Name: הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: חקור תכונות תפקודיות של נוירונים סנסוריים חוש הריח בעכברים באמצעות טכניקת perforated patch-clamp. השיטה מאפשרת מדידת תכונות ממברנה בתגובה לריחות ספציפיים וניתוח קולטני ריח מוגדרים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לפיטר מומברטס על התרומה הנדיבה של עכברי OR-GFP; אן לפרנק ומתקן החיות CSGA לטיפול מעולה בבעלי חיים. המימון ניתן על ידי CNRS באמצעות מענקי ATIP ו-ATIP Plus, על ידי Conseil Régional de Bourgogne (מענקי FABER ו-PARI), על ידי Université de Bourgogne (תוכנית BQR).

פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של Université de Bourgogne ואושר על ידי ועדת האתיקה Université de Bourgogne. 1. בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש עכברים או-IRES-tauGFP מהונדסים גנטי זמינים במעבדה ג&#39;קסון. עכברים אלו פותחו במעבדה של ד&quot;ר פיטר &#39;Mombaerts כדי לנתח מיקוד ופיתוח האקסון של מערכת ההרחה 19. לדוגמא, קו MOR23-IRES-tauGFP, מספר מניות 006,643, נושא את השם הרשמי מתח B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; באופן דומה, הקו-SR1 IRES-tauGFP, מספר מניות 6717 נושא את השם הרשמי B6; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגבי הגיל של בעלי החיים: לתוצאה טובה יותר של הפרוטוקול, להשתמש בבעלי חיים בין 2 ל 4 שבועות של גיל. בקבוצת גיל זו, לנתיחה היא (עצמות רכות, אפיתל ריח מוצק יותר) קלים יותר והידיות הדנדריטים הן דוgger להשוות לבעלי חיים מבוגרים. </li></ol> 2. הכנת אלקטרודות ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפטפות המגרה: רכישת prepulled גירוי טפטפות. אחרת, להכין אותם באופן ידני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בלהבה, לכופף שש טפטפות זכוכית 1 מ&quot;מ בכ 1 סנטימטר מהקצה. הכנס שש טפטפות אלה בתוספת 7 ה ישר בצינורות כיווץ בחום 1.5 סנטימטר לחזק על ידי לולאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום לכווץ את צינורות כדי לשמור על החביות המצורפות יחד. צרף צינורות לכווץ נוספים לגפיים האחרים של החביות. משוך פיפטה גירוי זה עם חולץ רב-חבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף קצת דבק נוזלי לבן סביב חריר כדי לחזק את הטיפים הכפופים. בואו N / O היבש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן L 1 או 2 של הפתרון תאי רינגר הרגיל (מ&quot;מ: 124 NaCl, KCl 3, 4 MgSO 1.3, CaCl 2 2, 3 NaHCO 26, Nah 2 PO 4 1.25, 15 גלוקוז; mOsm pH 7.6 ו 305). שמור על 4 מעלות צלזיוסעד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות תאיים (מ&quot;מ): 70 KCl, KOH 53, חומצת methanesulfonic 30, EGTA 5, HEPES 10, סוכרוז 70; pH 7.2 (KOH) וmOsm 310. שמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. טוב למספר שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון תאיים הקלטה עם nystatin הכנה מוקדמת (ברגע האחרון) לפני הניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 3 מ&quot;ג של nystatin, להוסיף 50 μl של DMSO; מערבולת 20 שניות לאחר מכן sonicate 2-3 דקות עד מדוללים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של פתרון DMSO-nystatin ב 5 מיליליטר של פתרון מניות תאיים. מערבולת 20 שניות, ואז sonicate 3 דקות. שמור פתרון זה על 4 מעלות צלזיוס ולהגן מפני אור ישיר, nystatin הוא רגיש לאור. פתרון זה יכול לשמש לכמה שעות. להחליף כל יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכנת אפיתל ההרחה היא מתחת למיקרוסקופ, לקחת חלק בפתרון זה במזרק 1 מיליליטר עם קצה צהוב-מוארך להבה למלא את האלקטרודות; להגן מפני אור ישיר. ברגע שב RT, פתרון nystatinאינו יציב; להחליף את הפתרון במזרק 1 מ&quot;ל כל שעה או לשמור אותו בקרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך אלקטרודות הקלטה עם חולץ להשיג צוואר ארוך וטיפ קטן (~ 2 מיקרומטר) עם התנגדות של 15-20 MΩ עם פתרון nystatin הפנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון odorant על 0.5 M בDMSO מתחת למכסה המנוע קטר; aliquot ולשמור ב -20 ° C עד שימוש. לדלל odorant בפתרון של רינגר עד הריכוז הרצוי. מלא את פיפטה הגירוי. </li></ol> 3. הכנת אפיתל הרחה הערה: עכברים או-IRES-tauGFP להביע tauGFP תחת שליטתו של היזם או. בעכברים אלו, כל הנוירונים המבטאים את או עניין מסומנים עם GFP. פרוטוקול זה מותאם עבור חדרי הניתוח באו לידי ביטוי בכל האזורים. עם זאת, ניתוחים והקלטות קלים יותר לחדרי ניתוח הביע באזור הגב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה על ידי הזרקת תערובת של קטמין ו xylazine (150 מ&quot;ג / קילוגרם ו -10 מ&quot;ג / קילוגרם דירקטוריוןמשקל y, בהתאמה). עריפת ראש יכול להתבצע במספריים חדים לעכברים צעירים או עם הגיליוטינה מכרסמים מתוחזקים היטב לעכברים מבוגרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים לנתח טבעת באמצעות לעשות חתך המדיאלי אורך דרך עור הגב. הסר את העור על ידי משיכתו לגזרים. בעזרת המספריים, לחתוך את הלסתות התחתונות במפרק הלסת. הסר את השיניים הקדמיות העליונות במקביל חתך עטרה לשיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך עטרה של הראש מאחורי העיניים ולשמור את החלק הקדמי בלבד של הראש. לטבול אותו בתמיסת רינגר קר כקרח לנתיחה בהיקף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח תחת ההיקף: בצד הגחון, לעשות חתך אורכי לאורך הלסת העליונה / השיניים. חותך את עצמות גב לאורך זמן, הבאים בצד dorso-הרוחב של חלל האף. להסיר את רוב העצמות וחיך; להעביר את המחיצה ואפיתל קשור אליו ברינגר חומץ בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתיחה הסופית: ממש לפני שמתחילה את ההקלטהפגישה, לקלף את האפיתל מהמחיצה הבסיסית עם מלקחיים. לנתק את האפיתל עם מלקחיים ועם שני 4-5 חתכי מספריים מ&quot;מ (מספריים microvannas שימוש) בחלק הקדמי של מחיצת האף שבו ההידבקות חזקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את איבר יעקובסון על ידי חיתוך אותו לאורך הגב שלה לחיבור האפיתל במחיצה. העבר את האפיתל לחדר הקלטה עם שכבת הריר פונה כלפי מעלה; לשמור את זה שטוח בתא עם נבל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן תא תחת מיקרוסקופ הזקוף מצויד באופטיקה הקרינה ומצלמה רגישה. דמיין את ההכנה על מסך המחשב בהגדלה גבוהה דרך 40X מטרת מים טבילה (צמצם מספרי 0.8) והגדלת 2X או 4X נוסף הושגה על ידי זכוכית מגדלת. Perfuse ברציפות עם צלצול מחומצן בRT (1-2 מיליליטר / דקה). </li></ol> 4. הקלטת מושב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחפש את תא ניאון: להלהיב את ההכנה ב480ננומטר לEGFP, אשר פולט אור בטווח 530-550 ננומטר; יעד ידית הדנדריטים אחד שהיא באופן מהימן גלוי בקרינה ותחת שדה בהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא אלקטרודה עם פתרון תאיים עם nystatin; להסיר בועות בעדינות על ידי הקשה על האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס האלקטרודה על בעל אלקטרודה, להפעיל לחץ חיובי בפיפטה; התנגדות צריכה להיות 15-20 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא האלקטרודה קרובה לתא; פעם התנגדות מגיעה ~ 40 MΩ, לשחרר לחץ חיובי ולהפעיל לחץ שלילי קל להגיע gigaseal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהוא הגיע חותם, להגדיר את פוטנציאל הממברנה בכ -75 mV; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתא נפתח, להמשיך עם פרוטוקולי גירוי, טיפולים תרופתיים. כדי למדוד את התגובה לגירוי odorant אחת, שיא 200-500 אלפיות שני של פעילות ספונטנית, לעורר עבור 500 אלפית שני ולמדוד את התגובה של התא לתקופה של עד 10 שניות 13. לטיפולים תרופתיים, perfuse הסוכנים תרופתיים בהריכוז הרצוי 20. </li></ol> ניתוח נתונים 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח זרמים שהושרו על ידי גירוי odorant אחריו כמו: משרעת המרביות, עלייה-הזמן (זמן דרוש כדי להגיע ל -90% ממשרעת המרבית, באלפיות שני), הסכום הנוכחי (שטח מתחת לעקומה בPAS), בפעם ב 50% (זמן בין תחילת והקיזוז של התגובה ב -50% את המשרעת המרבית, באלפיות השני). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בזרמי התמרה השיא (משרעת מרבי הגיע) בריכוזים שונים, לצייר ולהתאים עקומת תגובת מינון באמצעות משוואת היל: אני = Imax / (1 ​​+ (K 1/2 / n C)), שבו אני מייצג את השיא נוכחי , IMAX התגובה המרבית בריכוזים להרוות, K1 / 2 הריכוז שבהגיעה מחצית מהתגובה המרבית, C ריכוז odorant וn מקדם היל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח הקלטות של פוטנציאל הממברנה במהדק נוכחי לשלילת הקוטביות המרבית, טוטהפוטנציאל l הושר (שטח מתחת לעקומה בmVsec); פעילות שיא ספונטנית spiking מעל 30 שניות עד 1 הקלטות דקות; שיא רגישות דרך קוצים שהושרו על ידי הזרקה של זרמים (5-10 הרשות הפלסטינית). </li></ol>

<ol><li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+amplification+by+calcium-dependent+chloride+channels+in+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells.</a> Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).</li>
<li>Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-induced+responses+recorded+from+olfactory+receptor+neurons+using+the+suction+pipette+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique.</a> J Vis Exp. (62), e3862(2012).</li>
<li>Moss, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+biochemical+responses+of+mouse+vomeronasal+receptor+cells+to+urine-derived+compounds%3A+possible+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action.</a> Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).</li>
<li>Kaur, A., Dey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+calcium+imaging+of+dissociated+vomeronasal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons.</a> Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).</li>
<li>Ma, M., Chen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+rat+and+mouse+olfactory+receptor+neurons+from+an+intact+epithelial+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation.</a> J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).</li>
<li>Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li>
<li>Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptor+expression+defines+functional+units+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system.</a> J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).</li>
<li>Bozza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+class+I+and+class+II+odorant+receptors+to+glomerular+domains+by+two+distinct+types+of+olfactory+sensory+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse.</a> Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).</li>
<li>Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minigenes+impart+odorant+receptor-specific+axon+guidance+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb.</a> Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).</li>
<li>Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+of+mouse+olfactory+sensory+neurons+by+odorant+receptors+and+the+beta2+adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor.</a> Cell. 117 (6), 833-846 (2004).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li>
<li>Grosmaitre, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SR1%2C+a+mouse+odorant+receptor+with+an+unusually+broad+response+profile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile.</a> J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).</li>
<li>Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+responses+of+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptor+MOR23%3A+a+patch+clamp+analysis+in+gene-targeted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).</li>
<li>Lam, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+responsiveness+of+embryonic+mouse+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptors+S1+or+MOR23%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23.</a> Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+stimulus+specificity+and+glomerular+position+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system.</a> Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).</li>
<li>Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+detection+of+amines+by+a+trace+amine-associated+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor.</a> J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).</li>
<li>Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+odorant+receptors+and+response+properties+of+olfactory+sensory+neurons+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice.</a> Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).</li>
<li>Cadiou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+odorant+exposure+induces+peripheral+olfactory+plasticity+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level.</a> J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+wiring+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal wiring in the mouse olfactory system.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).</li>
<li>Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+functions+of+mammalian+olfactory+sensory+neurons+as+odor+detectors+and+mechanical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors.</a> Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).</li>
<li>Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+response+properties+of+rat+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Odor response properties of rat olfactory receptor neurons.</a> Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).</li>
<li>Heydel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-binding+proteins+and+xenobiotic+metabolizing+enzymes%3A+implications+in+olfactory+perireceptor+events%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events.</a> Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).</li>
<li>Pelosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perireceptor+events+in+olfaction%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Perireceptor events in olfaction).</a> J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).</li>
<li>Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-phosphoinositides+modulate+cyclic+nucleotide+signaling+in+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons.</a> Neuron. 33, 731-739 (2002).</li>
<li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+%27IP%283%29-odors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors.</a> J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).</li>
<li>Savigner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+spontaneous+and+odorant-evoked+activity+of+rat+olfactory+sensory+neurons+by+two+anorectic+peptides%2C+insulin+and+leptin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin.</a> J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).</li>
<li>Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase-dependent+antagonism+in+mammalian+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons.</a> J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרס כלכלי מתחרה.

היכולת של פרוטוקול זה כדי לפקח בצורה נכונה את המאפיינים של OSNs הבריא תלויה במידה רבה באיכות של התכשיר. לכן, הצעדים לנתיחה הם קריטיים. הראשון הוא קריטי לשים לב לאיכות (pH, osmolarity), חמצון וטמפרטורה של המדיום לנתיחה (אבל לא קפוא קר כקרח). שנית, המניפולציה של האפיתל עם כלים לנתח חייבת להיות מוגבלת ככל האפשר, כדי למנוע נזקים. לבסוף, זה הוא קריטי להשגת הכנה שטוחה ככל האפשר על מנת לגשת לאוכלוסיית OSN הגדולה ככל האפשר. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rt...

נוירונים חושיים ריח (OSN) מייצגים את השלב הראשון של תפיסת חוש הריח. ממוקם באפיתל ההרחה המצפה את חלל האף במכרסמים, הם יהפכו את המידע הכימי של ניחוחי לפוטנציאל פעולה שנשלח דרך האקסון שלהם למוח. כדי להבין טוב יותר את מנגנוני קידוד חוש הריח, יש צורך לאפיין את תכונות התמרה וקרום של OSNs. עד לאחרונה, רוב הטכניקות המשמשות כדי לאפיין את המאפיינים של OSNs יונקים בוצעו על 1-4 OSNs ניתקו. תהליך הניתוק משתמש (כלומר, אנזימים) תהליכים שונים מכאניים וכימיים לשחרר OSNs מסביבתם. תהליכים אלה גורמים למספר נמוך של תאים זמינים להקלטות. מספר נמוך זה יכול להיות אפילו יותר קריטי במקרה של תאי ה- GFP שכותרתו. דיסוציאציה גם מסירה את אינטראקציות תא אל התא המקומיות בין OSNs ותאים אחרים של אפיתל הריח שעשוי לשפר survivאל ואפנון של הנכסים &quot;OSNs. כדי לעקוף את הליך הניתוק, הכנה שלמה פותחה 5. כל OSN מבטא קולטן אחד חוש הריח (OR) נבחר ממשפחת multigene גדולה 6. יש ~ 1,000 חדרי ניתוח הביטוי באפיתל ההרחה העיקרי בעכבר. בשל המספר הגדול של בעלי חיים או בסוג בר, הסיכויים להקליט OSNs להביע זהה או נמוכים מאוד. כדי להתגבר על מגבלות אלה, עכברי גן ממוקד זמינים שבו כל OSNs להביע מזוהה או מסומנים עם חלבון פלואורסצנטי 7-9. OSNs שכותרתו אלה שמשו לעשות אנליזה פונקציונלית בהכנות ניתק 7,10,11 עם החסרונות שהוזכרו קודם לכן. הכנת אפיתל ללא פגע 5 מעכברים שכותרתו גנטית ולכן עוקפת בעיות אלה. זה מאפשר הניטור של הפעילות של OSNs להביע חדרי ניתוח מוגדרים במדויק בסביבה הקרוב בviVO ככל האפשר. חוץ מזה, הקלטות תיקון מהדק של OSNs גם יאפשרו ניתוח מדויק של תכונות קרום, פרמקולוגיה מסלול התמרה, יגנד / או אינטראקציות. בקושי ניתן לנתח את כל הנושאים הללו באמצעות הקלטות תאית. השתמשנו בטכניקה זו כדי לעקוב אחר התגובות של OSNs מבטאות את הקולטנים odorant SR1 וMOR23 12,13. ההיתכנות של הטכניקה אושרה על ידי קבוצות אחרות בMOR23 להביע 14 OSNs כמו גם בחדרי ניתוח אחרים להביע נוירונים 15,16. הניטור של אוכלוסייה מוגדרת של OSNs יכול להוביל לניתוח של המאפיינים שלהם בהקשרים רבים ושונים כגון פיתוח 14, הזדקנות 17, odorant מושרה פלסטיות 18, ותפקידם של שינויים ברצף של קולטן odorant בריח קידוד 15. פרוטוקול זה ובכך מספק כלי רב עוצמה כדי לעקוב אחר התכונות הפונקציונליות של OSNs המוגדר ברמת הקרום.

<table><tbody><tr><td>שולחן רטט עם כלוב פאראדיי</td><td>TMC</td><td>63-500 SERIES</td><td>נדרש: מבודד את מערכת ההקלטה מרעידות הנגרמות על ידי הסביבה (תנועות נסיין, רעידות של ציוד כגון מאווררים לקירור מחשבים וכו'); ניתן לרכוש גם עם כלוב פאראדיי, או מצויד בכלוב פאראדיי בהתאמה אישית; כלוב זה מומלץ כדי למנוע רעש חשמלי מאופטיקה</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>סביבתיתמיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>BX51WI</td><td>מיקרוקופ זקוף המצויד באפיפלואורסצנטי; שלב קבוע או נע בהתאם ליעדי העדפת המשתמש</td></tr><tr><td></td><td>אולימפוס</td><td>LUMPLFL40XW</td><td>לפחות 2 מטרות נדרשות: 4X או 10X לגישה גסה לתא; ודוגמה למרחקים ארוכים טבילה פי 40 אולימפוס LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD: זכוכית מגדלת 3.3 מ"מ</td></tr><tr><td></td><td>אולימפוס</td><td>U-TVCAC</td><td>נדרש בהחלט: ממוקם בנתיב האור בין האובייקט למצלמה; מאפשר להגדיל את התמונה על המסך על מנת להגיע במדויק לכפתור עם מצלמת אלקטרודות ההקלטה</td></tr><tr><td></td><td>אולימפוס</td><td>DP72</td><td>נדרשת מצלמה טובה כדי לראות את הנוירונים בפלואורסצנטיות כמו גם בשדה בהיר; תוכנת הבקרה פשוטה ומאפשרת לצלם ולבצע תמונת מצלמה חיה כדי לפקח על התקרבות האלקטרודה לתא. אין צורך במצלמה אולטרה-רגישה</td></tr><tr><td>מסננת</td> את <td>אולימפוס/כרומה</td><td></td><td>בהתאם לחלבון הפלואורסצנטי המשמש בעכברים; דוגמה ל-GFP: עירור: BP460-490: פליטה: מגבר HQ530/50m</td></tr><tr><td></td><td>HEKA</td><td>EPC10 USB</td><td>מנטר את הזרמים הזורמים דרך אלקטרודת ההקלטה וגם שולט בנשיפה על ידי שליחת אות TTL לשפריצר; הגדרת ה-EPC10 נשלטת על ידי</td></tr><tr><td>תוכנת</td> <td>מחשבHEKA</td><td>Patchmaster</td><td>שולט במגבר במהלך המיקרומניפולטור</td></tr><tr><td></td><td>Sutter</td><td>MP225</td><td>מיקרומניפולטור מדויק, מאפשר תנועות מדויקות עד 1/10 המיקרומטר; דגם זה יציב מאוד; הימנע ממניפולטורים הידראוליים שעלולים להיסחף</td></tr><tr><td>לחולץ האלקטרודות</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>עם חוט שוקת רחב FT345-B; &nbsp; להכנת פיפטות הקלטה של כ-2&micro; קוטר מ 'עם קצה ארוך כדי להגיע לתאים; ההתנגדות צריכה להיות 15 עד 20Mohm עם זכוכית תמיסת מהדק תיקון מחוררת</td></tr><tr><td></td><td>Sutter</td><td>BF120-69-10</td><td>בתנאי ההקלטה שלנו, זכוכית זו אידיאלית להקלטת</td></tr><tr><td>תא הקלטה</td><td>של וורנר אינסטרומנטס</td><td>RC-26G</td><td>יש צורך בתא כדי להגדיר את התכשיר מתחת למיקרוסקופ. כדי לשמור על התכשיר במרכז החדר, יש להשתמש ברשת/עוגן.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>זכוכית <td>גירוי</td></tr><tr><td></td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>מחוברת בקבוצות של 7, פיפטות אלה משמשות להכנת פיפטות מגרות שנמשכו מראש</td></tr><tr><td>חולץ רב-חבית</td><td>MDI</td><td>PMP-107-Z</td><td>על ידי אסוציאציה של משיכה וטוויסט, מושך זה מאפשר לנו להכין אלקטרודות נפיחות עם מזרק לחץ מדויק של 7 חביות</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>חברת Toohey</td><td>P/N T25-1-900 ערוץ יחיד&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>מזרק לחץ מדויק זה שולט בלחץ הנפלט במושך הרב-חבית; הוא נשלט באופן ידני או על ידי המגבר על ידי 5V&nbsp; </td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td> TTLs <td>Narishige</td><td>YOU-1</td><td>מניפולטור גס מספיק כדי לקרב את האלקטרודה המתנפחת לאתר ההקלטה</td></tr><tr><td>צינורות</td><td>טיגון N/A</td><td></td><td>כדי להביא את הלחץ מהנשיפה לתמיסות פיפטה מתנפחות</td></tr><tr><td>/זלוף/כימיקלים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום</td><td>Gardner Denver</td><td>300 series</td><td>משאבת ממברנה רוטטת שקטה ויעילה יותר מסוגים אחרים של משאבות</td></tr><tr><td>מערכת זלוף</td><td>N/A</td><td>N / A</td><td>מערכת זלוף כבידה עם צינורות פוליאתילן כדי להכניס ולהוציא את התמיסה החיצונית מתא ההקלטה</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3503</td><td>חובה לחלחל תמיסה פנימית עבור מהדק תיקון מחורר</td></tr><tr><td>DIMETHYL SULFOXIDE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>משמש להמסת ניסטטין לפתרון פנימי עבור תיקון מחורר&nbsp;</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9625</td><td>תמיסה חוץ-תאית</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4504</td><td>תמיסה תוך-תאית/חוץ-תאית</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C7902</td><td>תמיסה חוץ-תאית</td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונוהידראט מונוהידראט (NaH2PO4)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9638</td><td>תמיסה חוץ-תאית</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי הפטהידראט (MgSO4 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td>תמיסה חוץ-תאית</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>תמיסה חוץ-תאית</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>תמיסה</td></tr> <tr><td>חוץ-תאיתEGTA (אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N&פריים;,N&פריים;-חומצה טטראצטית)</td><td>תמיסה פנימית</td> <td>של סיגמא-אולדריץ</td>' <td>E3889</td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1767</td><td>תמיסה פנימית</td></tr><tr><td>מתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>W387509</td><td>תמיסה תוך-תאית</td></tr><tr><td>Hepes-Na</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S0389</td><td>פתרון תוך-תאי</td></tr></tbody></table>

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

ניתוח התגובות הפיזיולוגיות של תאי עצב תחושתיים חוש הריח (OSN) כאשר מגורה עם ligands הספציפי הוא קריטי כדי להבין את הבסיס של התנהגויות מונעים ריח והאפנון שלהם. מאפייני קידוד אלה תלויים במידה רבה באינטראקציה הראשונית בין מולקולות ריח וקולטני הריח (OR) באו לידי ביטוי בOSNs. ספקטרום זהות, הסגוליות ויגנד של ביטוי או קריטיים. ההסתברות למצוא יגנד של או הביטוי בOSN נבחר באופן אקראי בתוך האפיתל הוא נמוך מאוד. כדי להתמודד עם אתגר זה, פרוטוקול זה משתמש גנטי עכברים מתויגים המבטאים את ה- GFP חלבון פלואורסצנטי תחת השליטה של ​​האמרגן של חדרי ניתוח שהוגדר. OSNs ממוקם באפיתל הדוק ומסודר המצפים את חלל האף, עם תאי שכנים משפיעים ההתבגרות ותפקודם. כאן אנו מתארים שיטה לבודד אפיתל ריח שלם ולהקליט דרך הקלטות תיקון מהדק המאפיינים של דואר OSNsxpressing קולטנים odorant מוגדרים. הפרוטוקול מאפשר לאפיין תכונות קרום OSN, תוך שמירה על ההשפעה של רקמות שכנות. ניתוח של תוצאות תיקון מהדק מניב כימות מדויק של יגנד / או אינטראקציות, מסלולי העברה ופרמקולוגיה, תכונות הקידוד &#39;OSNs והאפנון שלהם ברמת הקרום.

התוצאה של פרוטוקול זה תלויה באיכות של הנתיחה. צעדים לנתיחה זה חייבים להיות קצרים (פחות מ 10 עד 15 דקות) ומדויקים (כלומר, כדי למנוע נזקים של האפיתל). איור 1 מדגים כיצד הכנה אידיאלית נראית כמו ברמות הגדלה שונות. בהגדלה נמוכה בשדה בהיר תאים מסוגים השונים (כגון ידיות של OSNs, תמיכה תאים) הם (איור 1 א) להבחנה. ברמה הגבוהה ביותר בהגדלה, בדרך כלל 80x ל160X, בשדה בהיר, ידיות הדנדריטים של OSNs צריכה להיות הבחנה מתאי התומכים (איור 1)</stron...

ניתוח התכונות הפיזיולוגיות של נוירונים חושי ריח עדיין מתמודד עם מגבלות טכניות. כאן אנו מתעדים אותם באמצעות מהדק טלאי מחורר בהכנה שלמה של אפיתל הריח בעכברים ממוקדי גנים. טכניקה זו מאפשרת לאפיין את תכונות הממברנה ותגובות לליגנדים ספציפיים של נוירונים המבטאים קולטני ריח מוגדרים.

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד שינויים בתכונות הממברנה של נוירונים תחושתיים ריחוניים בתגובה למגרים ריחוניים. זאת מושג תחילה על ידי דיסקציה של אפיתל הריח והעברתו לתא פרפוזיה. השלב השני הוא איתור ובחירה של OSN רלוונטי תחת המיקרוסקופ.לאחר מכן, מבצעים patch clamp של הבליטה הדנדריטית (dendritic knob) של ה-OSN שנבחר ומנתחים אותה בזמן גרייה באמצעות חומרי ריח. לבסוף, שימוש ב-perforated patch clamping של בליטות דנדריטיות של OSN מאפשר לאפיין את התכונות התפקודיות של ה-OSN ברמת הממברנה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הריח, כגון הקלטה של נוירונים תחושתיים של הריח המבטאים קולטני ריח מוגדרים, וכן ביצוע הקלטות patch clamp.ספק מידע על תכונות הממברנה של נוירונים אלו. הכן את פיפטות הגירוי מזכוכית בעלת קוטר של one millimeter או רכוש פיפטות שנמשכו מראש באמצעות להבה. כופף שש פיפטות במרחק של כ-one centimeter מהקצה לזווית של 45 מעלות.לאחר מכן, סדרו את שש הפ pipette בעלות הקצה הכפוף סביב pipette שביעית ישרה, בעזרת טבעת הנחיה, ועטפו אותן בשרוול בידוד מתכווץ בחום. חממו את השרוול המתכווץ בקצה השני של ה-pipettes. הוסיפו שרוול בידוד מתכווץ נוסף.שלב זה יוצר פיפטת גירוי בעלת שבעה תעלות. כעת, באמצעות משיכה רב-תעלתית, משכו את פיפטת הגירוי בעלת שבע התעלות. לאחר המשיכה, חזקו את המבנה באמצעות מעט דבק לבן מסביב ללולאה.לאחר מכן, יש להמתין לייבוש הדבק בן לילה לפני הכנת התמיסות הנדרשות. יש להכין את תמיסת ה-Nystatin באופן טרי רגע לפני השימוש. במידת הצורך, שקלו 3 mg של Nystatin והוסיפו אותם ל-50 µL של DMSO.לאחר מכן, ערבבו את התערובת במערבל Vortex למשך 20 שניות. לאחר מכן, בצעו סוניקציה לתערובת למשך שתיים עד שלוש דקות כדי להבטיח דילול מלא. כעת, הוסיפו 20 µL מהתערובת ל-5 mL של תמיסת מלאי תו-תאית.ערבב במכשיר וורטקס (Vortex) למשך 20 שניות, ולאחר מכן בצע סוניקציה למשך שתיים עד שלוש דקות. לאחר מכן, קרר את תמיסת העבודה על קרח ושמור אותה מוגנת מאור. באופן זה תהיה תמיסת העבודה יציבה למשך מספר שעות.מלאו מזרק המצויד במיקרופילם בתמיסה עובדת. המזרק יהיה יעיל למשך שעה אחת מרגע המילוי. עם זאת, יש לשמר את המזרק המומלא על קרח.כעת משכו מספר אלקטרודות הקלטה בעלות צוואריים ארוכים ופתחים של שני מיקרון. המטרה היא להגיע להתנגדות של 15 עד 20 מגההום לאחר המילוי בתמיסת Nystatin. לבסוף, מלאו את פיפטת העגיור בחומר ריח המדולל בתמיסת ringer.עבור פרוטוקול זה, הכינו עכברים בגיל שבין שבועיים לארבעה שבועות. במצגת זו נעשה שימוש בעכברים המבטאים or IRES tau GFP. באמצעות שימוש בעכברי or IS tau GFP, כל הנוירונים המבטאים את ה-or הרלוונטי יסומנו ב-GFP.ניתן להשתמש בשיטה זו עבור או עבור ביטוי של כל האזורים. עם זאת, נתיחות והקלטות יהיו קלות יותר עבור ORs המבטאים את עצמם באזור הגבי (dorsal zone). התחילו בהרדמה ולאחר מכן בעריפת ראשו של עכבר.תוצאת פרוטוקול זה תלויה באיכות של הנתיחה. שלבי נתיחה אלו חייבים להיות קצרים ככל האפשר ומדויקים. כדי להתחיל בניתוח, השתמשו במספרי נתיחה כדי לבצע חתךlongitudinal לאורך הגב.משכו את העור כדי להסירו. לאחר מכן, גזרו לאורך הלסת התחתונה ובצעו חיתוך קורונלי במקביל לשיניים. באופן זה, הסירו את שיני החיתוך העליונות.כעת בצעו חיתוך קורונלי מסביב לראש, מאחורי העיניים, השליכו את החלק האחורי של הראש והעבירו את החלק הקדמי לתמיסת Ringers קרה על קרח. כעת, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, בודדו את המחיצה (septum) בתוך חמש עד 10 דקות. התחילו בחיתוך אורך לאורך הצד הוונטרלי.לאחר מכן, גזרו את העצמות הגבאיות לאורכן לאורך הצד הגבאי-צדי של חלל האף. לאחר מכן, הסירו את רוב העצמות ואת החיך. העבירו את המחיצה המבודדת ואת האפיתל המחוברת אליה למכל עם תמיסת רינגר מחומצנת בטמפרטורת החדר.בתוך חמש דקות, בצעו את ההכנות האחרונות לפני ההקלטה. התמיסה לא תהיה חמה מדי, אחרת ההכנה תיראה פגועה. כדי לגשת לאפיתל העצבי לצורך הקלטה.ראשית, קלפו את האפיתל מהמחיצה שמתחתיו באמצעות פינצטה. לאחר מכן, בעזרת מספרי Vanna מיקרו, גזרו את הקצה הקדמי של המחיצה כדי לשחרר את האפיתל. כעת הסירו בזהירות את אישוף הומר (vomer nasal organ).חתכו את הרקמה בנקודת ההיצמדות הגבית שלה. כעת ניתן להעביר את האפיתלים המבודד לתא ההקלטה כאשר צד הרירית פונה כלפי מעלה. לאחר המיקום, השתמשו בנבל (harp) כדי לשטח את הרקמה.לאחר מכן, העבירו את התא למיקרוסקופ אנכי. הדמיעו את הנוירו-אפיתל תחת עדשת שיקוע במים של 40x, תוך כדי פרפוזיה רציפה של תמיסת ringers רעננה בטמפרטורת החדר. כדי להתחיל בחיפוש אחר התאים הרלוונטיים, אשר במקרה זה מביעים EGFP, השתמשו באור באורך גל של 480 nanometers לסריקת תאים הפולטים אור בטווח של 530 עד 550 nanometer.הקנובים הדנדריטיים וה-osn שנבחרו, כאשר הם נסקרים ב-80 עד 160 x תחת שדה בהיר, צריכים להיות מובחנים בבירור מהתאים התומכים. כעת, טענו את האלקטרודה בתמיסת S statin. הקישו על האלקטרודה כדי להוציא בועות אוויר שנוצרו, וחברו אותה למחזיק.כעת הפעילו לחץ חיובי. ההתנגדות הצפויה היא בין 15 ל-20 mega ohms. לאחר מכן, הביאו את האלקטרודה לתא תוך שמירה על הלחץ החיובי.כאשר ההתנגדות עולה לכ-40 mega ohms, שחררו את הלחץ והפעילו לחץ שלילי קל. אם נוצר giga seal, יש לקבע את פוטנציאל הממברנה בכ-75 millivolts שליליים. כעת, לאחר שהתא פתוח, המשיכו בניסוי.הפעילו גירוי, פרוטוקולים, ובצעו פרפוזיה עם טיפולים פרמקולוגיים לפי הצורך כדי לבחון עם חומר ריח בודד. רשמו 200 עד 500 מילי-שניות של פעילות ספונטנית. החילו את חומר הריח למשך 500 מילי-שניות ולאחר מכן מדדו את התגובות למשך עד 10 שניות בהתאם לפרוטוקול המתואר.נוירונים המבטאים MOR 23 ומסומנים ב-EGFP עברו פאצ' (patch) ועוררו בריכוזים שונים של al. במצב current clamp, lyal משמש כליגנד עבור MOR 23. לחילופין, התאים סומולצו תחת מצב voltage clamp.בהקלטות במצב קיבוע מתח (voltage clamp), נוטרו מאפיינים שונים. כדי לכמת את התגובה כפי שנעשה באופן קלאסי באלקטרופיזיולוגיה באמצעות תגובת amplitud maximum, שורטט עקומת התגובה למינון באמצעות משוואת היל (hill equation). תוצאות אלה מספקות מידע על תכונות הקידוד של כל OSN, הכוללות את סף הגילוי, הממדי הזמני, הטווח הדינמי ורמת הרוויה.לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את חלק הדיסקציה של טכניקה זו בתוך 10 עד 15 דקות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לחקור תכונות פונקציונליות של נוירונים תחושתיים ריחניים המבטאים רספטורים ריחניים מוגדרים בעכברים.

perforated-patch-clamp-recording-mouse-olfactory-sensory-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

ההקלטה (EOG) electroolfactogram היא דרך אינפורמטיבי, קל לנהל, אמין להערכת תפקוד הריח ברמה של אפיתל הריח. פרוטוקול זה מתאר הגדרת הקלטה, רקמות העכבר הכנה, איסוף נתונים, ניתוח נתונים בסיסיים.

ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

נוירונים קולטניים ריח (ORNs) להמיר אותות ריח ראשון לתוך קולט נוכחיים מעורר בתור פוטנציאל פעולה שמועברים לנוירונים מסדר השנייה בנורת חוש הריח. כאן אנו מתארים את טכניקת יניקת פיפטה כדי להקליט את הקולטן odorant מושרה פוטנציאלי פעולה הנוכחי ומORNs העכבר בו זמנית.

תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה

סרטון זה מדגים הקלטה אלקטרופיזיולוגית של נוירונים חושי ריח (OSNs) בעכברים באמצעות טכניקת מהדק טלאי מחורר. אפיתל הריח, המכיל OSN עם קולטני ריח מתויגים פלואורופור, מבודד מעכבר ומאובטח בתא הקלטה. פיפטת הקלטה מהודקת לידית הדנדריטית של OSN, וניסטטין בתוך הפיפטה מנקב את הממברנה כדי ליצור קישוריות חשמלית עם התא. לבסוף, פיפטה נוספת משמשת להעברת ממריץ ריח, והפעילות האלקטרופיזיולוגית של התא המתוקן נרשמת.

רישום טלאי מהדק מחורר של נוירונים חושי ריח בעכברים

סרטון הפרוטוקול מתאר הקמת מהדק טלאי של תא שלם להקלטה אלקטרופיזיולוגית מנוירוני החישה של איבר הוומרונסאל (VNO) בעכברים. פרוסת VNO קורונלית עם נוירונים חושיים המסומנים באופן פלואורסצנטי ממוקמת במערך הקלטה. תא עצב מסומן מתוקן עם פיפטת הקלטה בתצורה של תא שלם לרישום אלקטרופיזיולוגי בתגובה לגירויים כימיים.

הקמת מהדק טלאי לכל התא להקלטה אלקטרופיזיולוגית מנוירונים חושיים Vomeronasal

אנחנו מדגימים וריאציות של טכניקה רבת יחידת ההקלטה התאית לאפיין תגובות ריח מעורר בשלושת השלבים הראשונים של מסלול ההרחה חסר חוליות. טכניקות אלה יכולים בקלות להיות מותאמות לבחינת פעילות הרכב במערכות עצביות אחרות גם כן.

שיטות הקלטה בעל מספר יחידות לאפיין את הפעילות עצבית בארבה (<em&gt; Schistocerca אמריקנה</em&gt;) מעגלי ריח

שיטה ידנית פירוק עצמות אפקטיבית להכין רקמות האף מאוס שלמות עם ארגון האנטומי משומר

ריסים של נוירונים חושי ריח מכילים חלבונים של מפל העברת האותות, אך ניתוח מרחבי מפורט של התפלגותם קשה בהקפאות. אנו מתארים כאן גישה אופטימלית לתיוג הר שלם והדמיה פנים של חלבונים ריסניים.

הר תיוג כל צילה במערכת חוש הריח העיקרית של עכברים

כאן, אנו מתארים גישה פיזיולוגית המאפשרת זיהוי וניתוח מעמיק של אוכלוסייה מוגדרת של נוירונים חושיים בפרוסות רקמה קורונלית חריפות של האיבר הוומרונזאלי של העכבר באמצעות רישומי מהדק טלאי של תא שלם.

מעמיק פיסיולוגי ניתוח של אוכלוסיות תאים מוגדרות ב אקוטי רקמות פרוסות של איברי עכבר vomeronasal

אפיון הפונקציה של קולטני odorant מגישה חלק חיוני בתהליך deorphanization. אנו מתארים שיטה למדוד את ההפעלה של רצפטורים odorant בזמן אמת באמצעות וזמינותו של המחנה.

לחיות תאים מדידה של Odorant קולטן הפעלה באמצעות Assay המחנה בזמן אמת

חוש הריח נוירונים חושיים מבטאים מגוון רחב של מולקולות מיון האקסון להקים מעגלים עצביים נאותים. פרוטוקול זה מתאר שיטת מכתים immunohistochemical לדמיין ביטויים קומבינטוריים של מולקולות מיון האקסון ב טרמיני האקסון של נוירונים חושית חוש הריח.

Quadunple Immunostaining של הנורה חוש הריח עבור ויזואליזציה של חוש הריח חושפת אקסון מולקולרית קודי זהות

חקור תכונות תפקודיות של נוירונים סנסוריים חוש הריח בעכברים באמצעות טכניקת perforated patch-clamp. השיטה מאפשרת מדידת תכונות ממברנה בתגובה לריחות ספציפיים וניתוח קולטני ריח מוגדרים.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה (וידאו) | JoVE Journal

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

גלה סרטונים נוספים