברגים בכובע סטרילי ולשטוף על ידי היפוך ומתערבל. השאר עלים צפים על המים סטריליים עד מוכן להכין explants. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה וציפוי Explants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שימוש בטכניקות סטרילי, לקצץ עלונים מעוקרים בודדים מהקצה עם אזמל, וחתך את המלבן שנותר לשניים או thrEE explants המלבני (8-10 x 3-5 מ&quot;מ) עם אמצע הווריד במרכזו של כל explant (איור 5 א). הערה: הגודל של explant הוא די חשוב בייזום שפשף הראשון. לבצע את החיתוך על עפעפי סטרילי ממכלי מזון לקחת משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 6 explants במדיום התרבות-הגדילו את אגר ב9 מנות קוטר סנטימטר פטרי (איור 5). צלחת בצד abaxial explants למטה כדי לשמור על אוריינטצית עלה רגילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את צלחות פטרי עם Parafilm (איור 5 ג) נמתחו סביב הצלחת. הרקמה מוכנה לדגירה עכשיו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות בחושך על 28 מעלות צלזיוס בטמפרטורה מבוקרת חדר או ארון צמיחה לאורך כל תקופת התרבות. הערה: explants ייזום dedifferentiation, לעבור חלוקת תא, התפשטות (היווצרות יבלת) ועובר (בידול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת expla ההבחנהNTS לאחר 3 שבועות למדיום חדש. בתת-תרבות זו להעביר את כל explant בעזרת מרית סטרילי נירוסטה ומלקחיים, בזרימה למינרית או ארון Biohazard. כשפשפתי מתרחש והיבלת חורגת מהגודל של אחד הגדול באיור 5 ג, להעביר 50% מהיבלת בודדת כאשר subculturing למדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לעוברים הראשונים בכ -4 שבועות. אמנם יש מידה מסוימת של תיאום, לאסוף שלבי עובר שונים על תקופת דגירה 4-8 שבוע (איור 6 א &#39;, ב&#39;). לאסוף תחת מיקרוסקופ לנתח ותהליך על פי מטרות ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת-תרבות כל 3 שבועות ולהסיר עובר מעת לעת, כך שexplants ימשיך לייצר עוברים במשך 3 חודשים. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gepts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legumes+as+a+model+plant+family.+Genomics+for+food+and+feed+report+of+the+cross-legume+advances+through+genomics+conference%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference.</a> Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).</li>
<li>Graham, P. H., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legumes%3A+importance+and+constraints+to+greater+use%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Legumes: importance and constraints to greater use.</a> Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).</li>
<li>Young, N. D., Udvardi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Medicago+truncatula+genomics+to+crop+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).</li>
<li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+genome+provides+insights+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li>
<li>Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+Medicago+truncatula+seed+development+establishes+the+time+frame+of+diverse+metabolic+processes+related+to+reserve+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation.</a> Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).</li>
<li>Verdier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+M.+truncatula+transcription+factors+identifies+putative+regulators+of+grain+legume+seed+filling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling.</a> Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).</li>
<li>Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-genomic+studies+of+developmental+processes+in+legume+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).</li>
<li>Wang, X. -D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+embryo+sac+to+oil+and+protein+bodies%3A+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).</li>
<li>Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+early+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).</li>
<li>Mansfield, S. G., Briarty, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryogenesis+in+Arabidopsis+thaliana.+2.+The+developing+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Botany%22%5BJournal%5D)">Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo.</a> Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).</li>
<li>Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+regulation+of+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs.</a> Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).</li>
<li>Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slicing+across+kingdoms%3A+regeneration+in+plants+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals.</a> Cell. 132 (4), 697-710 (2008).</li>
<li>Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+highly+regenerable+seed+line+Jemalong+2HA+for+transformation+of+Medicagotruncatula+-+implications+for+regenerability+via+somatic+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis.</a> J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).</li>
<li>Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+ABA+and+GA+synergism+increases+somatic+embryogenesis%2C+facilitates+its+genetic+analysis+and+improves+transformation+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula.</a> PloS ONE. 9 (6), e99908(2014).</li>
<li>Liu, C. M., Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+titan+mutants+of+Arabidopsis+are+disrupted+in+mitosis+and+cell+cycle+control+during+seed+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development.</a> Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).</li>
<li>Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+SOMATIC+EMBRYOGENESIS+RECEPTOR-LIKE+KINASE+1+%28SERK1%29+gene+is+associated+with+developmental+change+in+the+life+cycle+of+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).</li>
<li>Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIantcheva%2C+A+%22The+Medicago+truncatula+handbook%22">The Medicago truncatula handbook</a>. Mathesius, U. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.noble.org/MedicagoHandbook">http://www.noble.org/MedicagoHandbook</a> (2006).</li>
<li>Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+interspecific+somatic+hybrids+of+Medicago+by+using+Agrobacterium+transformed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues.</a> Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).</li>
<li>Ochatt, S. J. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOchatt%2C+SJ+%22Plant+Embryo+Culture%3A+Methodsand+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22">Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology</a>. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Springer protocols, Humana press. 39-52 (2011).</li>
<li>Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+MtSERF1+of+the+ERF+subfamily+identified+by+transcriptional+profiling+is+required+for+somatic+embryogenesis+induced+by+auxin+plus+cytokinin+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

הפרוטוקולים שתוארו הם יחסית ישר קדימה ולאפשר חקירה של עובר קטניות עם כל התא העכשווי וטכניקות מולקולריות. אנו מכירים בכך שיש יתרונות וחסרונות של שני in vivo ובגישות חוץ גופית. שני לאפשר יותר דגש על עובר מוקדם בהשוואה לתרבות של זרעים בשלים 19. במקרה של מחקרי in vivo מה שמתואר הוא בעיקר הבידוד של הביצית מהתרמיל אשר מתאים ללימודי עובר רבים. זה כמובן אפשרי כדי להעשיר עוד יותר לרקמות עובר ע...

קטניות הן המשפחה השלישית בגודלה של צמחים גבוהים עם כ -20,000 מינים ומשפחת בלאגאמינוסא (או Fabaceae) הם שני לדגנים באזור שנקטפו וייצור כולל 1. סויה היא היבול טיפח השלישי בגודלה. קטניות דגנים מספקות כשליש מחלבון תזונתי ושליש משמן צמחי למאכל אדם 2. קטניות עם קיבולת תיקונם N 2 גם לתרום למערכות חקלאיות ברות קיימא. Truncatula Medicago, כמו סויה, חלבון חנויות ונפט בפסיגים של הזרעים והוא מודל קטניות גנטי והגנומי עם משאבים גנטיים והגנומי רבים 3,4. בעוד מ &#39; truncatula אפשר התקדמות בהבנת הסימביוזה הקטניות-rhizobium 4 זה כבר מועסק יותר ויותר ללמוד ביולוגיה זרע קטניות 5-7 ועובר 8,9. עובר ארבידופסיס נחקר בהרחבה 10,11 אבל זה אניללא קטניות sa ואת הפרטים של עובר אינן זהות לMedicago 8,10. עובר Zygotic במ &#39; יש truncatula תכונות מעניינות, עם היפופיזה ייחודית רב-תאית, suspensor endoployploid ותא העברת בסיס 8. עובר סומטי (SE) משמש בדרך כלל לחידוש צמחים 12. במודל הקטניות מ &#39; truncatula, קו זרע Jemalong 2HA (2HA) פותח מההורה Jemalong יש שיעור גבוה של עובר גופני 13. לאחרונה מספר העוברים שיוצרו כבר עלה באופן מהותי על ידי הוספת שתי חומצת gibberellic (GA) וחומצת abscisic (ABA) למדיום הוותיק 14. במקרה זה GA ומעשה ABA בסינרגיה, שהוא יוצא דופן בהתחשב בכך שGA וABA בדרך כלל לפעול באיבת 14. העוברים המופקים מיבלת לפתח על פני השטח המאפשר לשלב של עובר להיות בקלות נקבע visually ונקטף בקלות. לאחר ליד קווי isogenic שembryogenic (2HA) ולא embryogenic (Jemalong) מאפשרת החקירה של עובר גופני ושיש שני in vivo ובמערכות מבחנה מספקת אפשרויות ניסויים שונות. הבנת המנגנונים התאיים ומולקולריים של התפתחות עובר היא חיונית לזרע הבנה והתפתחות צמח. בקטניות, כמו בdicotyledons האחר, זה הפסיגים של העובר שלאחסן את המוצרים המשמשים לתזונת אדם. עובר מוקדם כרוך חלוקת תא מהירה, ודפוסי עובר נכונים. בכ 8 ימים לאחר ההפריה, מ &#39; עובר truncatula מגיע שלבים מוקדמים טבורית. אפיון מורפולוגי לא הצביע בדיוק על ידי ימים לאחר הפריה בתנאי חממה. לפיכך, גישה סטנדרטית יעילה כדי לציין את השלב של עוברים מתפתחים היא רבת ערך בלימוד regul הגנטיני של עובר zygotic המוקדם. במאמר זה, אנו מספקים שני פרוטוקולים סטנדרטיים לאסוף עוברים מתפתחים למחקרים ביולוגיים של עובר במודל הקטניות מ &#39; truncatula. הראשון הוא לאסוף עוברי zygotic ידי שיוך מורפולוגיה עובר ותרמיל ואילו השני הוא עובר גופני באמצעות explants עלה culturing לספק מספרי עובר גדולים לגשת בקלות.

<table><tbody><tr><td>P4 בינוני</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td>השתמש בכימיקלים סיגמא-אולדריץ' או ספק אחר בדרגה אנליטית</td></tr><tr><td>מלחים עיקריים מלחים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מינוריים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ויטמינים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>בקטו מעבדות</td><td>214010</td><td>בקטו אגר</td></tr><tr><td>הורמונים צמחיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1- חומצה נפתלינאצטית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td>ממיסים בכמות קטנה של 1 M NaOH</td></tr><tr><td>חומצה אבציסית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1049</td><td>ממיסים בכמות קטנה של 1 M NaOH</td></tr><tr><td>6-Benzylaminopurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3274</td><td>ממיסים במי MQ עם חימום וכמה טיפות 1N HCl</td></tr><tr><td>חומצה ג'יברלית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7645</td><td>ממיסים בכמות קטנה של אתנול</td></tr><tr><td>ציוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סטריאו מנתח מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>MZFLIII</td><td>או</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור</td> דומה <td>Zeiss</td><td>Axiophot</td><td>או דומה, עם אופטיקה מתאימה</td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam HRc</td><td>או דומה</td></tr><tr><td>עיקור עלים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 מ"ל מכסה בורג מיכל פוליקרבונט עם מכסה פוליפרופילן</td><td>SARSTEDT</td><td>75.9922.519</td><td>ניתן לחיטוי</td></tr></tbody></table>

פרוטוקולים לקבלת zygotic וסומטי עוברים ללימוד תקנה של פיתוח העובר מוקדם בקטניות הדגם<em&gt; medicago truncatula</em

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

עובר מוקדם החל מהזיגוטה תא בודדת עובר דרך חלוקת תאים מהירה והמורפוגנזה, ומאופיין מורפולוגית בשלבים טרום-כדורי, כדורי, לב, טורפדו וטבורית. פיתוח מתקדם זה הוא תחת הרגולציה ההדוקה של רשת מולקולרית מורכבת. קציר עוברים מוקדם מספיק בשלב דומה של פיתוח הוא חיוני לחקירת הוויסות התאית ומולקולרית של עובר מוקדם. זה לא פשוט מאז עובר מוקדם עובר המורפוגנזה מהירה בזמן קצר לדוגמא 8 ימים לMedicago truncatula להגיע שלב טבורית המוקדם. כאן, אנו מתייחסים לנושא בשתי גישות. הראשון קובע זיקה בין התפתחות עובר ומורפולוגיה תרמיל בסיוע מצביע על השלב של עובר zygotic. זה מבוסס בעיקר על מספר ספירלות תרמיל והפיתוח של עמוד השדרה. דרך חלופית כדי להשלים את in vivo שלtudies הוא באמצעות explants עלה culturing לייצר עוברים גופניים. הבינוני כולל שילוב הורמון יוצא דופן - אוקסין (חומצת 1-naphthaleneacetic), ציטוקינין (6-benzylaminopurine), חומצת abscisic וחומצת gibberellic. ניתן להבחין בשלבים השונים הצומחים מתוך היבלת ללא נתיחה.

למבני תרמיל zygotic עובר שונה המתאימים לשלבי עובר השונים מוצגים באיור 1 א - F ואילו שלבי העובר השונים מוצגים באיור 2 א - F. על ידי בחירת תרמילים באותו השלב, דגימות של ביציות שניתן להשיג אחיד למדי (איור 3 א). על ידי שימוש בעובר RT-qPCR גנים ספציפיים יכולים להיות מזוהים בקלות ומחקרים כמובן זמן מוערך 9. כמה נתיחה נוספת תאפשר להעשרה נוספת של העובר (איור 3). עיבוד באתר</...

המטרה היא להמחיש שניתן להשתמש בקלות במודל הקטניות Medicago truncatula כדי לחקור את הוויסות של עובריות צמחים מוקדמות כדי להשלים את מודל ה-Arabidopsis שאינו קטניות. מורפולוגיה של תרמילים קשורה לשלבי אמבריוגנזה זיגוטית ומסופק גם פרוטוקול לאיסוף עוברים באמצעות תרבית רקמה.

פרוטוקולים לקבלת Zygotic וסומטי עוברים ללימוד תקנה של פיתוח העובר מוקדם בקטניות הדגם<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

המטרה הכוללת של הפרוצדורות הבאות היא להדגים כמה עוברים של cargo tula ניתן להשיג בשלבי התפתחות שונים כדי לחקור את הוויסות הגנטי של האמבריוגנזה בצמחים; ניתן להשיג זאת על ידי קישור מורפולוגיית התרמיל לשלבי ההתפתחות השונים של העובר הזיגוטי, ועל ידי תרבית של אקספלנטים מעלה להשגת עוברים סומטיים בשלבים השונים. לבסוף, ניתן להשתמש ב-quantitative PCR וב-beta glucuronidase כדי להעריך את ביטוי הגנים במהלך האמבריוגנזה בשלבי ההתפתחות הספציפיים הרלוונטיים. היתרונות של טכניקות אלו הם שסימון של פרחים בודדים אינו נדרש עבור הניסויים in vivo, והפרוצדורות המיוטבות in vitro מספקות גישות ניסיוניות משלימות.הדגמה חזותית של הליך התרבית היא חשובה כיוון שהיא מאפשרת מעקב הדוק יותר אחר פרטי המניפולציות. Wang ידגים את ההליך in vivo בעוד ש-Kim Nolan תדגים את ההליך in vitro. כדי להקל על התפתחות העוברים הזיגוטיים, נקב את פני השטח של מעטפת הגרעינים של זרעים מצמח Monte cargo trinocular והשרה את הזרעים למשך הלילה, כשהם מכוסים במים באופן מלא.ביום למחרת, זרעו שלושה זרעים בכל אחד מ-10 עציצים בעלי קוטר של 15 סנטימטר עם תערובת שתילה, והעבירו את העציצים לחממה. גדלו את הצמחים תחת מחזור תאורה של 14 שעות עם טמפרטורות יום ולילה של 23 עד 19 degrees Celsius; לאחר הנבטה, השאירו את השתילים הבריאים ביותר כך שיהיה צמח אחד לכל עציץ, והקיפו את השתילים בסבכה כדי שגבעולי הצמחים יוכלו לטפס עליה עם הופעת התרמילים. אספו את הדגימות בשלבים המתאימים המפורטים בטבלה 1 ובאיור 1 כדי להגיע לשלב הפיתוח הרצוי של העובר המוקדם.בשלב הבא, השתמשו בפינצטה כדי לבודד את ה-les מהתרמיליים. לחלופין, לצורך מיקרוסקופיה מדויקת יותר, לאחר שקיפות מלאה בתמיסת Hoyer, ניתן לאשש את שלבי העובר באמצעות הדמיה של העוברים תחת מיקרוסקופ אור קומפוזיט סטנדרטי. לאחר מכן, אספו את מספר ה-UL הדרושים לניסוי מהאזור המרכזי של התרמיל ואחסנו אותם בטמפרטורה המתאימה לצורך אנליזות המשך של התפתחות עוברים סומטיים.קצרו למטרות ביצוע in vitro עלים מהעלים העליונים האחרונים, המורחבים כמעט במלואם, של גבעול מאורך של זן tran atula המסוגל ליצור עובריים בקלות בתרבית. שמרו את העלים העליונים על נייר סופג לח בתוך כלי תרבית כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, בעבודה בתוך קבינה בטוחה (biosafety cabinet) שעברה סטריליזציה ב-UV, הניחו את העלים בתוך הכדור הרשתי של מסננת תה מנירוסטה שניתן לעקר באוטוקלאב.טבילה של האינפיוזר ב-70% Ethanol בתוך בקבוק אוטוקלאב בנפח 250 milliliter עם פקק הברגה. לאחר 30 שניות, בתוך כלי גידול מפוליקרבונט, יש לנקז את רקמת העלה ולאחר מכן להטביעה את האינפיוזר בתמיסת הלבנה בדילול של אחת לשמונה למשך 10 דקות. תוך כדי ערבוב עדין מדי פעם, יש לנער בעדינות את הכלי ולנקז את עודפי המים.לאחר מכן, שטפו את מסננת התה. פעם נוספת במים דה-יוניים טריים בכלי חדש. כעת, השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להעביר את העלים ממסננת התה לתרבית טריה, בכלי המכיל מים מזוקקים דה-יוניים סטריליים, והבריגו את המכסה הסטרילי.לאחר מכן, שטפו את העלים על ידי הפיכה וסחרור. לאחר מכן, הניחו לעליקים לצוף במים סטריליים לצורך זריעת השתלים. גזרו את קצוות העליקים הסטריליים הבודדים תוך שימוש בטכניקה סטרילית.לאחר מכן, חתכו את המלבן שנותר לשניים או שלושה מקטעי רקמה (explants) מלבניים בגודל של 8 עד 10 על 3 עד 5 מילימטר, כאשר העורק המרכזי נמצא במרכז כל מקטע רקמה. מקמו שישה מקטעי רקמה לכל מצע תרבית מוצק באגר, בצלחות פטרי בקוטר של 9 סנטימטר, כאשר צד ה-ABA פונה כלפי מטה כדי לשמור על אוריינטציית העלה הרגילה.לאחר מכן, אטמו את צלחות הפטרי עם perfil והדגירו את הצלחות בחושך בטמפרטורה של 28 degrees Celsius בחדר עם בקרת טמפרטורה. לאחר שלושה שבועות, השתמשו בשפכטל סטרילי מפלדת אל-חלד ובפינצטה כדי להעביר תרביות של נתחי הרקמה המבדילים למצע טרי. העוברים הראשונים צפויים להופיע לאחר כארבעה שבועות עם היווצרות קלוס, כאשר הקלוס יעלה בגודלו על נתח הרקמה הגדול ביותר המוצג כאן.העבירו רק 50% מהקאלוס האינדיבידואלי בעת התרבית המשנית למצע טרי. לבסוף, השתמשו במיקרוסקופ סטריאו כדי לאסוף את שלבי העובריות השונים לאורך תקופת דגירה של ארבע עד שמונה שבועות, תוך עיבוד האקספלנטים בהתאם למטרות הניסוי. לאחר קצירת עובריות זיגוטיות כפי שהודגם הרגע, ניתן להשתמש בהמשך ב-C בשני כלאים או באסטרטגיות מתאימות אחרות; כפי שניתן לראות בתמונות אלו, וזהו נושא בעל עניין מיוחד, ניתן להבחין בהבדלים בין ה-SSIS לבין ה-Spencer על ידי מעקב אחר האקספלנטים שנטעו בצלחות.במהלך השבועות הרביעי עד השמיני ניתן לאתר ולבחור עוברים סומטיים בשלבים מובחנים לצורך ניתוח מיידי. לדוגמה, נתונים אלה ממחישים כיצד עוברים בשלב ה-Olein המוקדם מראים ביטוי של סוג אחד של גן medicago Tula eoin, אך לא של סוג אחר. יתרון מסוים של מערכת העוברים הסומטיים הוא שניתן לבצע טרנספורמציה של הקאלוס ללא צורך ברגנרציה של צמח שלם.אכן, כפי שהודגם כאן. ניתן להשתמש ב-Beta glucuronidase כדי להמחיש ביטוי גנים בשלבים השונים של האמבריוגנזה. לאחר צפייה בסרטון, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הבחירה והניתוח של ה-pod להשגת Andres.עליך להחזיק גם בהבנה טובה של אופן ההכנה וההזרעה של אקספלנטים סטריליים לצורך אמבריוגנזה סומטית לאחר פיתוחם. טכניקות אלו אפשרו את חקירת הבקרה השעתית של השלבים המוקדמים של האמבריוגנזה ביחס לצמיחת העובר, התפתחותו ואגירת חומרי הזנה.

protocols-for-obtaining-zygotic-somatic-embryos-for-studying

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מדווחים שיטה יעילה ופשוטה לבודד את העוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח...

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

פרוש הזברה (Taeniopygiaguttata) הוא אורגניזם מודל בעל ערך; עם זאת, שלבים מוקדמים של התפתחות פרוש הזברה לא נחקרו בהרחבה. הפרוטוקול מתאר כיצד לנתח עוברים מוקדמים ליישומים התפתחותיים ומולקולריים.

נתיחה וניתוח במורד הזרם של הזברה פינק עוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח

שיטות המייצרות עוברי morphant חיוניות ללמוד מנגנוני התפתחות ורשתות רגולציה גן. כוכב הים Patiria miniata הוא מערכת מודל מתעורר ללימודים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת תאי רבייה, בהפקת תרבויות של עוברים, וmicroinjection המהיר של zygotes ממין זה.

שיטה לMicroinjection של Minata Patiria Zygotes

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

פרוטוקול זה מתאר שיטת התבוננות מופרה ב תודרנית באמצעות סיווג ביצית ואחריו את הבדיקה של היווצרות תבנית העובר תחת מיקרוסקופ.

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

כתב יד זה מתאר במבחנה ביצית טיפוח שיטה המאפשרת הדמיה לחיות תאים של תודרנית מופרות, העוברים. בשיטה זו הוא מנוצל כדי להמחיש את הדינמיקה תאיים במהלך זיגוטה קיטוב מפרט הגורל תא בפיתוח עוברי.

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

גנים מורפולגניים הצמח יכול לשמש כדי לשפר את הטרנספורמציה גנטית של גנוטיפים הסרבן. המתואר כאן הוא Agrobacterium-תיווך הטרנספורמציה גנטית (quickcorn) פרוטוקול עבור שלושה חשובים הציבור תירס שורות.

Agrobacterium-תיווך המעבר העובר בלתי בוגר של הסרבן מתוך תירס שורות באמצעות גנים מורפולגניים

מאמר זה קובע צינור להשעיה איכותית של תאים בודדים וגרעינים של עוברי עכברים גסטרולטיביים לצורך ריצוף של תאים בודדים וגרעינים.

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

אנו מתארים שיטות להמחשת שעתוק ראשוני במהלך הפעלת הגנום הזיגוטי בתאים בודדים במהלך העובר המוקדם.

המחשת הפעלת הגנום הזיגוטי בתאים בודדים של עוברים מוקדמים

אנו מתארים שיטת היצרה פיזית ליצירת עוברים מיניאטוריים מעוברים חד-תאיים של Xenopus laevis .

מניפולציה פיזית ליצירת עוברים מיניאטוריים של Xenopus

חקור את תהליך האמבריוגנזה המוקדמת ב-Medicago truncatula באמצעות קישור מורפולוגיית הפרי לשלבי עובר זיגוטיים ותרבית רקמות ליצירת עוברים סומטיים. שיטות אלו מאפשרות ניתוח ביטוי גנים ב-qPCR ובהדמיה חזותית.

פרוטוקולים לקבלת Zygotic וסומטי עוברים ללימוד תקנה של פיתוח העובר מוקדם בקטניות הדגם

גלה סרטונים נוספים