ניצול capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen לפיתוח גישות Adenovirus סרוטיפ 5-וקטורי חיסון

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנצל את אסטרטגיית שילוב כובעי האנטיגן לפיתוח גישות חיסון וקטוריות של אדנו-וירוס סרוטיפ חמש באמצעות וקטור אדנו-ויראלי דו-ערכי רקומביננטי כהוכחה עקרונית על ידי שימוש באסטרטגיית שילוב קפסיד אנטיגן, שלבי שיבוט מרובים משמשים לבניית הפלסמיד המותאם, A D חמש R אחד K-W-S-H-V-R חמש שריקות. לאחר מכן, הווקטור הנגיפי הדו-ערכי אדניל. R one K היה HVR חמש.

ההיס ניצל, מופץ ומטוהר. לאחר מכן מאופיינים הטיטר הנגיפי והתצוגה האנטיגנית של אנטיגנים משולבים על הקפסיד הנגיפי. לבסוף, הפוטנציאל של הווקטור הנגיפי Divalent Aden לעקוף את הנטרול על ידי סרום D חמש חיובי מוערך על ידי שימוש באסטרטגיית שילוב קפסיד אנטיגן.

שלבי שיבוט מרובים משמשים לבניית הפלסמיד שהשתנה, A D חמש R אחד K-W-A-S-H-V-R חמש שריקות. היום נדגים את אסטרטגיית שילוב קפסיד האנטיגן. אסטרטגיה זו מועילה בהשוואה לאסטרטגיות אחרות כגון שיטת ביטוי הטרנסגנים מכיוון שהיא לא רק מציגה את האנטיגן המעניין על האדנווירוס השבוי כחלבון, אלא היא מאפשרת תגובה הומורלית חזקה כנגד אנטיגן זה.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד שלבים הנוגעים ליצירת אדנו-וירוס משנה הכובע מכיוון שמשתנים רבים תורמים להתפתחות הווקטורים הוויראליים המומלצים, כגון בחירת אנזימי ההגבלה, עדשת האנרגיה המעניינת באחרים מדגימים את ההליכים. היום יהיו שני הפוסט-דוקטורנטים שלי, ד"ר לין לין גו וד"ר ניטרה פארו. גם אלכסנדר קרן, עמית מחקר במעבדה כדי לבנות את הפלסמיד של המעבורת, הוסף שש יחידות כל אחת של GE אחד ו-CCC אחד עד שישה מיקרוגרם של HVR שבר KWA אחד.

דגרו על תגובת העיכול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. פתרו את מקטע העיכול בג'ל אגרוס 2% על ידי אלקטרופורזה והשתמשו בערכת מיצוי ג'ל DNA על פי פרוטוקול היצרן כדי לטהר את השבר. לאחר מכן, חבר 12 ננוגרם מהשבר המטוהר לתוך אתרי G one ו-ACC one של 100 ננוגרם של פלסמיד המעבורת שנבנה בעבר.

HVR חמש לחישה שש pH חמש שניות ונפח תגובה של 10 מיקרוליטר בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של תגובת הקשירה ל -50 מיקרוליטר של DH בעל יכולת אלקטרו חמישה תאי אלפא, אלקטרו שמונה לפני הוספת 950 מיקרוליטר של מדיום SOC. דגרו על התאים שעברו טרנספורמציה ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד למשך שעה אחת לפני פיזור 100 עד 200 מיקרוליטר מהתרבית על צלחת LB CANY.

דגירה למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. השתמש בשש יחידות כל אחת של Echo R one ו-PME one כדי לעכל שישה מיקרוגרם של פלסמיד המעבורת המטוהר ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר טיהור השבר המכיל זרועות רקומבינציה הומולוגיות וגן האקסון הכפול השונה חמש משתמשים ב-SUA אחד כדי ליניאריזציה של פלסמיד עמוד השדרה, PAD חמש, דלתא H חמש לביצוע רקומבינציה הומולוגית.

השתמש באלקטרופורציה כדי להפוך 100 ננוגרם כל אחד משבר המעבורת המטוהר ואת פלסמיד עמוד השדרה ל-50 מיקרוליטר של תאים BJ 5 180 3 מוכשרים אלקטרו. כפי שהודגם מוקדם יותר בסרטון זה למחרת, בחרו כ-10 מושבות לשלושה מיליליטר של LB נוזלי המכיל מיצין וגדלו למשך הלילה לפני ההקרנה על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן הפוך 100 ננוגרם של פלסמיד מטוהר לחמישה תאי אלפא DH כפי שהודגם בעבר כדי להציל את הווקטור הנגיפי הנוסף.

התחל בשימוש ב-PAC one כדי ליניאריזציה של 15 מיקרוליטר של הווקטור בנפח של 100 מיקרוליטר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות לאחר העיכול. כדי לחלץ את הפלסמיד הליניארי מתחת למכסה אדים.

הוסף נפח שווה של פנול כלורופורם, אלכוהול איזואמיל לצנטריפוגת התגובה ב-10,000 גרם למשך דקה אחת ואסוף סופרנטנט לפני שתחזור על המיצוי ותסובב לנפח המופק. הוסף 300 מיקרוליטר של 100% אתנול ו -10 מיקרוליטר ספין אצטט ב -10, 000 גרם למשך 10 דקות. לאחר מכן, לאחר השלכת הסופרנטנט, הוסיפו 700 מיקרוליטר של 70% אתנול לפני שמסתובבים שוב.

לאחר השעיית הגלולה מחדש וכימות ה-DNA, העבירו שלושה מיקרוגרם של הפלסמיד הליניארי יחד עם מגיב טרנספקציה ליפוזומלי מסחרי לבקבוק T 25 שהוכן בעבר של 80% תאי HEK 2 93 בהתאם להוראות היצרן. לאחר הדגירה של שש שעות, החלף את מדיום הטרנספקציה במדיום שלם לפני החזרת הבקבוק לחממה. כאשר פלאק מפתח אפקט ציטופתי מלא או CPE מתחת למכסה מנוע סטרילי, מגרדים את התאים הנותרים מהבקבוק וצנטריפוגה את התרבית ב-300 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן השתמש במיליליטר אחד של מדיום המכיל 2% FBS כדי להשעות מחדש את כדור התא. לאחר מכן, שברו את התאים על ידי ביצוע ארבעה סבבים של הפשרת הקפאה, ואז צנטריפוגה את הליזאט בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אסוף את הסופרנטנט S המכיל את הנגיף שניצל כדי להפיץ את הווקטור הנגיפי בתרבית בקנה מידה גדול.

שליש לכל הליזאט הנגיפי מבקבוק T 25 לבקבוק T 75 המכיל תאי HEK 2 93. לאחר מתן אפשרות ל-CPE מלא להתפתח וקצירת ה-supinate כפי שהודגם קודם לכן, יש להפיץ מחצית מכל הנגיף באחד או יותר. צלוחיות T 1 75 של תאי HK 2 93 מפיצות את הנגיף שבודד מבקבוקי T 1 75 בתריסר או יותר.

T 1 75 צלוחיות תאים לאחר הכנת נקודה אחת 33 גרם למיליליטר ו -1.45 גרם למיליליטר. תמיסות צזיום כלוריד מוסיפות ארבעה מיליליטר, 1.33 גרם למיליליטר, צזיום כלוריד לצינור אולטרה-צנטריפוגה ומוסיפות ארבעה מיליליטר, 1.45 גרם למיליליטר, צזיום כלוריד על תחתית אותו צינור. הוסף ארבעה מיליליטר ליזאט ויראלי לחלק העליון של אותו צינור, ואז צנטריפוגה את הצינור ב -110, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות.

זה יפריד את רצועת הנגיף התחתונה הבוגרת מרצועת הנגיף הגבוהה הפגומה מתחת למכסה המנוע. השתמש במחט בגודל 33 המחוברת למזרק של שלושה מיליליטר כדי לאסוף את הרצועה התחתונה. לאחר מכן השתמש בחמישה היפים כדי להביא את התמיסה עד ארבעה מיליליטר.

לאחר מכן, לאחר הכנת שני שיפועי צזיום כלוריד נוספים, העמיסו את הנגיף המדולל מלמעלה וצנטריפוגות את השיפועים ב-110, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. מתחת למכסה המנוע. אסוף את הרצועה הוויראלית כפי שהודגם זה עתה.

לאחר מכן השתמש במחט בגודל 33 ובמזרק של שלושה מיליליטר כדי להזריק את תמיסת הנגיף לקלטת דיאליזה. הנח קלטת ב-700 מיליליטר של מאגר דיאליזה אחד x שהוכן על פי פרוטוקול הטקסט, והחליף את המאגר ארבע פעמים כל שלוש שעות. ואז באמצעות מחט ומזרק.

אסוף את התמיסה הנגיפית מהקסטה כדי לקבוע את הטיטר הפיזי הנגיפי. השתמש במאגר ליזה של וירוסים כדי לדלל הן את הנגיף והן את מאגר הדיאליזה המשמש כבקרת רקע ב-1 עד 10 ו-1 עד 20 ולדגור את כל הצינורות ב-56 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הפעל פוטומטר ביולוגי והגדר את מצב הספיגה לצפיפות אופטית של 260 ננומטר.

השתמש במאגר הדיאליזה המדולל ל-1 עד 10 כדי לאזן את אות הרקע על ידי לחיצה על הלחצן הריק. הקלד 10 ועוד 90 במסך הפוטומטר הביולוגי. החלף את הצינור בצינור של וירוס מדולל ל-1 עד 10 וקרא את האות של הנגיף המדולל ל-1 עד 10.

כדי למדוד את הדילול של 1 עד 20, השתמש במאגר הדיאליזה המדולל ל-1 עד 20 כדי לאזן את הרקע הקלדת 5 ועוד 95 על המסך לפני החלפת צינור החיץ בצינור וירוס מדולל אחד עד 20 וקריאת האות. הכפילו את שני מספרי קריאת הנגיף ב-1.1 כפול 10 ל-12 וחשבו את הטיטר הממוצע ביחידות VP למיליליטר בהתבסס על שני הטיטרים הבודדים משני הדילו. העריכו את הנגיף בעכברים על פי פרוטוקול הטקסט כדי להדגים אם הנגיף שניצל מציג את האנטיגן האנטיגני של HIV ותג היסט על פני הקפסיד הנגיפי.

חלבון עיקרי הון חמש. אלייזה בוצעה עם הנוגדן החד-שבטי האנושי שני F 5 והנוגדן החד-שבטי של העכבר בהתאמה כפי שמוצג כאן, גם הנוגדן האנושי F 5 וגם הנוגדן נגד ה-hiss של העכבר הקשורים לדו-ערכי מוסיפים חמישה חלקיק נגיף, בעוד שלא הייתה קשירה לבקרה השלילית. נעשה שימוש בניתוח דם מערבי של חמישה וקטור כדי לאשר את נתוני ה-E iza שכן גם נוגדן שני F חמישה אנושי וגם נוגדן נגד שריקה של עכבר זיהו רצועות ספציפיות בסביבות 117 קילודלטון בלבד.

ב-DIVALENT הוסף חמישה נגיפים, המקבילים לגודל של Heon חמישה חלבונים. כדי להעריך את הפוטנציאל של נגיף ה-Add Five שנבנה לעקוף את הנטרול על ידי הוספת חמישה חיוביים, בוצעה בדיקת נטרול. התוצאות מראות כי יחידות זוהרות יחסיות או rlu היו גבוהות פי 12 כאשר קבוצת הביקורת Add Five Vector טופלה ללא הוספת חמישה חיוביים בסרום מאשר כאשר היא טופלה בסרום, מה שמרמז על כך שהנגיף נוטרל.

לעומת זאת, היה הבדל קטן בשימוש ב-R עבור נגיף AD 5 הדו-ערכי המובנה בין דגימות שטופלו ולא טופלו, מה שמרמז על כך שהנגיף הבנוי חמק מנטרול. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לך הבנה טובה יותר של גישת שילוב קפסיד אנטיגן לפיתוח חיסון להוספת חמישה וקטורים. נכון לעכשיו, אנו משתמשים באסטרטגיה זו בשילוב עם וקטורים סרוטיפיים נדירים.

אתה יכול לעשות זאת גם כן.