הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה
13 ביולי 2015
ניתוח התכונות הפיזיולוגיות של נוירונים חושי ריח עדיין מתמודד עם מגבלות טכניות. כאן אנו מתעדים אותם באמצעות מהדק טלאי מחורר בהכנה שלמה של אפיתל הריח בעכברים ממוקדי גנים. טכניקה זו מאפשרת לאפיין את תכונות הממברנה ותגובות לליגנדים ספציפיים של נוירונים המבטאים קולטני ריח מוגדרים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד שינויים בתכונות הממברנה של נוירונים חושי ריח בתגובה לממריצי ריח. זה מושג על ידי ניתוח תחילה של אפיתל הריח והעברתו לתא מפוצץ. השלב השני הוא לאתר ולבחור OSN מעניין תחת המיקרוסקופ.
לאחר מכן, הכפתור הדנדריטי של ה-OSN הנבחר מהודק ומנותח תוך כדי גירוי עם ריחות. בסופו של דבר, הידוק טלאי מחורר של כפתורים דנדריטיים של OSN מאפיין את המאפיינים הפונקציונליים של OSN ברמת הממברנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הריח, כגון הקלטת חוש הריח, נוירונים חושיים, ביטוי קולטני אמנות ריח מוגדרים, וגם הקלטות מהדק תיקון.
ספק מידע על תכונות הממברנה של נוירונים אלה. הכינו את הפיפטות המגרות מזכוכית מילימטרית אחת או רכשו אותן מראש באמצעות להבה. כופפו שש פיפטות כסנטימטר אחד מהקצה לזווית של 45 מעלות.
לאחר מכן מסדרים את שש הפיפטות הכפופות סביב פיפטה ישרה שביעית, בעזרת עינית כמדריך ועוטפים אותן בצינורות כיווץ חום. מחממים את ניילון הכיווץ בקצה השני של הפיפטות. מרחו עוד ניילון מתכווץ.
זה הופך פיפטה מגרה של שבע חביות מראש. כעת באמצעות קוטבי רב חבית משוך את הפיפטה המגרה של שבע החביות. לאחר המשיכה, חזק את המכלול עם מעט דבק לבן סביב העין.
לאחר מכן הניחו לדבק להתייבש למשך הלילה של הפתרונות הנדרשים. יש להפוך את תמיסת הניסטטין לטרייה ממש לפני השימוש בה. במידת הצורך, שקלו שלושה מיליגרם של ניסטטין והוסיפו אותו ל-50 מיקרוליטר של DMSO.
ואז תערובת מערבולת למשך 20 שניות. לאחר מכן, סוניקציה של התערובת למשך שתיים-שלוש דקות כדי להבטיח דילול מלא. כעת הוסף 20 מיקרוליטר מהתערובת לחמישה מיליליטר של תמיסת מלאי תוך-תאית.
המיקס של וורטקס במשך 20 שניות, ואחריו שתיים-שלוש דקות של סוניקציה. לאחר מכן מצננים את תמיסת העבודה על קרח ושומרים אותה מוגנת מפני אור מוכן. בדרך זו פיתרון העבודה טוב לכמה שעות.
טען מזרק מצויד במיקרופילם עם תמיסת עבודה. זה יהיה טוב לשעה של שימוש עד לשימוש. עם זאת, שמור על המזרק הטעון על ידי שמירתו על קרח.
כעת משוך כמה אלקטרודות הקלטה עם צוואר ארוך ושני פתחי מיקרון. המטרה היא לקבל התנגדות של 15 עד 20 מגה אוהם לאחר טעינת תמיסת Nystatin. לבסוף, טען את הפיפטה המגרה בריח מדולל בצלצול. תמיסה.
עבור פרוטוקול זה, יש עכברים זמינים בין גיל שבועיים לארבעה שבועות. במצגת זו משתמשים בעכברים המבטאים או IRES tau GFP על ידי שימוש או IS tau GFP עכברים. כל הנוירונים המבטאים את ה-or המעניין יסומנו ב-GFP.
ניתן להשתמש בשיטה זו או לבטא אותה בכל האזורים. עם זאת, נתיחות והקלטות יהיו קלות יותר עבור ניתוחים המתבטאים באזור הגב. התחל בהרדמה ולאחר מכן עריפת ראשו של עכבר.
התוצאה של פרוטוקול זה תלויה באיכות הדיסקציה. שלבי דיסקציה אלה חייבים להיות קצרים ככל האפשר ולהיות מדויקים. כדי להתחיל בניתוח, השתמש במספריים מנתחים כדי לבצע חתך אורכי לאורך הגב.
משוך את העור כדי להסיר אותו. לאחר מכן חותכים לאורך הלסת התחתונה ומבצעים חתך עטרה במקביל לשיניים. לפיכך, הסר את השיניים החותכות העליונות.
כעת בצע חתך עטרה סביב הראש, מאחורי העיניים, השליך את הראש האחורי והעביר את החלק הקדמי לצלצולים קרים כקרח. כעת תחת מיקרוסקופ דיסקציה, בודד את המחיצה תוך חמש עד 10 דקות. התחל עם חתך אורכי לאורך הצד הגחוני.
לאחר מכן חותכים את עצמות הגב לאורך הצד הצדדי הגבי של חלל האף. לאחר מכן, הסר את רוב העצמות והחיך. העבירו את המחיצה המבודדת והצמידו את האפיתל למיכל של צלצולים מחומצנים בטמפרטורת החדר.
תוך חמש דקות, בצע את ההכנות האחרונות לפני ההקלטה. אסור שהפתרון יהיה חם מדי, אחרת ההכנה תיראה פגומה. כדי לגשת לאפיתל הנוירולוגי להקלטה.
ראשית, מקלפים את האפיתל מהמחיצה הבסיסית בעזרת מלקחיים. לאחר מכן בעזרת מספריים מיקרו ואנה, חותכים את הקצה הקדמי של המחיצה כדי לשחרר את האפיתל. כעת הסר בזהירות את איבר האף של הוומר.
חתוך אותו במקום בו הוא מחובר בגב. כעת ניתן להעביר את האפיתל המבודד לצד הריר של תא ההקלטה כלפי מעלה. לאחר המקום, השתמש בנבל כדי לשטח את הרקמה.
לאחר מכן העבירו את החדר למיקרוסקופ זקוף. דמיין את האפיתל העצבי תחת מטרת טבילה של פי 40 במים תוך החדרתו ללא הרף עם צלצולים טריים בטמפרטורת החדר. כדי להתחיל לחפש את התאים המעניינים, שבמקרה זה מבטאים EGFP, כך שאור של 480 ננומטר משמש לסריקת תאים הפולטים אור בטווח של 530 עד 550 ננומטר.
הכפתורים הדנדריטיים הממוקדים וה-osn כאשר הם נבדקים ב-80 עד 160 x תחת שדה בהיר צריכים להיות מובחנים בבירור מהתאים התומכים. כעת טען את האלקטרודה בתמיסת סטטינים S. הקש החוצה על כל הבועות שנוצרות והצמד את האלקטרודה למחזיק.
עכשיו הפעילו לחץ חיובי. ההתנגדות הצפויה היא בין 15 ל -20 מגה אוהם. ואז הביאו את האלקטרודה לתא תוך שמירה על הלחץ החיובי.
כאשר ההתנגדות עולה לכ- 40 מגה אוהם, שחרר את הלחץ והפעל לחץ שלילי קל. אם נוצר איטום ג'יגה, יש להדק את פוטנציאל הממברנה בכ-75 מילי-וולט שלילי. כעת, כשהתא פתוח, המשך בניסוי.
החל גירוי, פרוטוקולים וחלחל עם טיפולים תרופתיים לפי הצורך כדי לבדוק עם ריח יחיד. רשום 200 עד 500 אלפיות השנייה של פעילות ספונטנית. מרחו את הריח למשך 500 מילישניות ולאחר מכן מדדו את התגובות עד 10 שניות באמצעות הפרוטוקול המתואר.
MOR 23, המבטא נוירונים שתויגו ב-EGFP, תוקנו ועוררו בריכוזים שונים של al. במצב מהדק נוכחי, ליאל הוא ליגנד עבור MOR 23. לחלופין, התאים דומו במצב מהדק מתח.
בהקלטות מצב מהדק מתח נוטרו מאפיינים שונים. כדי לכמת את התגובה כפי שבוצעה באופן קלאסי באלקטרופיזיולוגיה באמצעות תגובת משרעת מקסימלית, תגובת המינון תוארה באמצעות משוואת הגבעה. תוצאות אלו מספקות מידע על מאפייני הקידוד של כל OSN, הכולל את סף הזיהוי, הזמן, הדינמי, הטווח הדינמי ורמת הרוויה שלו.
לאחר השליטה, ניתן לבצע את חלק הדיסקציה של טכניקה זו תוך 10 עד 15 דקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור תכונות פונקציונליות של נוירונים חושי ריח המבטאים קולטני ריח מוגדרים בעכברים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד במדידת התכונות הפיזיולוגיות של נוירונים חושיים ריח (OSNs) באמצעות טכניקות של patch-clamp מחורר (perforated patch-clamp). על ידי ניתוח של OSNs באפיתלית ריח שלמה מעכברים עם תarget גנטי, חוקרים יכולים לאפיין תכונות ממברנה ותגובות למולקולות ריח ספציפיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- חוש הריח
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- נוירונים תחושתיים של חוש הריח ממלאים תפקיד מכריע בתחושת הריח.
- מגבלות טכניות עיכבו את ניתוח התכונות הפיזיולוגיות שלהם.
- טכניקות של Perforated patch-clamp מאפשרות אפיון מפורט של תכונות הממברנה.
- עכברים עם תargeting גנטי מספקים מודל לחקר רספטורים אולפקטוריים ספציפיים.
מטרת המחקר
- למדידת שינויים בתכונות הממברנה של OSNs בתגובה לחומרי ריח.
- לאפיון תכונות פונקציונליות של OSNs ברמת הממברנה.
- למענה על שאלות מפתח בתחום הריח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ה disection של אפיתל הריח.
- העברה של האפיתל לתא פרפוזיה.
- בחירה מיקרוסקופית של תאי OSNs רלוונטיים.
- ביצוע patch clamping של ה-dendritic knob תוך כדי גירוי בריח.
תוצאות עיקריות
- הקלטה מוצלחת של תכונות ממברנה של תאי OSNs.
- אפיון של תגובות OSN לריחונות ספציפיים.
- תובנות לגבי התכונות הפונקציונליות של קולטנים ריחייים מוגדרים.
- הדגמה של יעילותן של טכניקות perforated patch-clamp.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי בעל ערך לחקר נוירונים תחושתיים של חוש הריח.
- היא משפרת את ההבנה של עיבוד ריח ברמה התאית.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו כדי להרחיב את חקר מנגנוני הריח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח תפקודי מדויק של נוירונים רגישים לריח (OSNs) המבטאים קולטני ריח מוגדרים מאפשר תיקוף יעדים ברמת ביטחון גבוהה בביולוגיה של החושים. הקלטות patch-clamp כמותיות בנוירו-אפיתליום שלם מספקות נתונים חזויים על אינטראקציות ליגנד-קולטן, התומכות בהסרת סיכונים מכניסטיים ובהמשכיות תרגומית עבור פורטפוליו של נוירו-פרמקולוגיה. גישה זו מחזקת החלטות בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור זהות הקולטן לפרופילי תגובה תפקודיים בהקשר פיזיולוגי רלוונטי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של תפקוד קולטני ריח בהקשר של רקמה טבעית.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי כימות ספציפיות הליגנד וספי סף להפעלת הקולטן.
- מסייע בביטחון ניבוי בבחירת מטרה באמצעות פלטים אלקטרופיזיולוגיים כמותיים.
- מספק תובנה מכניסטית לגבי מסלולי סיגנלינג המתווכים על ידי קולטנים הרלוונטיים לוויסות חושי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס בדיקות אלקטרופיזיולוגיות מתוקתקות וניתנות לשחזור לסריקה תפקודית של ליגנדים.
- מספק נתונים כמותיים של תגובה למינון התומכים בסטנדרטיזציה ובמדרגיות של הבדיקה.
- מאפשר הערכה מהימנה של השפעות תרכובות על נוירונים המבטאים רצפטורים מוגדרים.
- מכין מערכות ביולוגיות חסונות לאפיון פרמקולוגי המשכי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה תוצרי קריאה פונקציונליים למסלולים תחושתיים הרלוונטיים למחלה לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- שומרת על ארכיטקטורת הרקמה, ובכך תומכת ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
- מספקת נתונים מותאמי סיכון לקידום יעדים של מודולציה תחושתית במודלים פרה-קליניים.
- תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית עבור פורטפוליו של תרכובות נוירו-אקטיביות.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
שיטה זו משתלבת בממשק שבין הגילוי המוקדם לזיהוי המועמדים המובילים (lead identification), ומספקת גשר מאישוש המטרה למחקר פרה-קליני בנוירוวิทยา של החושים.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת אינטראקציות בין קולטן לליגנד ומבהיר מסלולי סיגנלינג תחושתיים ברקמה טבעית.
- סקרינינג: מספק פלטיים אלקטרופיזיולוגיים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק עקומות תגובה-מינון, ספי תגובה ומדידות של טווח דינמי לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: שומר על ההקשר הפיזיולוגי לצורך התאמת סמנים ביולוגיים והמשכיות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה לשימוש חוזר עבור ניתוח תפקודי של מערכות קולטן-ליגנד מגוונות בביולוגיה של החושים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בדיקות תפקודיות ומשפר את השחזוריות בין ניסויים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ומשפר את היעילות ההונית על ידי הפחתת סיכונים במטרות בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון וקידום של תוכניות לוויסות חושי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באלקטרופיזיולוגיה ובדיסקציה נוירו-אנטומית.
- נדרש מיכשור ייעודי ל-patch-clamp ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת הרקמה וההקלטה.
- ייתכן וידרש ביצוע התאמות לסוגי רצפטורים שונים או לאזורי רקמה שונים.
- איכות ההכנה וחיוניות הרקמה הן קריטיות לרכישת נתונים מהימנה.
