דור של Lymphocytic microparticles וזיהוי של Proapoptotic השפיעו על תאי אפיתל Airway

המטרה הכוללת של הליך זה היא להמחיש את הייצור במבחנה של מיקרו-חלקיקים לימפוציטים או LMPs מקו תאי לימפוציטים מסוג T, ולהדגים את השפעתם הפרו-אפופטוטית על תאי אפיתל של דרכי הנשימה. זה מושג על ידי ייצור ראשוני של ה-LMP. לאחר מכן, ה-LMPs המבודדים מאופיינים בניתוח פקס.

לאחר מכן מתרבית את רקמת הסימפונות. לבסוף, מתבצע טיפול LMP באקספלנטים של הסימפונות. בסופו של דבר, בדיקות היסטופתולוגיות כגון hemat, toin ו-eosin ו-NC זיהוי מוות של שני תאים משמשות כדי להראות נזק לשכבת האפיתל של הסימפונות המושרה על ידי LMP ואפופטוזיס של תאי אפיתל.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו בידוד מיקרו-חלקיקים מדם היקפי אנושי הוא שאנו מסוגלים לבצע ייצור בקנה מידה גדול של מיקרו-חלקיקים שמקורם בקו תאים בפעולת מבחנה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון ששלבים קריטיים של תרבות הסמפונות אינם קלים להכנה. להתחיל תרבות.

תאי CEMT בארבע צלוחיות T 1 75 שכל אחת מהן מכילה 150 מיליליטר טרי, בינוני ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס לצפיפות של 2 מיליון תאים למיליליטר. אספו את התאים מכל בקבוק על ידי צנטריפוגה ב-200 פעמים G למשך חמש דקות, וראוס כופפו 300 פעמים 10 לששת התאים לצלוחיות T 1 75 חדשות המכילות 150 מיליליטר של מדיום טרי. כדי לשמור על צפיפות של 2 מיליון תאים למיליליטר, הוסף 37.5 מיקרוליטר של אקטין מיצין D למדיום בריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

העבירו את כל מדיום התרבות לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר, וסובבו את התאים ב -750 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב-1500 פעמים G למשך 15 דקות כדי להסיר שברי תאים גדולים. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לבקבוק של 250 מיליליטר וצנטריפוגה אולטרה בטמפרטורה של 12,000 פעמים G למשך 50 דקות.

לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט ואספו את הכדורים. השתמש ב-40 מיליליטר של PBS סטרילי כדי לשטוף את הכדורים המועשרים ב-LMP בצינור של 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב-12,000 פעמים G למשך 50 דקות. חזור על שלב זה פעמיים.

אסוף את הסופרנטנט מהשטיפה האחרונה כדי לשמש כבקרת רכב עם מיליליטר אחד של PBS. השעו את הכדורים והעבירו לתוך צינור מיקרו סטרילי של 1.5 מיליליטר ואחסנו LMPs מבודדים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. כדי לאפיין מיקרו-חלקיקים על ידי ניתוח פקס, התחל בהכנת שתי דגימות של מאגר נקסין, אחת עם סידן כלורי ואחת ללא סידן.

בשפופרת פקס, יש לדלל מיקרוליטר אחד של LMPs ב-44 מיקרוליטר של מאגר נקסין עם סידן כלורי. הכן צינור נוסף באמצעות מאגר נקסין ללא סידן כלורי. לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של מדע X ו-V לכל צינור וערבבו היטב בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

לאחר הדגירה, השתמש ב-400 מיקרוליטר של נוזל נדן שפעת פקס. כדי לעצור את התגובות, הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף חרוזי ספירת שבעה מיקרון כסטנדרט פנימי בכל צינור. כדי להשיג ספירה מוחלטת, הוקמו שערים בגודל יחסי, FSCH וגרעיניות יחסית SSCH ועלילת נקודות על ציטומטר הזרימה.

שימוש בחרוזים פלואורסצנטיים מכוילים בגודל של מיקרומטר אחד לשער הראשון וספירת חרוזים בשבעה מיקרומטר. עבור שער שני, נתח את דגימת ה-LMP בחלקת F-S-C-H-S-S-C-H באמצעות השערים שנקבעו וערוץ FL ארבע עבור עלילת הנקודות של הנספח על ידי רכישת אות עד שמגיעים ל-10,000 חרוזי ספירה בהליכה שתיים, קבע את החיובי באירועי ex NV של LMPs במאגר נקסין המכיל סידן כלורי והחסר את האירועים של LMPs במאגר נקסין ללא סידן כלורי. חשב את המספר המוחלט של LMPs בהתבסס על המשוואה הבאה.

משתמש בפינצטה סופר עדינה של אזמל דומונט ובמספריים כירורגיות כדי לנתח רקמת ריאה באופן אספטי. הסר בזהירות את הפרנכימה וכלי הדם. מנתחים עוד יותר את הסימפונות השקועים במדיום שטיפת הרקמות ומפרידים את הסימפונות בקוטר של מילימטר עד 2.5 מילימטר מרקמות הריאה ההיקפיות.

השתמש באזמל כדי לפרוס רקמות סימפונות לשורות סימפונות בעובי של כחמישה מילימטר באמצעות תנועת גריפה עם מלקחיים מיקרו מעוקלים סטריליים. הרם את שברי הסימפונות והניח אותם על האזורים השרוטים של הכלים שהוכנו בעבר. על פי פרוטוקול הטקסט, הסר את מדיום שטיפת הרקמות ודגר שברים בטמפרטורת החדר למשך כחמש דקות כדי לאפשר להם להיצמד לכלים.

הוסף 10 מיליליטר של מדיום ריפוי שלם לכל מנה והניח אותם בתא חממה מודולרי באווירה מבוקרת עם תערובת גז חמצן גבוהה, שטוף את החדר, ואז הניח אותו בחממה מסלולית על שולחן ונער אותו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ב-10 מחזורים לדקה כדי לאפשר למדיום לזרום לסירוגין על השברים. לאחר הדגירה, התבונן בתצוגה של הרקמה תחת ניגוד פאזה ומיקרוסקופ אור הפוך. בחר תצוגה של הסימפונות עם תנועת שיער עדינה מלאה ואפיתל סימפונות תוסס לטיפול LMP לאחר מכן.

כדי לטפל ב-LMPs, ספרו את הסימפונות שנבחרו זה עתה וסמנו כל באר של צלחת תרבית רקמות של 12 בארות. עבור כל אקספלן מעבירים 0.5 מיליליטר של מצע גידול שלם לתוך צינור עינור סטרילי. לאחר מכן הוסף 25 מיקרוליטר של מלאי l ו-p לכל תיאור טיפול או הוסף 25 מיקרוליטר של רכב בקרה.

לצורך הבקרה, יש לערבב היטב על ידי הקשה עדינה על הצינור. העבירו את המדיום המעורב לכל באר של צלחת תרבית רקמות מסומנת של 12 בארות עם מלקחיים מיקרו חיתוך מעוקלים. העבירו כל סימפונות x שנבחרו לכל באר בצלחת תרבית הרקמה.

המשיכו את הדגירה בתא אינקובטור מודולרי באווירה מבוקרת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין לאחר 24 שעות. השתמש ב-PBS כדי לשטוף את ה-EXPLAN שלוש פעמים והמשך לקיבוע h ו-e צביעה ובדיקת המנהרה. על פי פרוטוקול הטקסט כפי שמוצג כאן, LMPs אופיינו בצביעת נקסין V על ידי ניתוח פקס ומגודרים באמצעות חרוזי מיקרומטר אחד כאשר 97% מה-MPS היו ב-nexin V sci-fi חיובי.

בדרך כלל, כ-2.5 מיליגרם של LMPs התקבלו בעקבות פרוטוקול זה. הוצאת רקמת הסימפונות משישה עכברים שחורים C 57 היו נתונים לטיפול ברכב וב-LMP. באיור זה, ניתוח היסטופתולוגי של חתכי הסימפונות חושף את ההשפעה של LMPs על השלמות המבנית של אפיתל הסימפונות.

בשליטה. Explan, אפיתל הסימפונות לא ניזוק ברובו. עם זאת, בצמחים שטופלו ב-LMP, שכבת תאי האפיתל השטחית נפגעה או אבדה, והיו ירידות משמעותיות בגובה ובצפיפות תאי האפיתל כפי שניתן לראות כאן.

צביעה חיובית של מנהרה, סמן לאפופטוזיס, הייתה בולטת יותר באפיתל הסימפונות שטופל ב-LMP בהשוואה לרקמת הביקורת. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד בתנאים סטריליים בעת ייצור מיקרו-חלקיקים וביצוע תרבית אקספלור רקמות.