שיטה פשוטה וזולה לקביעה קרה רגישות והסתגלות בעכברים

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד את התגובה לקור של עכברים. הדבר משיג תחילה על ידי קירור או חימום של הזכוכית לטמפרטורה הרצויה. השלב השני הוא התאמת העכברים עד שהם במצב של מנוחה.

השלב השלישי הוא דחיסת אבקת קרח יבש לכדור בתוך מזרק. השלב הסופי הוא בדיקת העכברים באמצעות כדור קרח היבש וסטופר למדידת זמן השהייה עד לנסיגה. בסופו של דבר, מבחן המשטח הקר משמש למדידת תגובה לקור והסתגלות בעכברים הפועלים באופן חופשי.

היתרון המרכזי של הבדיקה שלנו על פני בדיקות קיימות כיום, כגון בדיקת האצטון ובדיקת הפלטה הקרה, הוא היכולת לבחון הן רגישות-יתר והן אלגזיה בבסיס (baseline) תחת מגוון נסיבות סביבתיות. אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התגובה לקור של העכברים, ניתן להשתמש בה גם במערכות אחרות כגון קופים, חולדות ובני אדם. את הפרוצדורה יעגים דניאל ברנר, סטודנט לתואר שני במעבדה שלי.

לאחר ניקוי משטח הזכוכית, הצמדו את חיישן הטרמוקפל מסוג T למרכז לוח הזכוכית באמצעות סרט הדבקה למעבדה. הניחו את תאי הגידול של בעלי החיים על לוח הזכוכית בשורה אחת במרכזו. לאחר מכן, השחילו את חיישן הטרמוקפל דרך תא הגידול המרכזי וחברו אותו לנתב הנתונים (data logger).

הפעל את רשם הנתונים ובטל את תכונת הכיבוי האוטומטי. חבר את רשם הנתונים למחשב באמצעות הכבל המצורף. הפרד בין תאי בעלי החיים באמצעות תוספים שחורים כדי למנוע אינטראקציות חזותיות בין העכברים, ומקם מראות מתחת לזכוכית כדי לאפשר צפייה בחלק התחתון של התאים.

כדי להתחיל בבדיקה, הניחו קופסאות אלומיניום על לוח הזכוכית משני צדי בעל החיים, כאשר המארבים נמצאים במרחק קבוע. אם הבדיקה מתבצעת בטמפרטורה של 30 °C, חברו סירקולטורים של מים מחוממים לקופסאות האלומיניום שהוצבו במרחק של 0.25 inches ממארב בעל החיים. מלאו את הקופסאות במים עד למחציתם כאשר חורי הניקוז סתומים.

מקמו את המסובבים כך שהמים החמים מהקופסאות מאלומיניום ינוזלו ישירות חזרה למאגר של המסובב בכל צד. יהיה עליכם להוסיף מים לכל מסובב. לאחר מילוי קופסאות המתכת, כוון את המסובבים ל-45 עד 60 degrees Celsius ומלאו את קופסאות האלומיניום בזרם קבוע של מים חמים.

כאשר הזכוכיתים מגיעים לטווח הטמפרטורה הרצוי, הניחו את העכברים במארזים שעל הפלטה. אפשרו לעכברים להסתגל למכשיר ולטמפרטורה. עכברים אלו יסתגלו למשך 2.5 שעות.

לקראת סיום תקופת ההסתגלות, מלאו דלי קרח עד למחציתו בקרח יבש והשתמשו בפטיש כדי לרסק את הקרח היבש לאבקה. בצעו זאת מחוץ לחדר ההתנהגות כדי למנוע הפרעה לעכברים. לאחר מכן, השתמשו בלהב תער או במספריים כדי לחתוך את החלק העליון של מזרק בנפח 3 mL.

לאחר מכן, השתמש במחט בכילון (gauge) 21 כדי ליצור שתי סדרות של שלושה חורים בצדדים מנוגדים של המזרק, במטרה להפחית את הלחץ הנוצר כתוצאה מסבלימציה בעת דחיסת הקרח היבש בחזרה בחדר ההתנהגות; מלא את תא המזרק עד למחציתו באבקת קרח יבש. הצמד את הקצה החתוך של המזרק לאובייקט שטוח ודחוס את האבקה בחוזקה באמצעות הבוכנה. דחף את קצה גליל הקרח היבש הדחוס כך שיבלוט מעבר לשפת המזרק.

כעת, בדקו את העכברים שארבע כפות רגליהם נמצאות בתוך הזכוכית והם אינם זזים, אך אינם ישנים לחלוטין. בעזרת המראות למיקוד, לחצו בעדינות אך בנחישות את הפלט плоסית צמוד למשטח הזכוכית מתחת לכף רגל האחורית של העכבר. במקביל, לחצו על כפתור ההפעלה של הטיימר.

כאשר העכבר מתרחק מהזכוכית המקוררת, בין אם בצורה אנכית או אופקית, יש לעצור את הטיימר ולהסיר את כדור הקרח היבש. עם זאת, אם העכבר מזיז את כף הרגל למשך זמן קצר מאוד ואז מחזירה אותה למשטח הקירור, יש להמשיך בתזמון ובגירוי עד שהעכבר יבצע תנועה קבועה הרחק מהמשטח. אם העכבר אינו מתרחק מהזכוכית המקוררת, יש להפסיק את הגירוי לאחר 20 שניות.

חזור על הליך בדיקה זה עד שייאספו לפחות שלושה ערכים מכל כף רגל של בעל החיים לבדיקת עכברים בטמפרטורה של 17 degrees Celsius. חזור על הניסוי כפי שהודגם, אך במקום למלא את קופסאות האלומיניום במים חמים, השתמש בקרח רטוב והצב את הקופסאות במרחק של כ-0.25 inches מהכלובים לצורך בדיקת העכברים. בטמפרטורה של 12 degrees Celsius, נעשה שימוש בקרח יבש, אך הקופסאות ממוקמות במרחק של 1.25 inches מהכלובים.

פרוטוקול חלופי זה בוחן את העכברים בעוד טמפרטורת הפלטה יורדת, במקום לאחר שהיא התייצבה. דבר זה מאפשר לנו לבחון את הסתגלות העכברים בזמן שהיא מתרחשת לאחר הגדרת המערך הניסיוני. כפי שנעשה בעבר, בצעו את הניסוי כפי שפורט קודם לכן כדי לקחת מדידות בטמפרטורת החדר.

לאחר שמדדו את זמני השיהוי (latencies) הבסיסיים בטמפרטורת החדר, מלאו את קופסאות האלומיניום הריקות בקרח יבש, בהתאם לנהלים שהודגמו קודם לכן, והניחו אותן במרחק של 1.25 inches מהמארזים משני הצדדים. לבסוף, חזרו על הניסוי כדי למדוד את זמני השיהוי בזמן שהלוח הזכוכית מתקרר.

ביצוע מדידות בתדירות הגבוהה ככל האפשר. גרף זה מציג את ממוצע זמן ההשהיה עד לנסיגה (withdrawal latency) עבור עכברים שהחלו ב-12 °C, 17 °C, 23 °C או 30 °C. זמני ההשהיה עד לנסיגה עקביים בכל הטמפרטורות.

ניתן למדוד השפעות משככות כאבים באמצעות מבחן ה-cold planter כפי שמוצג כאן. הזרקה תת-עורית של 1.5 milligrams per kilogram מורפין מעלה את זמן השהיית הנסיגה של עכברים 30 דקות לאחר ההזרקה, כפי שנמדד באמצעות two-way ANOVA עם מבחן post-hoc של Bonferroni כ-60 דקות לאחר ההזרקה. אין הבדל מובהק בין הקבוצה שהוזרקה מורפין לקבוצה שהוזרקה סלין.

ניתן למדוד כאן גם רגישות יתר בעכברים. הזרקה תוך-כפית של 10 µL של fros adjuvant מלא מפחיתה באופן משמעותי את זמן השהיית הנסיגה של העכברים שעתיים ושלוש שעות לאחר ההזרקה, כפי שנמדד באמצעות two-way ANOVA עם מבחן bonferroni post-hoc. לאותם עכברים ניתנו הזרקות תת-עוריות של מורפין לאחר ארבע שעות, וכל זמני השהיית הנסיגה ב-4.5 שעות היו גבוהים באופן משמעותי בהשוואה לשלוש שעות, כפי שנמדד באמצעות one-way ANOVA עם מבחן done it's post hoc.

לאחר שהמורפין עבר מטבוליזם, 5.5 שעות לאחר ההזרקה, לעכברים שהוזרק להם CFA עדיין היו זמני תגובה (withdrawal latencies) קצרים יותר מאשר לעכברים שהוזרק להם סליין, כפי שנמדד באמצעות ANOVA דו-כיווני עם מבחן post-hoc של בונפרוני. ניתן למדוד בזמן אמת את ההסתגלות לשינויים בסביבה מקוררת באמצעות בדיקה זו. לעכברי פרא (Wild type) יש את אותו זמן תגובה בעוד לוחת הזכוכית מתקררת, מה שמרמז שהם מסתגלים לטמפרטורות קרירות מהר יותר מכפי שניתן למדוד באמצעות CPA, שבו לא נמצאו הבדלים מובהקים בין אף אחת מהקבוצות.

עם זאת, כאשר העכברים הוזנקו ב-U 7 3 1 2 2 כדי לחסום את הידרוליזת PIP two, זמן התגובה שלהם קצר יותר ככל שטמפרטורת הפלטה יורדת, מה שמרמז על פגיעה בהסתגלות. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בחמישה שעות, כולל זמן ההסתגלות. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן למדוד תחושת קור והסתגלות בעכברים ערים המתנהגים באופן חופשי. זכרו שעבודה עם קרח יבש עלולה להיות מסוכנת במיוחד, ויש להבטיח אוורור נאות ופינוי אוויר תקין במהלך שיטה זו.