Name: EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: למדו את שיטת EPA 1615 לאיתור enterovirus ו-norovirus במים באמצעות RT-qPCR. השיטה מדגימה שחזור וירוסים של 20%-30% מדגימות מים תת-קרקעיות ומסייעת להערכת סיכונים בתחום המיקרוביולוגיה הסביבתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד"ר אריק רודס על הכנת השיבוטים ששימשו בפיתוח מגיב עקומה סטנדרטית, לבריאן מקמין על הסיוע בעיבוד הדגימות, ללארי ווימר על ניתוח סטטיסטי, לד"ר מארק בורצ'רדט, משרד החקלאות האמריקני, מרשפילד, ויסקונסין, על אספקת סרוטיפ 3 של נגיף הפוליו סבין ששימש במחקר זה ולד"ר ה. ו. וירג'ין, אוניברסיטת וושינגטון, סנט לואיס, מיזורי, עבור נורו-וירוס עכברים. המחברים גם מודים לגרטשן סאליבן על הסיוע בהכנת ריאגנטים למעבדה, לד"ר מוחמד כרים על ריבוי מלאי הנורו-וירוס של עכברים, ולבעלי בארות ושירותים פרטיים מקומיים על שאפשרו לנו לאסוף דגימות מים. למרות שעבודה זו נבדקה על ידי ה-EPA ואושרה לפרסום, ייתכן שהיא לא בהכרח משקפת את המדיניות הרשמית של הסוכנות. אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים אינו מהווה אישור או המלצה לשימוש.

<ol><li>Borchardt, M. A., Spencer, S. K., Kieke, B. A., Lambertini, E., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+in+nondisinfected+drinking+water+from+municipal+wells+and+community+incidence+of+acute+gastrointestinal+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Viruses in nondisinfected drinking water from municipal wells and community incidence of acute gastrointestinal illness.</a> Environ. Health Perspect. 120 (9), 1272-1279 (2012).</li>
<li>Ye, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+detection+of+enteric+viruses+in+source+water+and+treated+drinking+water+in+Wuhan%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR detection of enteric viruses in source water and treated drinking water in Wuhan, China.</a> Curr. Microbiol. 65 (3), 244-253 (2012).</li>
<li>Williamson, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+viruses+in+New+Zealand+drinking-water+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Enteric viruses in New Zealand drinking-water sources.</a> Water Sci. Technol. 63 (8), 1744-1751 (2011).</li>
<li>Lambertini, E., Borchardt, M. A., Kieke, B. A., Spencer, S. K., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+of+viral+acute+gastrointestinal+illness+from+nondisinfected+drinking+water+distribution+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Risk of viral acute gastrointestinal illness from nondisinfected drinking water distribution systems.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (17), 9299-9307 (2012).</li>
<li>Chigor, V. N., Okoh, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+RT-PCR+detection+of+hepatitis+A+virus%2C+rotaviruses+and+enteroviruses+in+the+Buffalo+River+and+source+water+dams+in+the+Eastern+Cape+Province+of+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Environ.+Res.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Quantitative RT-PCR detection of hepatitis A virus, rotaviruses and enteroviruses in the Buffalo River and source water dams in the Eastern Cape Province of South Africa.</a> Int. J. Environ. Res. Public Health. 9 (11), 4017-4032 (2012).</li>
<li>Fout, G. S., Martinson, B. C., Moyer, M. W., Dahling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+reverse+transcription-PCR+method+for+detection+of+human+enteric+viruses+in+groundwater%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A multiplex reverse transcription-PCR method for detection of human enteric viruses in groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (6), 3158-3164 (2003).</li>
<li>Hewitt, J., Bell, D., Simmons, G. C., Rivera-Aban, M., Wolf, S., Greening, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastroenteritis+outbreak+caused+by+waterborne+norovirus+at+a+New+Zealand+ski+resort%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Gastroenteritis outbreak caused by waterborne norovirus at a New Zealand ski resort.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7853-7857 (2007).</li>
<li>Jack, S., Bell, D., Hewitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+contamination+of+a+drinking+water+supply+at+a+hotel+resort%5BTitle%5D)+AND+%22New+Zealand+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Norovirus contamination of a drinking water supply at a hotel resort.</a> New Zealand Med. J. 126 (1387), 98-107 (2013).</li>
<li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming%2C+2001%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li>
<li>Parshionikar, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+outbreak+of+gastroenteritis+associated+with+a+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Waterborne outbreak of gastroenteritis associated with a norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (9), 5263-5268 (2003).</li>
<li>U.S. Environmental Protection Agency Office of Water. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22820-F-12-058%3A+Recreational+Water+Quality+Criteria%22">820-F-12-058: Recreational Water Quality Criteria</a>. , 1-63 (2012).</li>
<li>Wade, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+measured+indicators+of+recreational+water+quality+and+swimming-associated+illness+at+marine+beaches%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health%22%5BJournal%5D)">Rapidly measured indicators of recreational water quality and swimming-associated illness at marine beaches: a prospective cohort study.</a> Environ. Health. 9, 66(2010).</li>
<li>Fout, G. S., et al. Method 1615: Measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and RT-qPCR (EPA/600/R-10/181). , U. S. Environmental Protection Agency. 1-91 (2012).</li>
<li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li>
<li>Gibson, K. E., Schwab, K. J., Spencer, S. K., Borchardt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+mitigating+inhibition+during+quantitative+real+time+PCR+analysis+of+viral+nucleic+acid+extracts+from+large-volume+environmental+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Measuring and mitigating inhibition during quantitative real time PCR analysis of viral nucleic acid extracts from large-volume environmental water samples.</a> Water Res. 46 (13), 4281-4291 (2012).</li>
<li>Fuentes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+multiplex+one-step+qRT-PCR+for+hepatitis+A+virus%2C+norovirus+GI+and+GII+quantification+in+bivalve+mollusks+and+water%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Standardized multiplex one-step qRT-PCR for hepatitis A virus, norovirus GI and GII quantification in bivalve mollusks and water.</a> Food Microbiol. 40, 55-63 (2014).</li>
<li>Coudray, C., Merle, G., Martin-Latil, S., Guillier, L., Perelle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+extraction+methods+for+the+detection+of+hepatitis+A+virus+in+lettuces+using+the+murine+norovirus+as+a+process+control%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of two extraction methods for the detection of hepatitis A virus in lettuces using the murine norovirus as a process control.</a> J. Virol. Methods. 193 (1), 96-102 (2013).</li>
<li>Sen, K., et al. EPA 815-B-04-001: Quality assurance/quality control guidance for laboratories performing PCR analyses on environmental samples. , U.S. Environmental Protection Agency. 1-56 (2004).</li>
<li>Schlueter, V., Schmolke, S., Stark, K., Hess, G., Ofenloch-Haehnle, B., Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcription-PCR+detection+of+hepatitis+G+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reverse transcription-PCR detection of hepatitis G virus.</a> J. Clin. Microbiol. 34 (11), 2660-2664 (1996).</li>
<li>De Leon, R., Shieh, C., Baric, R. S., Sobsey, M. D. Detection of enteroviruses and hepatitis A virus in environmental samples by gene probes and polymerase chain reaction. Proc. Water Qual. Technol. Conf. 1990 Nov 11-15, , 833-853 (1990).</li>
<li>Monpoeho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+enterovirus+RNA+in+sludge+samples+using+single+tube+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Quantification of enterovirus RNA in sludge samples using single tube real-time RT-PCR.</a> BioTechniques. 29 (1), 88-93 (2000).</li>
<li>Jothikumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+noroviruses+by+using+TaqMan-based+one-step+reverse+transcription-PCR+assays+and+application+to+naturally+contaminated+shellfish+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of noroviruses by using TaqMan-based one-step reverse transcription-PCR assays and application to naturally contaminated shellfish samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (4), 1870-1875 (2005).</li>
<li>da Silva, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+removal+of+noroviruses+during+wastewater+treatment%2C+using+real-time+reverse+transcription-PCR%3A+different+behaviors+of+genogroups+I+and+II%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using real-time reverse transcription-PCR: different behaviors of genogroups I and II.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7891-7897 (2007).</li>
<li>Butot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+various+real-time+RT-PCR+assays+for+the+detection+and+quantitation+of+human+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of various real-time RT-PCR assays for the detection and quantitation of human norovirus.</a> J. Virol. Methods. 167 (1), 90-94 (2010).</li>
<li>Loisy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+RT-PCR+for+norovirus+screening+in+shellfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish.</a> J. Virol. Methods. 123 (1), 1-7 (2005).</li>
<li>Reynolds, K. A., Gerba, C. P., Pepper, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+infectious+enteroviruses+by+an+integrated+cell+culture-PCR+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of infectious enteroviruses by an integrated cell culture-PCR procedure.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1424-1427 (1996).</li>
<li>Ming, H. X., Zhu, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+infectious+enterovirus+from+surface+water+in+Bohai+Bay%2C+China+using+an+integrated+cell+culture-qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Pollut.+Bull%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of infectious enterovirus from surface water in Bohai Bay, China using an integrated cell culture-qPCR.</a> Mar. Pollut. Bull. 62 (10), 2047-2054 (2011).</li>
<li>Parshionikar, S., Laseke, I., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+propidium+monoazide+in+reverse+transcriptase+PCR+to+distinguish+between+infectious+and+noninfectious+enteric+viruses+in+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of propidium monoazide in reverse transcriptase PCR to distinguish between infectious and noninfectious enteric viruses in water samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (13), 4318-4326 (2010).</li>
<li>Sanchez, G., Elizaquivel, P., Aznar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+infectious+hepatitis+A+viruses+by+propidium+monoazide+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Environ.+Virol%22%5BJournal%5D)">Discrimination of infectious hepatitis A viruses by propidium monoazide real-time RT-PCR.</a> Food Environ. Virol. 4 (1), 21-25 (2012).</li>
<li>Kim, S. Y., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+propidium+monoazide+to+distinguish+between+viable+and+nonviable+bacteria%2C+MS2+and+murine+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Lett.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Using propidium monoazide to distinguish between viable and nonviable bacteria, MS2 and murine norovirus.</a> Lett. Appl. Microbiol. 55 (3), 182-188 (2012).</li>
<li>Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178: ICR Microbial Laboratory Manual, I.1-ApD-23. , U.S. Environmental Protection Agency. (1996).</li>
<li>Abbaszadegan, M., Stewart, P., LeChevallier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+detection+of+viruses+in+groundwater+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A strategy for detection of viruses in groundwater by PCR.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 444-449 (1999).</li>
<li>Lambertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+of+enteroviruses%2C+adenoviruses%2C+and+noroviruses+from+drinking+water+by+use+of+glass+wool+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (10), 2990-2996 (2008).</li>
<li>Rodriguez, R. A., Thie, L., Gibbons, C. D., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+effects+of+environmental+inhibition+in+quantitative+real-time+PCR+detection+of+adenovirus+and+norovirus+in+recreational+seawaters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing the effects of environmental inhibition in quantitative real-time PCR detection of adenovirus and norovirus in recreational seawaters.</a> J. Virol. Methods. 181 (1), 43-50 (2012).</li>
<li>Iker, B. C., Bright, K. R., Pepper, I. L., Gerba, C. P., Kitajima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+commercial+kits+for+the+extraction+and+purification+of+viral+nucleic+acids+from+environmental+and+fecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of commercial kits for the extraction and purification of viral nucleic acids from environmental and fecal samples.</a> J. Virol. Methods. 191 (1), 24-30 (2013).</li>
<li>Fey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+real-time+PCR-based+approach+for+accurate+quantification+of+bacterial+RNA+targets+in+water%2C+using+Salmonella+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantification of bacterial RNA targets in water, using Salmonella as a model organism.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3618-3623 (2004).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> J. Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).</li>
<li>Kim, M., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+the+inhibitory+effects+of+salt%2C+humic+acid%2C+and+heavy+metals+on+the+recovery+of+waterborne+norovirus+by+electropositive+filters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of the inhibitory effects of salt, humic acid, and heavy metals on the recovery of waterborne norovirus by electropositive filters.</a> J. Water Health. 11 (4), 613-622 (2013).</li>
<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li>
<li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses%2C+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> J. Appl. Microbiol. 109 (2), 635-641 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מחקרים לאומיים בקנה מידה גדולה של זיהום הנגיפי של מים מקור ושתייה דורשים השימוש במעבדות אנליטיות מרובות. בתנאים אלה יש צורך בשיטה סטנדרטית כדי להבטיח כי הנתונים שנוצרו על ידי מעבדות הרבות הוא דומים. ישנן שיטות רבות שפורסמו מולקולריות לאיתור וירוסים, אבל מעט מאוד שיטות מולקולריות אחידות. EPA שיטה 1,615 היא שיטה סטנדרטית שתוכננה במיוחד עבור זיהוי של enterovirus וnorovirus במטריצות מים על ידי RT-qPCR. שיטות מולקולריות סטנדרטיות זמינות לאיתור וירוסים במזונות (CEN / ISO TS 15,216-1 וCEN / ISO TS 15,216-2; 7 אפריל 2013) 16,17 ויושמו לזיהוי של צהבת וירוס וnorovirus באביב מים 16. כל השיטות סטנדרטי חייבת לכלול בקרת ביצועי איכות וקריטריונים כדי למזער בינלאומי ופנים-וריאציה מעבדה והנתונים חיוביים כוזבים עקב זיהום במעבדה. כדי לצמצם עוד יותר נתונים כוזבים, Eרשות שיטה 1,615 כדלקמן ההדרכה של המשרד לאיכות הסביבה על שיטות מולקולריות, 18 הקובע הפרדת העבודה במהלך עיבוד ודרך אחת זרימת עבודה. הוא כולל G צהבת 1,19 שליטה ונהלים כדי למזער תוצאות שליליות שגויות בשל מעכבים של 15 RT-qPCR פנימיים. היא משתמשת במבחנים כמותיים יחד עם כמויות סטנדרטיות של שני המים שנדגמו והמים ניתחו כך שכל נתוני השדה מתבטאים בעותקים הגנומי לליטר של השדה או שתיית נדגמו מים. למרות שצינור יעיל יחיד (צעד אחד) מבחני RT-PCR זמין מסחרי, בשיטה במכוון משתמשת מבחני נפרדים. זה יש את החסרון של צמצום כמות המדגם שניתן assayed בכל תגובה, אבל נותן גמישות רבה יותר בשימוש בערכות פריימר מרובים. מבחני RT-qPCR מוגבלים על ידי ורק טוב כמו פריימרים ובדיקות בשימוש וסביר לא קבוצת פריימר תהיה לזהות את כל גרסאות הווירוס בתוך קבוצה. סט פריימר enterovirus נבחר בגללהיא פוגעת באזור 5&#39;-שאינו נשמרים קידוד, 20,21 מזהה מגוון רחב של זנים אל enterovirus, ווירוסים שאותרו על ידי זה קשורים להשפעות בריאותיות מצריכה של groundwaters מטופל 1. שתי קבוצות פריימר משמשות לזיהוי של genogroup אני noroviruses 22,23. הראשון נבחר בשל המתאם החזק בין השפעות הבריאותיות בילדים צעירים וזוהה וירוס 1. Genogroup השני אני פריימר להגדיר ולהגדיר פריימר משמש לgenogroup השני noroviruses נבחרו משום שהם מזהים את המגוון הרחב ביותר של זני 24,25. למרות היתרונות הגדולים של נהלי qPCR וRT-qPCR לאיתור רנ&quot;א הנגיפי במים, יש כמה מגבלות. ראשית, שני חלקיקי הווירוס מדבקים ומידבקים, כוללים אלה מומתים על ידי חומרי חיטוי, יכולים להיות מוגברים על ידי נהלים אלה. התוצאות מצביעות על כך שBorchardt זה פחות בעיה לF groundwaters שלא טופלהאקוויפרים ROM דומים לאלה שביישובים שנבדקו בהשוואה למים עיליים חיטוי 1. לוירוסים culturable בעיה זו ניתן להתגבר באמצעות PCR בשילוב עם תרבות 26,27. הבעיה גם טופלה במשך כמה וירוסים באמצעות שימוש בסוכני cross-linking חומצות גרעין 28-30. גישה זו אחרונה היא יעילה יותר לוירוסים מומת על ידי היפוכלוריט ולא יעיל למי מומת על ידי UV. מגבלה שנייה של נהלים המולקולריים אלה היא כי היקף המדגם מרוכז שניתן assayed בדרך כלל הוא הרבה יותר קטן מזה המשמש לנוהלי תרבות 6,31. בעיה זו מטופלת לעתים קרובות על ידי שתי החלפת הליך המבוסס על פוליאתילן גליקול לריכוז הסטנדרטי המשני על ידי הפתתה אורגנית, המאפשר את המדגם כדי להיות resuspended בנפח קטן יותר, או על ידי התוספת של מדגם שיישוני צעד ריכוז 6,32,33 . שיטה 1,615 משתמשת centrifאולטרה ugal לספק ריכוז שלישוני. אולטרה סינון צנטריפוגלי מסיר מים ורכיבים פחות מ -30,000 Daltons וכתוצאה מכך גם הריכוז של כל וירוס בדגימות בדיקה וירידה במשקל מולקולרי קטנים מעכבים של מבחני מולקולריים. תוצאות זה שיישוני צעד ריכוז בגורם ריכוז כולל של&gt; 10 5 לכל וירוס שהיה נוכח במים נבדקות. מגבלה שלישית היא נוכחותם של מעכבי הליכים מולקולריים בדגימות סביבתיות. למרות מספר רב של גישות להסרת מעכבים פותחו, אין גישה יעילה לכל מטריצות המים וסוגי וירוס 6,34,35, מה שהופך את השימוש בבקרות פנימיות שנועדו להעריך את הרמה של עיכוב חיוני. מגיב G הצהבת בשימוש בשיטה זו עונה על דרישה זו על ידי מתן על רמה קבועה של רנ&quot;א הנגיפי בכל התגובות וassay RT-qPCR להערכת עיכוב. כאשר הטוב ביותר של tהוא מעכב גישות ההסרה להיכשל כדי להסיר עיכוב, יכולים להיות מדוללים תרכיזי מדגם עוד ריכוזי וירוס הם גבוהים מריכוזי מעכב 14,15. יש ההליך העקום הסטנדרטי המתואר במסמך זה גם יתרונות ומגבלה עיקרית. יתרון הוא שמגיב משמש אספקה ​​כל המרכיבים הדרושים במגיב אחד, המאפשר שליטה יחידה שתשמש לכל מבחני. מגיב הדבר נכון במיוחד יתרון עבור מבחני norovirus. ניתן להשיג חלקיקי norovirus רק מאנשים נגועים ולכן קשה מאוד להשיג חלקיקים נגיפיים לשימוש כסטנדרטים. יתרון חשוב נוסף הוא שהיא מספקת סטנדרטית RNA לכל וירוסי RNA הממוקדים במגיבה אחד, כבעל סטנדרטי RNA הוא חיוני לכימות מדויק של RNA 36. עם זאת, יכולתו לכמת במדויק וירוס היא מוגבלת על ידי העובדה שהשפעות המטריצה ​​אינן נלקחות בחשבון. משמעות הדבר היא כי עותק הגנומיערכי מספר אינו יכולים להיחשב מוחלטים וצריכים להיחשב רק במונחים יחסי. מומלץ מספר מספיק של מניות aliquots עובדות עקומה סטנדרטית (שלב 1.2) להיות מוכן לכיסוי לימודים מלאים. לדוגמא, כל aliquot μl 250 מספק מגיב מספיק ל6 צלחות RT. אם ידוע שמחקר דורש ניתוח של 500 דגימות, מינימום של 12 aliquots יהיה צורך (500 דגימות / 7 דגימות לכל צלחת RT / 6 צלחות RT לaliquot). EPA שיטה 1,615 היא שיטה מבוססת ביצועים. יצרנים רבים להפוך ריאגנטים שווי ערך לאלה המפורטים ובניתן להחליף ריאגנטים אלה כל עוד קריטריוני ביצועים הם נפגשו. העקומה סטנדרטית, המשמשת גם כביקורת חיובית RT-qPCR, היא בעל ערך בבעיות ביצועים לפתרון בעיות. ביצועים יכולים לרדת עקב הידרדרות של רנ&quot;א, חיי מדף מגיב, כישלון של מקפיאים, כיול מכשיר, וטעות טכנית. בעיות ביצועים צריכים להיות חשודותאד אם עקומות סטנדרטי שונה שממוצגים באיור 4 או אם הם אינם עומדים במפרט ביצועים לעקומות סטנדרטיים. Assay RT-qPCR הוא די חזק; כישלון מוחלט הוא כנראה עקב טיפול לא נכון של RNA או טעות טכנית (למשל, מגיב חסר). בזהירות רבה יש לנקוט בטיפול בדגימות RNA בין החילוץ וצעד RT להפחית השפלה RNA מribonucleases. החלמה מנגיף פוליו המים קרקע וכיתה מגיב והחלמת norovirus עכברית מתהום פגשה EPA שיטת 1,615 קריטריונים לקבלת ביצועים (לוח 11) ודומים לאלה שדווחו על ידי אחרים 33,37,38. ההחלמה norovirus Murine מדגימות LFB היו נמוכה בהרבה מאלו של נגיף הפוליו ולא עמדה בקריטריוני קבלת נגיף הפוליו ספציפי. הסיבות להתאוששות norovirus עכברית נמוכה ממי כיתה מגיב אינן ידועות. collea דומה לתוצאות במסמך זה, כרים וגואז דיווח התאוששות לGI.1 norovirus של 4% ממים ברז 39. לי ואח &#39;. 37 דיווחו החלמה ממוצעת לnorovirus עכברי וGII.4 norovirus האנושי של 18% ו -26% ממים מזוקקים באמצעות מסנני דיסק, בהתאמה. שימוש בתנאים דומים ללי ועמיתים, קים וKo נצפו החלמה של 46% ו -43% לוירוסים אלה, בהתאמה 38. גיבונס et al. 40 הושג סביב התאוששות 100% מGII.4 norovirus האנושי ממי ים, אבל קים וKo 38 מצאו כי התוספת של מלח למים מזוקקים בריכוזים דומים או גבוהים יותר מאשר מי ים באופן משמעותי החלמה מופחתת של הווירוס עכברי והביאה לירידה כפולה בהתאוששות GII.4.

PCR כמותית (QPCR, ראו חומרים נוספים להגדרות של מונחים המשמשים בכתב היד הזה) ולהפוך שעתוק-qPCR (RT-qPCR) הם כלים רבי ערך לאיתור וכימות וירוסי מעיים אנושיים בסביבה ושתיית מים, ובמיוחד לוירוסים רבים שעושים לא לשכפל או לשכפל בצורה גרועה במערכות תרבית תאים. שני הכלים הוכיחו כי סוגים רבים וירוס נמצאים במי שתייה סביבתיים ובעולם 1-6. השימוש בם בשילוב עם רצף של שברים הגנומי מוגברים במהלך חקירות פרוץ מחלה סיפק ראיות להעברת נגיף המועברות במים, כפי שהם הראו כי הנגיף נמצא במי השתייה הוא זהה לסככה שעל ידי חולי פרוץ 7-10. שני qPCR וRT-qPCR הם כלים בריאות ציבור שימושיים. לדוגמא, נתונים ממחקרים שנערכו על ידי הסוכנות להגנת הסביבה בארה&quot;ב (EPA) הראו קשר חזק להיותמדידות מחוון tween ידי qPCR והשפעות בריאותיות במים ופנאי. כתוצאה מכך, קריטריוני איכות מים קלים של EPA הסופיים 2,012 כוללים שיטת qPCR לניטור חופי פנאי 11,12. Borchardt ועמיתים מצאו גם קשר חזק בין קיבה ומעיים חריפים בקהילות באמצעות מי תהום ווירוס שלא טופלה בתהום כפי שנמדדו על ידי RT-qPCR 1. מטרת מאמר זה היא לתאר את רכיב assay המולקולרי של 13,14 EPA השיטה 1,615. assay זה משתמש RT-qPCR לספק הערכה כמותית של enterovirus ועותקי norovirus הגנומי (GC) לליטר המבוסס על הנפח המקורי של מי שתייה או הסביבתי עבר סינון electropositive. סקירה של ההליך המולקולרי מוצגת באיור סעיף 1. פרוטוקול פרטים 1 הנהלים להכנת העקומה סטנדרטית. תקנים אלה הוכנו ממגיבים המכיל RNעותק של רצף המטרה לכל קבוצות פריימר / הבדיקה. סעיף 2 מתאר את הליך ריכוז שלישוני. סעיף 3 נותן את ההליך להפקת RNA מדגימות מים ושליטה מרוכזות. RNA מכל מדגם בדיקה הפוך עיבד באמצעות מבחני בשלושה עותקים ופריימרים אקראיים לראש השעתוק (סעיף 4). CDNA מכל תגובת שעתוק לאחור מחולק לחמישה מבחני נפרדים וירוס ספציפי שמנותחים בשלושה עותקים על ידי qPCR (סעיף 5; איור 2). Assay משתמש פריימרים ובדיקות מהספרות המדעית (טבלת 1) שנועדו לזהות enteroviruses רב וnoroviruses ומגיב מכיל צהבת G RNA לזהות דגימות בדיקה שמעכבות עד 15 RT-qPCR.

<table><tbody><tr><td>תא צינור 1.5 מ"ל</td><td>ביוטק מגוון</td><td>CHAM-3000</td><td></td></tr><tr><td>1 & deg; C לבנים</td><td>מגניבות Diversified Biotech</td><td>BRIK-2501</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR Buffer II ו-25-mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>N8080130-20</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; מקפיא C</td><td>VWR</td><td>97043-346</td><td>חייב להיות מקפיא הפשרה</td></tr> <tr><td>ידני-70 &deg; מקפיא C או קר יותר</td><td>Thermo Scientific</td><td>MBF700LSAO-E</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות תא</td><td>מגוון ביוטק</td><td>CHAM-1000</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>RNA משוריין EPA-1615</td><td>Asuragen</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td><td>משמש לכימות בדיקת RT-qPCR</td></tr><tr><td>נגיף RNA משוריין הפטיטיס G</td><td>Asuragen</td><td>42024</td><td></td></tr><tr><td>אוטוקלאב</td><td>סטריס</td><td>אמסקו סדרת</td><td></td>מעבדה</tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית</td><td>אספקת ציוד מעבדה NuAir</td><td>Labgard 437 ES</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td> <td>Affymetrix</td><td>10856</td><td>דרגה גבישית או טובה יותר</td></tr><tr><td>מאגר AVE</td><td>Qiagen</td><td>1026956</td><td>מאגר דילול RNA נושא מאגר AVL</td></tr><tr><td>Qiagen</td><td>19073</td><td>מיצוי</td><td> מאגר</td></tr><tr><td>מנשא RNA</td><td>Qiagen</td><td>לא ישים</td><td>השתמש ב-RNA מנשא המסופק עם</td></tr><tr><td>בקבוקי צנטריפוגה</td> Buffer AVL <td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-562-23 או 05-562-26</td><td></td></tr><tr><td>רוטורי צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>339080, 336380</td><td></td></tr><tr><td>כספת מגניבה</td><td>Diversified Biotech</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&reg; ערכת מאסטר 480 בדיקות</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-682-550</td><td>השתמש בצינורות נטולי ריבונוקלאז ודאוקסיריבונוקלאז עם מכסי הצמדה</td></tr><tr><td>Microcide III</td><td>פיצג'רלד</td><td>99R-103</td><td></td></tr><tr><td>סרט מיקרוסיל 'A'</td><td>מעבדות Bio-Rad</td><td>HSA5001</td><td>Heat עמיד</td></tr><tr><td>Microseal 'F' סרט</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSA1001</td><td>מקפיא עמיד</td></tr> מיני <tr><td>צלחת ספינר</td><td>Labnet International</td><td>MPS1000</td><td></td></tr><tr><td>רב ערוצי פיפטה</td><td>Rainin</td><td>L8-20</td><td></td></tr><tr><td>תא רב צינורות</td><td>מגוון ביוטק</td><td>CHAM-5000</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תגובה אופטית</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4314320 PCR נוקלאוטידים תערובת Promega</td><td></td><td>U1515</td><td></td></tr><tr><td>PCR צלחת</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSS9601</td><td></td></tr><tr><td>מים בדרגת PCR</td><td>רוש</td><td>3315932001</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td> <td>ארה"ב ביולוגי</td><td>D9820</td><td></td></tr><tr><td>מערבל צלחות</td><td>תעשיות מדעיות</td><td>MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Prionex ג'לטין</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0411</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>כולל מאגרים AW1 (מאגר כביסה ראשון), AW2 (מאגר כביסה שני), AE (מאגר פליטה); יש להוסיף אתנול למאגרים AW1 ו-AW2 לפני השימוש; אין להשתמש ב-Buffer AL המסופק עם הערכה</td></tr><tr><td>Quantitative PCR thermal</td><td>cycler Life Technologies</td><td>4351405</td><td></td></tr><tr><td>פריימר אקראי</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Reservoir</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-381-27E</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת</td><td>Beckman Coulter</td><td>367501</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase</td><td>Promega</td><td>N2515 או N2615</td><td></td></tr><tr><td>צבע ייחוס ROX</td><td>Life Technologies</td><td>12223</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II או III Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies</td><td>18064-022 או 18080044</td><td></td></tr><tr><td>כפפות כירורגיות</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>Thermal</td><td>cycler Life Technologies</td><td>4314879</td><td></td></tr><tr><td>בסיס Trisma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 יחידות ריכוז צנטריפוגליות</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>VS2022</td><td></td></tr></tbody></table>

epa שיטת המדידה של 1615. enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וrt-qpcr. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי rt-qpcr

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

שיטת EPA 1615 מודדת אנטרו-וירוסים ונורו-וירוסים הנמצאים במי הסביבה ובמי השתייה. שיטה זו פותחה במטרה לקבל שיטה סטנדרטית לשימוש במעבדות אנליטיות מרובות במהלך תקופת הניטור 3 של כלל ניטור המזהמים הבלתי מוסדרים. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול למיצוי חומצה ריבונוקלאית נגיפית (RNA) מתרכיזי דגימות מים ולמדידה כמותית של ריכוזי אנטרו-וירוס ונורו-וירוס באמצעות PCR כמותי שעתוק הפוך (RT-qPCR). ריכוזי הנגיף עבור הבדיקה המולקולרית מחושבים במונחים של עותקים גנומיים של RNA ויראלי לליטר על סמך עקומה סטנדרטית. השיטה משתמשת במספר בקרות איכות כדי להגביר את איכות הנתונים ולהפחית את השונות הבין-מעבדתית והתוך-מעבדתית. השיטה הוערכה על ידי בחינת התאוששות הנגיף ממים בדרגת קרקע וריאגנטים שנזרעו עם נגיף פוליו מסוג 3 ונורו-וירוס עכברי כתחליף לנורו-וירוסים אנושיים. ממוצע ההחלמות מנגיף הפוליו היה 20% במי תהום ו-44% במים בדרגת ריאגנט. ממוצע ההתאוששות של נורו-וירוס עכברים עם בדיקת RT-qPCR היה 30% במי תהום ו-4% במים בדרגת ריאגנט.

כאן אנו מציגים הליך לכימות אנטרו-וירוס ונורו-וירוס במי סביבה ושתייה באמצעות PCR כמותי של שעתוק הפוך. התאוששות הנגיף הממוצעת ממי תהום עם הליך סטנדרטי זה משיטת EPA 1615 הייתה 20% עבור נגיף הפוליו ו-30% עבור נורו-וירוס עכברים.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את ריכוז ה-enterovirus וה-norovirus במים, באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית עם שעתוק הפוך (reverse transcription quantitative polymerase chain reaction). הדבר משיג על ידי ריכוז שלישוני של חלקיקי וירוס מדגימות מים מרוכזות באמצעות אולטרה-פילטרציה צנטריפוגלית. לאחר מכן, מכינים ריאגנטים לעקומה סטנדרטית כפי שמתואר בפרוטוקול. לאחר מכן מתבצעת מיצוי של חומצות גרעין מהריכוזים הוויראליים ומהעקומה הסטנדרטית. לאחר מכן, ה-RNA הוויראלי בדילולות של 1:5 ו-1:25 עובר שעתוק הפוך באמצעות פריימרים אקראיים ו-reverse transcriptase. לבסוף, מבוצעת הגברה של ה-cDNA הוויראלי באמצעות פריימרים ופרובים ספציפיים לווירוס במכשיר real-time thermal cycler, ולאחריה חישוב עותקים גנומיים של הדגימה בהתבסס על העקומה הסטנדרטית.היתרון המרכזי של שיטת EPA 1615 על פני שיטות סטנדרטיות אחרות, כגון ISO 15216, הוא שהיא תוכננה במיוחד עבור דגימות מים וכוללת בדיקת enterovirus. שיטה זו יכולה לספק למעריכי סיכונים בתחום המיקרוביולוגיה הסביבתית את המצב הנוכחי של קביעת הסיכון מנגיפים במים לשתייה ובמים לשחייה ופנאי. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו עם הסטנדרטיזציה המובנית בה. השיטה מפורטת מאוד ויש לפעול לפיה באופן מפורש. הדגמה חזותית של השיטה היא קריטית, שכן אפילו שינויים קלים בביצועה עלולים להוביל לתוצאות שליליות. המדגימות של הפרוטוקול היום הן Nichole Brinkman, Jennifer Cashdollar, Shannon Griffin, ואני, Shay Fout. כולנו אנשי צוות מקצועיים במעבדת מחקרי החשיפה הלאומית של ה-EPA בסינסינטי, אוהיו.לאחר הכנת עקומת סטנדרט בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכינו מרכז רכז צנטריפוגלי עבור כל דגימה שנאספה, על ידי הוספת לפחות 10 milliliters של 1X PBS ו-2% BSA לתא הדגימה העליון. לאחר דגירה למשך לילה, שטיפה, והוספת הדגימות כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב, צנטריפוגו כל דגימת בדיקה ברוטור בעל דליים נדנדים (swinging bucket rotor) ב-3000 עד 6000 times g ובטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך עשרים עד שלושים דקות.לאחר שהדגימה רכזו באופן מתאים והועברה לשפופרת מיקרוצנטריפוגה נקייה, יש להוסיף sodium phosphate buffer בריכוז 0.15 molar כדי להתאים את הנפח הסופי ל-400 µL פלוס או מינוס 2 µL. כדי למצות את החומצות הגרעיניות, יש להוסיף 200 µL של תמיסות מיצוי עבור ביקרת מיצוי שלילית, ו-200 µL של התרכיז השלישי עבור כל דגימת בדיקה או דילול של עקומת סטנדרט, לשפופרות מיקרוצנטריפוגה נפרדות, ולמצות את ה-RNA בהתאם לשינויים המפורטים בפרוטוקול הטקסט של הוראות היצרן של ערכת המיצוי. לאחר הכנת הפריימרים והפרובים כפי שמתואר בפרוטוקול, יש להכין את תערובות ה-master mix לשעתוק הפוך אחת ושתיים בחדר נקי, כפי שמוצג כאן.באמצעות פיפט רב-ערוצי, העבירו 16.5 µL של RT master mix one לבארות של כל לוח PCR. לאחר מכן, בעזרת תמיסת האלוציה של ערכת מיצוי החומצות הגרעיניות המכילה 400 units/mL של RNase inhibitor, דללו את מטריצת הדגימות המועשרות מהשטח ומהמעבדה (LSFM samples) שהופשרו ביחסים של 1:5 ו-1:25. העבירו 6.7 µL של החומצות הגרעיניות מכל דגימת בדיקה, ביקורת ועקומת סטנדרט לבארות נפרדות בלוח ה-PCR, תוך שימוש בשלוש בארות (triplicate) עבור דגימות הבדיקה והביקורות, ובשתי בארות (duplicate) עבור עקומות הסטנדרט.הוסיפו 6.7 µL של בופר אלוציה (elution buffer) לבארות של בקרת ללא תבנית (no template control) או NTC. שלבו שתיים עד שמונה NTCs לכל לוח RT, כאשר משתמשים בשתיים עבור הדגימה הראשונה ולאחר מכן בשתיים או יותר עבור כל דגימה רביעית נוספת, תוך פיזור של הבקרות השליליות ברחבי הלוח. השתמשו במדבקת איטום עמידה לחום כדי לאטום את לוח ה-PCR, וודאו שכל בארה אטומה היטב. לאחר מכן, ערבבו את הדגימות למשך חמש עד עשר שניות לפני סבב קצר של צנטריפוגציה במהירות של 500×g או יותר. בטרמוסייקלר (thermocycler), דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 99 °C למשך ארבע דקות. קררו את הפלטה ל-4 °C ולאחר מכן סובבו אותה קצרות פעם שנייה בצנטריפוגה. לאחר מכן, הסירו בזהירות את אטם הפלטה והוסיפו 16.8 µL של RT master mix two לכל באר. לאחר איטום הפלטה, ערבוב קצר וסבוב בצנטריפוגה, הניחו את הפלטה בטרמוסייקלר והריצו ב-25 °C למשך 15 דקות, לאחר מכן ב-42 °C למשך 60 דקות, ב-99 °C למשך חמש דקות, ולבסוף, השאירו בטמפרטורה של 4 °C למשך עד שמונה שעות או אחסנו את הדגימות ב-70 °C- לתקופה ארוכה יותר.בחדר נקי, הכין תערובות מאסטר ל-quantitative PCR בהתאם למדריכים עבור enterovirus, norovirus genogroup one, norovirus genogroup two ו-hepatitis G. ערבב כל תערובת מאסטר וסבב קצר במ centrifuge. לאחר מכן, כפי שמוצג בדוגמה זו, הוסף 14 µL מתערובות המאסטר של ה-PCR לבארים המתאימות בלוח תגובה אופטי מסומן, תוך שימוש בלוחות נפרדים עבור כל בדיקת qPCR. חלק 6 µL של ה-cDNA המתאים לבארים המתאימות. לאחר מכן ערבב את הדגימות וסבב קצר במ centrifuge.הגדירו את תוכנת התרמוסייקלר כפי שמתואר בפרוטוקול והריצו את בדיקת ה-qPCR לדלקת כבד G על מטריצת דגימות מועשרות מהשדה ובמעבדה (LFSM), בדילול ובלא דילול, לפני הרצת כל שאר בדיקות ה-qPCR. השוו את ערך ה-Cq הממוצע של כל דגימה לערך ה-Cq הממוצע של דלקת כבד G שנקבע מראש עבור כל מנה חדשה של ריאגנטים לדלקת כבד G. השתמשו בדילול הנמוך ביותר של דגימה מהשדה או דגימת LDF שערכו נמוך מאשר ערך Cq אחד מעל ערך ה-Cq הממוצע של דלקת כבד G עבור בדיקות ה-qPCR לאנטרווירוס ולנורווירוס.הגדירו את התוכנה של מכשיר ה-thermocycler ל-qPCR בהתאם להוראות היצרן. הגדירו את דגימות עקומת הסטנדרט כסטנדרטים, ועבור כל דילול בעקומת הסטנדרט, הזינו את ערכי העותקים הגנומיים המוצגים כאן. הריצו את הפלטה ב-95 °C למשך עשר דקות, ולאחריהם 45 מחזורים של 90 °C למשך 15 שניות ו-60 °C למשך דקה אחת.קבעו האם כל עקומת סטנדרט עומדת בערכים המקובלים המופיעים בטבלה זו. לאחר חישוב סטיית התקן, השיפוע, ה-R squared ואחוז היעילות בהתאם למשוואות בפרוטוקול הטקסט, רשמו את ערכי העותק הגנומי או ה-GC שחושבו על ידי תוכנת התרמוסייקלר עבור כל דגימות הבדיקה, בהתבסס על עקומות סטנדרט העומדות בקריטריונים המפורטים בטבלה זו, וכן את ערכי ה-GC הממוצעים עבור כל דגימה. קבעו את ה-GC לליטר עבור כל דגימת בדיקה באמצעות המשוואה הבאה, כאשר GC הוא מספר העותקים הגנומיים הממוצע שחושב הרגע.הגורם 199 הוא מקדם הדילול הכולל עבור תגובות הנפח שהתרחשו במהלך ריכוזים שלישוניים. שלבי מיצוי RNA ו-RT-qPCR. DF הוא מקדם הדילול המפצה על עיכוב (inhibition) ו-D הוא נפח דגימת המים המקורית שנבדקה בליטרים.לבסוף, חשבו את ה-GC הכולל של דגימות ה-lab field fortified blank (LFB) ודגימות ה-lab reagent blank (LRB) על ידי הכפלת ערך ה-GC הממוצע שנקבע קודם לכן ב-199 וחלוקה ב-0.3. באופן כללי, התשוש של הנגיף נקבע באמצעות דגימות מי תהום של field LFSM מצמדי של שבע מערכות דגימות שנסמקו משלושה מתקני טיפול ציבוריים ומבאר פרטית. רמות הזריעה עבור דגימות ה-LSFM היו שלושה מיליון MPN של poliovirus type three וחמישה מיליון PFU של murine norovirus.נורו-וירוס עכברי (Murine norovirus) שימש להערכה הראשונית במעבדה אחת של שיטת EPA 1615, מכיוון שהריאגנט לעקומת הסטנדרט לא היה זמין באותה עת. עבור דגימות מי תהום, התשואה הממוצעת של פוליו-וירוס הייתה 20% עם טעות תקן של 2%, בעוד שהתשואה הממוצעת של נורו-וירוס עכברי הייתה 30% עם טעות תקן של 3%. בדגימות מי תהום רגילות מהשטח עבור כל LFSM לא נמצאו אנטרו-וירוס או נורו-וירוס ברמות הניתנות לגילוי. דגימות בלאנק מועשר במעבדה (LFB) ובלאנק ריאגנטים של המעבדה (LRB) נמדדו באמצעות מים בדרגת ריאגנט עם ובלי זריעה.ההשבה של Poliovirus עמדה על ממוצע של 44% עם טעות תקן של 1%, בעוד שההשבה של norovirus עכברי עמדה על ממוצע של 4% עם טעות תקן של 0.5%. איור זה מציג עקומות סטנדרט טיפוסיות עבור enterovirus ו-norovirus genogroup two. עקומת ה-norovirus genogroup two עומדת בקריטריונים של עקומה סטנדרטית עם ערך R squared של 0.9987, סטיית תקן כוללת של 0.14 ויעילות של 101%. עקומת ה-enterovirus עומדת בקריטריוני הביצועים של עקומה סטנדרטית עם ערך R squared של 0.9874, סטיית תקן כוללת של 0.58 ויעילות של 103%, אך היא בעלת רגישות נמוכה פי 100 בקירוב ולפיכך בעלת סף גילוי גבוה יותר מאשר עקומות ה-norovirus.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיירו הבנה טובה של אופן הריכוז והזיהוי של enterovirus ו-norovirus מהמים באמצעות RT-qPCR. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בכשמונה שעות עבור דגימות בעלות עכירות נמוכה. דגימות עם עכירות גבוהה יותר עשויות לדרוש זמן נוסף, במיוחד בשלב הריכוז השלישוני.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להגן על הדגימות מפני זיהום ב-RNase לפני התעתוק ההפוך. זכרו כי PCR היא טכניקה עוצמתית ומועילה מאוד. נקיטת אמצעי זהירות, כגון הפרדה של תחנות העבודה ושימוש בביקורות מתאימות, הכרחית כדי למזער תוצאות חיוביות ושליליות שגויות.

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

צעד אחד RT-PCR assay לגילוי וזיהוי genogroup של מבודד norovirus מ כיסאות ילדים, אשר מנצל primers ו בדיקות TaqMan ספציפיים מסגרת קריאה פתוחה 1 (ORF1)-ORF2 באזור צומת, האזור משומר רוב הגנום norovirus הוא תיאר. לא מסחרי, חסכונית שיטת מיצוי RNA הוא מפורט.

איתור Genogrouping של Noroviruses מ שרפרפים לילדים עד Taqman צעד אחד RT-PCR

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

שיטת EPA 1615 משתמשת במסנן אלקטרו-פוזיטיבי כדי לרכז אנטרו-וירוסים ונורו-וירוסים במי הסביבה ובמי השתייה. כתב יד זה מתאר את הליך איסוף הדגימות לניתוחי שיטה 1615.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. I. איסוף דגימות וירוסים

כאן אנו מציגים נוהל למדידת סך כל הנגיפים הניתנים לתרבית באמצעות קו תאי הכליה של הקוף הירוק של באפלו. הנוהל מספק כלי סטנדרטי למדידת הופעת נגיפים זיהומיים במי הסביבה ובמי השתייה.

מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה&quot;כ

מתודולוגיית דגימה מבוססת קצף מאקרו פותחה והוערכה לאיתור וכימות של נורו-וירוס על משטחים קשים סביבתיים.

שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

פותחה גישה לזיהוי תנאי ריכוז נגיפי אופטימליים עבור דגימות מים בנפח קטן באמצעות קוצים של אדנו-וירוס אנושי. הטכניקות המתוארות כאן משמשות לזיהוי פרמטרי ריכוז עבור מטרות נגיפיות אחרות, ומיושמות על ניסויים בריכוז נגיפי בקנה מידה גדול.

נוהל נפח קטן לריכוז נגיפי ממים

ייצור מי דימום (PBW) טופלו בננו-חלקיקי תחמוצת נחושתיות (CuO-NPs) והרעילות התאית הוערכה בתאים אנושיים מתורבתים. מטרת פרוטוקול זה הייתה לשלב את הדגימה הסביבתית המקומית בפורמט תרבית תאים המעריכה את השינויים ברעילות עקב טיפול ב-CuO-NP.

הסרת יסודות קורט ידי Cupric תחמוצת חלקיקים מאורניום<em&gt; באתר</em&gt; שחזור Bleed מים והשפעתה על כדאיויות תא

אנו מציגים את VacuSIP, שיטה פשוטה, לא פולשנית ואמינה לדגימה נקודתית נקייה ומדויקת של מים. המערכת פותחה והוערכה לאיסוף בו-זמני של המים הנשאפים והנשפים על ידי מזיני תרחיף בנתיים באתרם, כדי למדוד בצורה נקייה הסרה והפרשה של חלקיקים ותרכובות מומסות.

VacuSIP, שיטת INEX משופרת<em&gt; באתרו</em&gt; מדידה של חלקיקים מומס תרכובות מעובד על ידי האכלת השעית Active

פרוטוקול זה מאבחן אמנון אגם וירוס (TiLV) ברקמות אמנון באמצעות מתודולוגיות RT-PCR. השיטה כולה מתוארת מן דיסקציה רקמות כדי הכולל החילוץ RNA, ואחריו cDNA סינתזה וזיהוי של TiLV באמצעות PCR קונבנציונאלי או PCR כמותי באמצעות dsDNA מחייב צבע הכריכה פלורסנט.

זיהוי של אמנון אגם וירוס באמצעות קונבנציונאלי RT-PCR ו SYBR ירוק RT-qPCR

עיצוב מיקרועלילה למשך 15N מחקר המחקר מתואר כדי להכיל מספר רב של העונה באירועים המפעל הקרקע. הליכי איסוף ועיבוד של הקרקע והצומח, כולל פרוטוקולים לטחינת ושקילה, עבור הניתוח של 15N מושם.

מיקרועלילה עיצוב וצמח הכנה לדגימת קרקע עבור 15ניתוח חנקן

למדו את שיטת EPA 1615 לאיתור enterovirus ו-norovirus במים באמצעות RT-qPCR. השיטה מדגימה שחזור וירוסים של 20%-30% מדגימות מים תת-קרקעיות ומסייעת להערכת סיכונים בתחום המיקרוביולוגיה הסביבתית.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

גלה סרטונים נוספים