Name: הדמיה זקופה של דרוזופילה לשכות ביצה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: למד שיטת הדמיה זקופה לחקר שכבות ביצה של Drosophila melanogaster באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל. הטכניקה מאפשרת תצפית ישירה בסידור תאי האפיתל הפוליקולרי בקטבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מעריכים את עזרתם של חברי קהילת הזבובים, במיוחד ד"ר דניס מונטל, ד"ר לין קולי וד"ר פרניל רורת', עבור ריאגנטים. אנו מודים ל-Flybase, למרכז המניות של בלומינגטון דרוזופילה ולבנק היברידומה למחקרים התפתחותיים על מידע ואספקת מלאי זבובים ונוגדנים, בהתאמה. LM נתמך על ידי מענק משרד החינוך, מלגת הכשרה לסיוע לתארים מתקדמים בתחומי הצורך הלאומי (GAANN) (P200A120017) ועל ידי יוזמת NIGMS למקסום מענק פיתוח סטודנטים (2 R25-GM55036). חלק מעבודת המיקרוסקופיה נתמך על ידי מענק NSF MRI DBI-0722569 ומתקן הדמיית הליבה של קית' ר. פורטר. המחקר נתמך בחלקו על ידי פרס NSF CAREER (1054422) ופרס Basil O'Connor Starter Scholar ממצעד המטבעות, שניהם הוענקו ל-MSG.

1. Dissection של Ovarioles <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כרבע זבובים נקבת 2-4 יום בן וכמה גברים לבקבוקון מזון טרי זבוב עם שמרים יבשים פעילים הוסיפו. השתמש כותנה כתוספת לבקבוקונים, ולהוסיף כמה טיפות של מים לכותנה כדי לשמור על לחות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקון מקום בחממה C ° 25 ל14-16 שעות כדי למקסם את מספר שלב 8-10 תאי ביצה. הערה: זמן דגירה משתנה בהתאם לטמפרטורה ושלב רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת לנתיחה, פתרונות 0.1M KPO 4 וNP40 כנדרש ליום המחרת (ראו חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזבובים באמצעות CO 2, ומניח תחת מיקרוסקופ לנתיחה. Pipet כמה טיפות של תקשורת לנתיחה לכל חלל בשקופית זכוכית הדיכאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק מלקחיים בכל יד בכ 30 מעלות זווית לראש הטבלה ולהתמצא זבוב נקבה אחת עם הכנפיים כלפי מטה. עם היד הלא הדומיננטית שלך, להרים את הנקבה באמצעות מלקחיים, האחיזה בnterior של הבטן, ליד בית החזה, ולהטביע אותה לתקשורת לנתיחה בשקופית הדיכאון (הבלעה איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג מלקחיים האחר, לתפוס את השלד החיצוני באחורית הגחון של הבטן ולחדור מבעד. תפוס את השחלות בקצה האחורי, ואז למשוך אותם אל מחוץ לבטן ומניח לתקשורת טרי בצד השני של שקופית הדיכאון האחר. (הבלעה איור 1 א). הימנע קרע לגזרים את המעיים. מחק את הפגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עם זבובי נקבה האחרים עד שכל השחלות הם גזורים. מחק את הזכרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג אחד של מלקחיים, להחזיק השחלה בסוף האחורי (סמוך לתאי הביצה הגדולים ביותר), ועם היד השנייה להשתמש זוג המלקחיים לצבוט אחד מהתאים קדמי ביותר הביצה (germarium). (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט ובהתמדה, למשוך שרשרת ovariole מתוך מעטפת השחלה. תמשיך לנתח את ovarioles בנפרד עד שכל תאי הביצה הרצויות הם removed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.7-1.8 לכל השחלות גזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת פעולה, להעביר ovarioles לצינור 0.6ml בעזרת פיפטה העברה פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו ovarioles ליישב לתחתית של צינור, ולאחר מכן להמשיך לשלבים תיקון וצביעה. </li></ol> 2. Immunofluorescent (IF) הכתמה של Ovarioles <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את התקשורת לנתיחה מovarioles עם טפטפת. הקפד שלא להסיר את כל ovarioles או תאי ביצה. השאר כ -50 μl של ovarioles ותקשורת לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של paraformaldehyde 16% ל -150 μl של 0.1 מ &#39;4 מאגר KPO בצינור, ולהוסיף פתרון לתאי ביצה כדי לתקן אותם. דגירה בעוד נדנדה במשך 10 דקות. זהירות: paraformaldehyde הוא רעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע ולשטוף פעמיים עם חיץ לשטוף NP40 0.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים במשך 15 דקות כל אחד ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיין סטנדרטי IF פרוטוקול 15 לשלבים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, לאחר קיבוע, להוסיףנוגדנים עיקריים בדילולים המתאימים דגירה O / N ב 4 ° C. לשטוף מספר פעמים בNP40, ולאחר מכן להוסיף נוגדנים משני (1: 200 דילולים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מספר פעמים בNP40, ולאחר מכן להוסיף DAPI (1: 1000) במשך 10 דקות, ולאחר מכן לחזור שוטף. פעם אחת אם הפרוטוקול הוא מלא, להוסיף 200 μl של גליצרול 50% ב- PBS לתאי ביצה ותן לו לשבת בRT עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון, להחליף אותו עם גליצרול 70% ב- PBS, ומכסה בנייר כסף. הנח מדגם ב 4 ᵒC עד מוכן להרכבה. בינתיים, תמשיך עם שלב 3. </li></ol></li></ol> 3. Advance הכנת שקופיות ג&#39;לי גליצרין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד לפחות 4 מיליליטר של גליצרין ריבה בעזרת מרית ולמלא צינור תרבות תא זכוכית לסימן חצי הדרך. להמס ריבת גליצרין באמבט מים ב 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים טיפה קטנה של גליצרול, כ -300 μl, מפתרון המניות על שתי שקופיות מיקרוסקופ. שימוש ברקמה, להפיץ גליצרול בla דקYer פני כל אחת מהשקופיות. זה מספק בסיס ומאפשר להסרת קלה של ג&#39;לי גליצרין בשלב 5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הקצה של קצה פיפטה 1,000 μl מסונן. קצה פיפטה לחתוך שימוש להעברת 1,000-1,500 μl של ג&#39;לי גליצרין החם לאט לכל שקופית מיקרוסקופ. לטפל כדי למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו שקופיות ג&#39;לי גליצרין לשבת במשך 5 דקות בRT להגדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל שקופית ג&#39;לי גליצרין ב 60 מ&quot;מ × 15 מ&quot;מ צלחת פטרי ולכסות בניילון הנצמד. מקום 4 ° CO / N. לחלופין, חנות גליצרין שקופיות ריבה עד 5 ימים על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. הרכבה צ&#39;יימברס הביצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דגימות מהשלב 2.5, טיפות 3 μl כמה פיפטה של ​​תאי ביצה בגליצרול 70% על פני שקופית ג&#39;לי גליצרין אחד. המשך pipetting 3 טיפות μl עד שכל תאי הביצה בשקופית זו. ודא שכל טיפה מכילה לפחות עשרה תאי ביצה. בינתיים, מחמם צינור תרבות של ג&#39;לי גליצרין באמבט המים C ° 55. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקף ג&#39;לי גליצרין עם תאי ביצה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. התאם הגדלה, כך שרק טיפה אחת של תאי ביצה היא בשדה הראייה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 30 מד ככפית, להרים את תא ביצת שלב הרצוי. כאשר תאים נחוצים, נפרדים רצויים ביצה משרשרת ovariole באמצעות המחט כסכין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להימנע מפסולת שעלול להפריע להדמיה, להעביר את תא הביצה לשקופית ג&#39;לי גליצרין השני, עם הקדמי פונה שמאלה (איור 1E -1). חזור על פעולה עד שיש לפחות שבעה תאי ביצה בשורה בטור (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טופס עמודות חדשות של שבע עד שכל תאי הביצה הרצויות מועברים לשקופית ג&#39;לי גליצרין השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתלוש פיסה קטנה של רקמה ושזירה. להשתמש בזה כדי לספוג את PBS-גליצרול העודף מתאי הביצה על ידי נוגע בקלילות כל אחד. יש להיזהר שלא להסיר את תאי ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנותקקצה קצה פיפטה 200 μl מסונן. להשתמש בזה כדי להעביר 150 μl של גליצרין ג&#39;לי כדי לכסות את כל העמודות של תאי ביצה. הערה: כמות ריבת גליצרין הדרושה כדי לכסות את העמודות מבוססת על שלבי תא ביצה ומספר העמודות. הסכום עשוי להיות מותאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו תאי ביצה רכובים לשבת במשך 5 דקות ב RT עד השכבה העליונה של ג&#39;לי גליצרין הוא התגבש לגמרי (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופית מקום תאי ביצה רכובים בצלחת פטרי מ&quot;מ 60 מ&quot;מ × 15 ומכסים בניילון נצמד. חנות ב 4 ° CO / N כדי לאפשר את שכבות ריבת גליצרין כדי לחזק יחד (מקום בחושך, אם קיים חשש לגבי photobleaching). </li></ol> 5. הכנת לשכות ביצת הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות של תאי ביצה רכובים תחת מיקרוסקופ לנתיחה. התאם הגדלה, כך שרק אחד עמודה של תאי ביצה היא בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל זעיר 45 ° זווית, לחתוך straigקו ht בצדו הימני של העמוד הראשון של תאי ביצה (קרובים לצד האחורי של תאי הביצה). (איור 1D-E) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לחתוך מעל תא הביצה הראשון בחלק העליון ומתחת לתא הביצה האחרון בטור. בשלב זה הטור של תאי ביצה יש לחתוך משלושה צדדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microknife, הפרוסה בצדו השמאלי של העמוד, קרוב ככל האפשר לצד הקדמי של תאי הביצה (איור 1E -3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה של ​​קר 1X PBT 100 μl על העמודה לחתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במרית קצוות עגול כדי להסיר את ג&#39;לי גליצרין העודף סביב שלושה צדדים של טור החתך של תאי ביצה וזורקים, והשאיר את שאר בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המרית בחתך שנעשה בצד הקדמי של תאי ביצה ולהפריד את העמודה מגוש ג&#39;לי גליצרין העיקרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דגימות מיקרוסקופית לאו הפוך (5.8.1) או זקוף (5.8.2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך מיקרוסקופים: העברה tהוא הטור של תאי ביצה לcoverslip עם הצד קדמי של תאי ביצה פונה כלפי מטה. חזור על שלבים 5.2-5.8 עד שכל העמודות של ג&#39;לי גליצרין הוסרו ורכובה. הוסף כמה טיפות של 50% PBS-גליצרול על כל בלוק של תאי ביצה כדי למנוע מהם מהתייבשות. תאי ביצת תמונה ישירות על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיקרוסקופ הזקוף: העבר את העמודה של תאי ביצה לשקופית מיקרוסקופ עם הצד הקדמי פונה כלפי מעלה. חזור על שלבים 5.2-5.9 עד שכל העמודות של ג&#39;לי גליצרין הוסרו ורכובות על שקופיות מיקרוסקופ. הוסף כמה טיפות של 50% PBS-גליצרול על כל בלוק של תאי ביצה וחוסם כיסוי עם coverslip ½ # 1. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68 (1), 207-217 (2014).</li>
<li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila oogenesis.</a> Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li>
<li>Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+follicle+cells%3A+morphogenesis+in+an+eggshell%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell.</a> Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).</li>
<li>Bilder, D., Haigo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+morphogenetic+repertoire%3A+perspectives+from+the+Drosophila+egg%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg.</a> Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).</li>
<li>Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+choreography%3A+mechanisms+orchestrating+the+collective+movement+of+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).</li>
<li>Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).</li>
<li>Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border-cell+migration%3A+the+race+is+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Border-cell migration: the race is on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).</li>
<li>Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+JAK%2FSTAT+signaling+throughout+border+cell+migration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila.</a> Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).</li>
<li>Ghiglione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cytokine+receptor+Domeless+controls+border+cell+migration+and+epithelial+polarization+during+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis.</a> Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).</li>
<li>Denef, N., Schüpbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning%3A+JAK-STAT+signalling+in+the+Drosophila+follicular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium.</a> Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).</li>
<li>Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK%2FSTAT+pathway+is+required+for+border+cell+migration+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis.</a> Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).</li>
<li>Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((slow+border+cells%2C+a+locus+required+for+a+developmentally+regulated+cell+migration+during+oogenesis%2C+encodes+Drosophila+C%2FEBP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP.</a> Cell. 71 (1), 51-62 (1992).</li>
<li>Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gradient+of+JAK+pathway+activity+patterns+the+anterior-posterior+axis+of+the+follicular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium.</a> Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+EGFR+ligands+participate+in+guiding+migrating+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells.</a> Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).</li>
<li>Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+localisation+of+cytokine+mRNA+is+essential+for+JAK%2FSTAT+activation+during+cell+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness.</a> Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).</li>
<li>Hayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypicans+regulate+JAK%2FSTAT+signaling+and+distribution+of+the+Unpaired+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen.</a> Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).</li>
<li>Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+protein+movement+in+syncytial+Drosophila+follicle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells.</a> J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).</li>
<li>Rørth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+gain-of-function+genetics+in+Drosophila%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Systematic gain-of-function genetics in Drosophila).</a> Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li>
<li>Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+response+of+protein+localization+and+microtubule+organization+to+nutrient+stress+during+Drosophila+early+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis.</a> Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).</li>
<li>Quiñones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li>
<li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carnegie+protein+trap+library%3A+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).</li>
<li>Belu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upright+imaging+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Upright imaging of Drosophila embryos.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-on+imaging%3A+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנו מתארים שיטה להר ותמונה קטנה, פיתוח תאי ביצה מנקודת מבט סוף-על. טכניקות נפוצות לתאי ביצת הדמיה מותאמות להשקפות לרוחב ובעיקר לאפשר להדמיה מדויקת של תאי זקיק Medio-צדדי כאשר מוכתם עם נוגדני ניאון. השימוש בZ- ערימות או עזרי שחזורים 3-D בצפיית מטוסי מוקד מרובים, אבל עדיין לא מספיק לפתרון משנה הסלולר של הקטבים של תאים סגלגלים ביצה (איור 2 ד). אמנם זה ניתן להתגבר באופן חלקי עם שיטות מיקרוסקופיה החדשות כגון הדמיה ברזולוציה סופר, השיטות אלה הן יקרות ולא תמיד זמינות...

מחקר של melanogaster תסיסנית סיפק תובנות גדולות לרגולציה הגנטית של מגוון רחב של תופעות. בפרט, חל מחקר מקיף על התפתחות ביצית, כי אאוגנזה מספקת דרך צייתנית לחקור תהליכים רבים ושונים התפתחותיות, כוללים דפוסי רקמה, שינויי קוטביות תא, מיתוג מחזור התא, ורגולצית translational 1,2,3,4. אירוע morphogenic אחד חשוב במהלך אאוגנזה הוא המפרט, הרכישה של תנועתיות, וההגירה של קבוצה של תאים הנקראים תאי גבול (שנסקרו ב5). מאז נדידת תאים הוא תכונה מרכזית של המורפוגנזה בעלי החיים, ובגלל הרגולציה הגנטית של תהליך זה נשמרת היטב, מנגנונים שנקבעו בזבובים עשויים להיות חשוב בהקשרים אחרים. לפיכך, אנו חוקרים את השליטה המולקולרית של נדידת תאי גבול. ללימודים שלנו, פיתחנו שיטה חדשה כדי לבחון את הקטבים הקדמי של פיתוח ביצים,שבו תאי גבול להתעורר, לבחון כיצד הם מפתחים בפירוט. בתוך השחלה, תאי ביצה בשלבי התפתחות שונים קיימים לאורך שרשרות נקראות ovarioles, שנארזות בנדן דק (איור 1 א). כל תא ביצה ימשיך ליצור ביצה אחת. במהלך אאוגנזה, כמה סוגי תאים שונים חייבים לפתח באופן מתואם. ד תא ביצת melanogaster מורכב מ -16 תאי נבט-קו, כוללים ביצית אחת, מוקף בשכבה אחת אפיתל זקיקי 6. מספר קטן של תאים מיוחדים, הנקרא תאים קוטביים, להתעורר בקטבים הקדמי והאחוריים של האפיתל. תאי הגבול 6-8 מקורן באפיתל הקדמי של תא הביצה, הנגרם על ידי התאים הקוטביים 5,7. באמצע אאוגנזה-(שלב 9), תאי הגבול להתנתק משכניהם ולהעביר בין תאי האחות להגיע לביצית באחורית של תא ביצת 5,7. תנועה זו חייבת להיות מושלמתבעוד תאי הגבול יישארו בקבוצה שסבבה את שני תאים קוטביים שאינו ניע, מה שהופך את זה סוג של נדידת תאים קולקטיבית. הגירה מוצלחת של אשכול תא הגבול מבטיחה התפתחות תקינה של micropyle של קליפת הביצה, אשר הכרחית להפריה. תאי הקוטב הקדמי להורות גורל תא גבול על ידי הפעלת מפל הולך אותות. תאים קוטביים להפריש ציטוקינים, מזווג (UPD), אשר נקשר לקולטן הטרנסממברני, Domeless (DOME), על תאי שכני זקיק בשלב 8 של פיתוח ביצית 8,9. הכריכה של UPD גורם טירוזין קינאז יאנוס (JAK) לphosphorylate מתמר האותות וActivator של תמלול (STAT) 8,10,11. STAT לאחר מכן עובר לגרעין כדי להפעיל שעתוק. תאים איטיים גבול (SLBO) הוא גורם שעתוק שהוא יעד תעתיק ישיר של STAT וגם נדרש לתא גבול הגירה 12. צפיות ברוחב של תאי ביצה מצביעות tפעילות STAT כובע מוסדרת בשיפוע פני האפיתל הקדמי 8,11,13. יש תאי זקיק הקרובים ביותר לתאים הקוטביים הרמות הגבוהות ביותר של STAT הופעל, כך הם הופכים לתאי גבול ולפלוש לרקמות נבט-הקו הסמוכים. כדי להבין כיצד תאי הגבול מפורטים ובלהתנתק מהאפיתל, אנחנו צריכים לבחון כיצד הרקמה מאורגנת. אם אנו רואים את תאי ביצה מנקודת מבט קדמי-על, שהיינו מצפה סימטריה הרדיאלית של פעילות STAT בתאי הזקיק המקיפים את התאים הקוטביים. קצה בתצוגה גם באופן מדויק יותר להראות הבדלים של חלבונים בממברנה וממשקי תאי תאים לפני ובמהלך הניתוק מהשוואת תאים במטוסי מוקד שונים. בגלל תאי ביצה מוארכים ומחובר זה לזה על ידי תאי גבעול, הם להתיישב על גבי שקופיות רוחבית, ולכן קשה לבחון את הארכיטקטורה הקדמית. לפיכך, מידע רב על התאים בקטבים של תא הביצה ישכבר משתמע מנופים לרוחב. למרות שניתן להשיג קצת מידע דרך שחזורים אלגוריתמיים 3-D של חלקים אופטיים, פיזור אור, photobleaching, וגבולות עניים יותר של רזולוציה בציר Z-להפוך את המידע הזה פחות מפורט ואמין, בהעדר טכניקות יקרות כמו מיקרוסקופ ברזולוציה סופר 14 . סוגים אחרים של הדמיה מבוססת סעיף (למשל, במיקרוסקופ אלקטרונים או חתך microtome) דורשים מניפולציה נרחבת של רקמות, כולל התייבשות, ויגדיל את הסבירות לחפצים. לפיכך, פיתחנו שיטה חדשה לתמונת ד תאי ביצת melanogaster תוך זקוף. שיטה זו כבר הוכיחה שימושית בהבהרה כיצד תאי ניעתי נגזרו (ראה תוצאות נציג ומאנינג et al, הנסקר), והוא צפוי להיות באופן רחב יותר יקר במחקרים של היבטים אחרים של אאוגנזה.

<table><tbody><tr><td>0.1 M מאגר אשלגן פוספט (KPO4 Buffer)</td><td></td><td></td><td>הוסף 3.1 גרם NaH2PO4&bull; H2O ו-10.9 גרם של Na2HPO4 (נטול מים) ל-H2O מזוקק ליצירת נפח של 1 ליטר. ה- pH של התמיסה הסופית יהיה 7.4. ניתן לאחסן את המאגר הזה עד חודש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>תמיסה מימית של 16% פרפורמלדהיד,</td><td>מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים</td> בדרגת EM <td>15710</td><td>ללא מתנול לשימור מחט פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>GFP 30G x 1/2 אינץ'&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>שיפוע</td></tr><tr><td>רגיל פעיל שמרים יבשים</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>לפיטום זבובים נקבות</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>חברת תרבית תאי PAA</td><td>A15-701</td><td>בשימוש במאגר כביסה NP40</td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td>סגסוגת Dumostar, קצה ביולוגי; טיפים חדים חיוניים לדיסקציה</td></tr> <tr><td>של השחלותDAPI (4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>5 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td>נוסף לתוסף מדיום דיסקציה (10%)&nbsp;</td></tr><tr><td>צינור תרבית זכוכית</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td>14 מ"ל</td></tr><tr><td>שקופיות שקע זכוכית</td><td>VWR</td><td>470019-020</td><td>1.2 מ"מ עבה, חלל כפול</td></tr><tr><td>גליצרין ג'לי&nbsp;</td><td>Electron Microsocpy Sciences</td><td>17998-10</td><td>אמצעי הרכבה</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15760</td><td>70% ב-PBS</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-500ML</td> <td>(ניתן להחלפה עבור Nonidet P-40)&nbsp; משמש במאגר כביסה NP40&nbsp;</td></tr><tr><td>סטריאוסקופ פלואורסצנטי של Leica&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP5 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>40x/0.55NA מטרה יבשה&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרו מרית&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ</td> נירוסטה <td>VWR</td><td>16004-368</td><td>75x25x1 מ"מ</td></tr><tr><td>NP40 מאגר</td><td></td><td></td> כביסה <td>50 מ"מ TRIS-HCl, 150 מ"מ NaCl, 0.5% איפגל, 1 מ"ג/מ"ל BSA ו-0.02% נתרן אזיד</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>10378-016</td><td>נוסף למדיום חיתוך תוסף (0.6X)</td></tr> <tr><td>פטרידיש-פוליסטרין, סטרילי</td><td>VWR</td><td>82050-548</td><td>60 W x 15 H מ"מ</td></tr><tr><td>מאגר פוספט מלח</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td>10 חבילות של אבקת</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>בשימוש ב-0.1 מ' KPO4 Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P9791-500G</td><td>משמש ב-0.1 מ 'KPO4 Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Schneider' s Insect Medium</td><td>Life Technologies</td><td> 11720018</td><td>עם L-גלוטמין ונתרן ביקרבונט</td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S2002-25G</td><td>משמש בצביעת נוגדנים פלואורסצנטיים</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S3014-500G</td><td>בשימוש במאגר כביסה NP40</td></tr><tr><td>TRIS-HCl</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70144</td><td>1 M TRIS-HCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Volocity תמונה תלת מימדית תוכנת ניתוח</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>לעיבוד ערימות Z קונפוקליות</td></tr></tbody></table>

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis מספקת הקשר אידיאלי לחקר תהליכי התפתחות מגוונים מכיוון שהשחלה פשוטה יחסית בארכיטקטורה, מאופיינת היטב וניתנת לניתוח גנטי. כל תא ביצה מורכב מתאי קו נבט המוקפים בשכבת אפיתל אחת של תאי זקיק סומטיים. תת-קבוצות של תאי זקיק עוברות התמיינות בשלבים ספציפיים כדי להפוך למספר סוגי תאים שונים. טכניקות סטנדרטיות מאפשרות בעיקר מבט רוחבי על תאי הביציות, ולכן תצוגה מוגבלת של ארגון וזהות תאי הזקיק. פרוטוקול ההדמיה הזקופה מתאר טכניקת הרכבה המאפשרת תצוגה אנכית חדשה של תאי ביצים עם מיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי. הדגימות מותקנות תחילה בין שתי שכבות של ג'לי גליצרין במצב רוחבי (אופקי) על שקופית מיקרוסקופ זכוכית. לאחר מכן חותכים את הג'לי עם תאי הביצים העטופים לבלוקים, מועברים לכיסוי והופכים כדי למקם את תאי הביצים זקופים. ניתן לצלם תאי ביצים רכובים במיקרוסקופ קונפוקלי זקוף או הפוך. טכניקה זו מאפשרת לחקור את מפרט תאי הזקיק, ארגון, סמנים מולקולריים והתפתחות ביציות עם פירוט חדש ומנקודת מבט חדשה.

שיטת ההדמיה הזקופה אפשרה לנו לראות באופן ישיר את הארגון של תאים באפיתל הזקיקים הקדמי בשלב 8. סמן כללי לגורל תא זקיק, העיניים נעדרות (EYA) חלבון, כמו גם את סמן DNA הגרעיני DAPI, הראה גם ביטוי על פני תחום זה של תאים, והוכיח כי כל התאים ניתן היו לראות עם עוצמות צביעה דומות (איור 2 &quot;). חלבונים מווסתים בתגובה לUPD ציטוקינים, לעומת זאת, הראו דפוסים משתנים ורמות ביטוי. תאים קוטביים לשחרר UPD apically לפני שלב זה של התפתחות ביצת 16,17, ולכן אנחנו צפויים ST...

שיטת ההדמיה הזקופה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת הדמיה מפורטת של הקטבים של ביצית דרוזופילה מלנוגסטר מתפתחת. מבט מקצה לקצה זה מספק פרספקטיבה חדשה על הסידורים והמורפולוגיה של סוגי תאים מרובים באפיתל הזקיקים.

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לאפשר דימות ברזולוציה גבוהה של קטבי תאי ביצית של drosohpila. מטרה זו מושגת תחילה על ידי דיסקציה של השחלה וצביעתן בנוגדנים פלואורסצנטיים. השלב השני הוא זיהוי והפרדה של תאי ביצית הנבחרים.בשלב הבא, הדגימות שנבחרו מכוונות ומיושרות, ולאחר מכן מוטמעות בבלוקים של ג'לי גליצרין. השלב הסופי הוא חיתוך וסיבוב של הבלוקים להרכבת תאי הביצה כך שהציר הארוך יהיה אנכי. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לחשוף את הארגון התאי והסוב-תאי בקטבים של תא הביצה.אפיתל, כגון סידורי תאי גבול. שיטות קיימות לצפייה בדגימות בניצב למישור הדמיון באמצעות חיתוך אופטי ושחזור תלת-ממדי אלגוריתמי עלולות לגרום לפוטו-בליץ' (photobleaching) לפיזור אור ולרזולוציה נמוכה יותר, מה שמוביל לתמונות פחות מדויקות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו להרכיב דגימות בזווית חדשה ולצפות בהן באופן ישיר. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לדמות את הקטבים של תאי ביצה בשלבי התפתחות, דבר שסיפק תובנה לגבי הארגון של תאי הזקיק.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי ההכנה והקיבוע קשים ללמידה מכיוון שהם דורשים מניפולציה מיקרוסקופית של דגימות הצביעה ושינוי אוריינטציה של הדגימות מזוויות הראייה המקובלות. את הפרוצדורה תדגים Lathea manning, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי. כדי להתחיל בניסוי, השגו תzכיבית זכוכית

upright-imaging-of-drosophila-egg-chambers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Mesoscopic הקרינה טומוגרפיה פועלת מעבר לגבולות חדירה של מיקרוסקופיה רקמות חתך פלואורסצנטי. הטכניקה מבוססת על תאורה השלכה רב ותיאור תחבורה פוטון. אנו להדגים ב-vivo כל הגוף 3D להדמיה של המורפוגנזה ה-GFP-לבטא דיסקים דמותי האגף...

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

כאן אנו מציגים פרוטוקול הרכבה...

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ&#39;יימברס הדמיה חיים

צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

מוצג פרוטוקול של צביעה חיסונית שלמה על עוברי כנימות, בו מטופלים תנאים קריטיים להפחתת צביעת רקע והגברת חדירות הרקמות. תנאים אלה פותחו במיוחד לזיהוי יעיל של ביטוי חלבונים ברקמות העובריות של כנימות.

זיהוי של תנאים קריטיים לImmunostaining באפונה בכנימות עוברים: הגדלת רקמות חדירות והפחתת מכתים רקע

מאמר זה מתאר פרוטוקול לשעבר vivo להתאמה המאפשר הדמיה Ca 2+ במהלך ההפעלה ביצה תסיסנית.

סידן הדמיה ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; ב ביצת הפעלה

פרוטוקול זה מיועד הדמיה וניתוח של הדינמיקה של כיוון התאים ואת צמיחת רקמות בתוך הבטן הדרוזולה epithelia כמו זבוב הפרי עובר מטמורפוזה. המתודולוגיה המתוארת כאן ניתנת להחלה על חקר שלבים, רקמות ומבנים תת-סלולאריים שונים בדרוזופילה או באורגניזמים אחרים במודל.

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

למד שיטת הדמיה זקופה לחקר שכבות ביצה של Drosophila melanogaster באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל. הטכניקה מאפשרת תצפית ישירה בסידור תאי האפיתל הפוליקולרי בקטבים.

הדמיה זקופה של

גלה סרטונים נוספים