שיטות לExplants רקמות Culturing עצם ירך האדם ללמוד התיישבות תאי סרטן השד גרורתי של הנישה

מטרת הליך זה היא לחקור ת proliferation, התנחלות (colonization) ונדירה של תאי סרטן השד במערכת מודל של נתח רקמת עצם אנושית. הדבר משיג על ידי בידוד חלקיקי רקמת עצם טרבקולרית מדגימות כירורגיות של ראש הפמור ותרבותם יחד עם תאי סרטן השד המבטאים לוסיפראז וחלבון פלואורסצנטי ירוק. דימוי ביו-לומינסנציה משמש למדידת ה-proliferation של התאים ולאישור ההתנחלות של תאי סרטן השד בחלקיקי רקמת העצם.

דפוסי התנחלות של תאי סרטן השד נסרקים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. ניתן לשטוף את מדור מחול השתבץ מהרסיסים לצורך ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה, בדיקות לומינסצנציה וצביעה. נדידה של תאי סרטן השד לעבר תרביות רקמה, תעלילים ורסיסי רקמת עצם נמדדת במסבבי נדידה מסוג Transwell עם דימוי ביולומינסצנטי. העצם היא האתר השכיח ביותר לגרורות של סרטן השד, ובסופו של דבר, מודל זה מספק חלון חדש לחקר תאי סרטן השד בתוך הנישה הגרורתית של העצם.

יתרון משמעותי של מודל זה הוא שהוא מספק גישה ישירה למיקרו-סביבה של מקטעי רקמת עצם אנושית, מה שמאפשר לנו לצפות ולנתח בקלות את התנהגות תאי סרטן השד במהלך ניסויי תרבית משותפת (co culture) לטווח קצר. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור שאלות מפתח לגבי המנגנונים העומדים בבסיס גרורות של סרטן השד לעצם, במטרה לזהות אסטרטגיות טיפוליות למניעה ולטיפול יעילים. למרות שמודל זה יכול לספק תובנות לגבי גרורות של סרטן השד, ניתן להשתמש בו גם כדי לחקור גידולים ממאירים אחרים הנוטים להתפשט לעצם, כגון סרטן前ערבון (prostate cancer).

יש לאסוף מקטעי רקמת עצם בנקודות שונות בכל בדיקה. תהליך זה מתחיל באיסוף והובלה של דגימת עצם ירך (femur) בתוך תמיסת סליין, והכנת תחנת העבודה בתוך מabilis בטיחות ביולוגית תוך כדי חבישת כפפה כירורגית. אחוזו את ראש עצם הירך ביד אחת והשתמשו במגלח כירורגי כדי לחלץ עצם טרבנכולרית.

השברים הם בגודל של כ-שניים עד חמישה מילימטרים. פינצטה לא תהיה יעילה בשלב זה. יש להשתמש במכשיר כריתה כירורגי באיכות גבוהה.

עבור ניסוי זה, הכין תרחיף תאי סרטן שד בריכוז של 100,000 תאים ל-50 µL של DMEM בתוספת 10% FBS. בנוסף, הכן רכיבי שעוות עצם לנייד של רגמני העצם באמצעות קצוות חתוכים של טיפ מיקרופיפטה, ואחסן את הרכיבים בצלחת פטרי. לאחר מכן, העבר בעזרת פינצטה את הרכיבים לפלטה בעלת שישה בארות, ובעזרת כפפה סטרילית, לחץ את הרכיבים למיקום של השעה 12.

בשלב הבא, העבירו בפיפט 50 µL מהתליה התאית למרכז כל באר. הכניסו את הפלטה לאינקובטור לתרביות רקמה למשך 45 דקות כדי לעודד היצמדות של התאים. בזמן שהפלטה דוגרת, הוציאו את שברי העצם עם התאים ההצמודים לפלטה. הניחו שבר רקמת עצם על שעוות העצם בשלוש בארים והדקו כל אחד מהם באמצעות GER. שלוש הבאריים ללא שברים ישמשו כביקרות.

בשלב הבא, הוסיפו באיטיות חמישה מיליליטרים של DMEM בתוספת 10% FBS לדופן של כל באר. יש להקפיד ששעוות העצם ושברי העצם לא יזוזו ממקומם. לאחר מכן, דגרו את התרבית למשך 20 עד 24 שעות.

למחרת, בצע תחילה דימות של התאים. הוסף 300 micrograms per milliliter של Lucifer לכל באר, ולאחר מכן דמט מיד את הפלטה באמצעות פלטפורמת דימות Ivis. ניסוי זה דורש תרחיף תאי סרטן שד, בדומה לניסוי הקודם.

לאחר הוצאת רסיסי העצם, השתמשו בפינצטה כדי להעביר כל רסיס לבאר ריקה בלוחית 24 בארות, לאחר מכן טפטפו 50 µL של תרחיף תאים ישירות על כל רסיס עצם, והעבירו את הלוחית למדגרה למשך 45 דקות כדי לעודד היצמדות של התאים. לאחר שהתאים נצמדו, הוסיפו בעדינות 1 עד 2 mL של מצע לכל באר, בכמות מספיקה כדי לשקוע את רסיס העצם. לאחר מכן, הניחו את הלוחית במדגרה לתרביות רקמה למשך 20 עד 24 שעות.

כהכנה לדימוי Ivis, דימוי פלואורסצנציה או איסוף תאי מחיתיים לצורך ניתוח לדימויי Ivis, העבירו את רסיסי העצם לפלטה בעלת 24 בארות עם 1 ml של מצע טרי לכל בארה. הוסיפו 300 µg/mL של Lucifer לכל בארה והמשיכו כפי שתואר בעבר עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. טפטפו 5 µL של תמיסת סימון ביספוספואט פלואורסצנטית לכל בארה כדי לסמן את הספיקולות הגומיות של רסיס העצם והדגרירו את הפלטה למשך 24 שעות נוספות.

לאחר 24 שעות, השתמשו בפינצטה כדי להעביר את השברים לצלחות המכילות מצע ללא phenol red. לאחר מכן, בחנו את הצלחות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה המוגדר לדוגם באורך גל של 485 nanometers כדי לאתר מושבות של תאי סרטן שד המבטאים GFP, ובאורך גל של 680 nanometers כדי לזהות ספיקולות עצם המסומנות בביספוספטים. שטפו את תא מוח העצם לצורך ניתוח של מספר התאים או תכונותיהם.

העבירו פסיפס (fragment) למסנן של 70 מיקרון מעל מבחנה מסוג chronicle בנפח 50 מיליליטר. לאחר מכן, השתמשו במזרק של 10 מיליליטר עם מחט בכילובר 25 כדי לשטוף בעוצמה את הפסיפס עם 10 מיליליטר של PBS. סבבו את התמיה בצנטריפוגה ב-300 G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשקיע את התאים; שאבו והשליכו את הנוזל העליון (supernatant).

שוטפו (Resuspend) את משקע תאי המחול ב-PBS או בתמיסות רצויות אחרות בהתאם לבדיקות ציטומטריה של זרימה או בדיקות חיוניות. התחילו ביצירת רשת רקמת עצם. הניחו את שברי העצם לתוך בארי של פלטת 12.

לוחית בארות המכילה 2.2 milliliters של DMEM 10%FBS לכל בארה, כאשר חלק מהבארות ישאירו כביקורת ללא שברי עצם. דגרו את הלוחית למשך 24 שעות. לאחר מכן, שאבו והחליפו את המצע והמשיכו בגידול למשך 24 שעות נוספות. לאחר 48 שעות מתחילת הגידול, העבירו 0.9 milliliters של הנוזל העליון (supinate) ללוחית קולט, תוך כדי דגירה זמנית של לוחית הקולט.

הניחו רכיבי transwell לתוך פלטה ריקה בעלת 24 בארות. לאחר מכן, זרקו 100,000 תאי סרטן שד ב-350 µL לתוך כל רכיב. לאחר מכן, דגרו את הפלטות למשך 45 דקות כדי לעודד היצמדות של התאים. לאחר 45 דקות, השתמשו בפינצטה כדי להעביר את רכיבי ה-transwell לפלטת קיבול.

יש להטות את המכניסים (inserts) בעת הצבתם לתוך המקלט. בצעו סופינציה (supinate) כדי למנוע היווצרות בועות. לאחר מכן, דגרו את הפלטה עם המכניסים למשך 20 שעות בטמפרטורה של 37 °C למחרת.

השתמשו בפינצטה כדי להוציא את הרכיבים המוכנסים (inserts) והוסיפו לכל אחד מהם 300 micrograms per milliliter של Lucifer. בצעו דימות ביו-לומינסנציה (bioluminescence imaging) בלוח המקלט כדי לזהות תאי סרטן השד שנדדרו דרך הממברנות ונצמדו לתחתית בארות לוח המקלט. ראשית, טענו לוח מקלט עם מצע והניחו אותו באינקובטור לתרביית רקמות.

לזריעת התאים במכמירים. הפכו אותם בתוך קופסה של מבחנות מיקרו-פיוזד עם מכסה. לאחר מכן, הוסיפו 100,000 תאים ב-50 µL למשטח התחתון החיצוני של ממברנת כל מכמיר.

כסו את הקופסה תוך השארת המכסה מרווח מעט, והדגירו את התבתים למשך 45 דקות באינקובטור לתרביית רקמות. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להפוך ולהעביר את התבתים לבארות של פלטת קליטה, כאשר בכל כוס של תבת יש 0.45 milliliters של DMEM עם 10% FBS. לאחר מכן, הוסיפו לכל תבת שבר עצם בגודל שלושה מילימטרים או חרוז זכוכית, והחזירו לפלטה למשך 20 שעות.

ביום למחרת השתמשו בפינצטה כדי להעביר את השברים והחרוזים לפלטה עם בארות המכילות מיליליטר של מצע טרי. הוסיפו 300 micrograms per milliliter של Lucifer לכל בארה והמשיכו לדימוי ביו-לומינסנציה. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

תאי סרטן השד גודלו בתרבית משותפת בסמיכות לרסיסי עצם מקובעים כדי למדוד את השגשוג של תאי השד. הדמיית ביו-לומינסנציה לאחר 24 שעות של תרבית הראתה שגשוג מוגבר של תאי סרטן השד בנוכחות רסיסי עצם בשלושת הבארים העליונים, בהשוואה להיעדר רסיסי עצם בשלושת הבארים התחתונים. תוצאות הניסויים שנעשו עם רסיסים משלוש דגימות כירורגיות נפרדות הראו שגשוג מוגבר בנוכחות עצם לעומת היעדרה.

בכל שלושת המקרים, נצפתה התיישבות של תאי MCF 7 Luke EGFP שהוצבו ישירות תחת מקטעי רקמת עצם, באמצעות דימוי ביולומינצנציה לאחר 24 שעות. אות חלש יותר היה קשור לצפיפות זריעה נמוכה יותר לאחר 48 שעות. מקטעים שנזרעו ישירות וסומנו באמצעות ריאגנט ביספוספונט חשפו התיישבות של תאי סרטן השד החיוביים ל-GFP בתוך המדורים המינרליים ומדוברי המח).p>

נדידה של תאי סרטן השד דרך קרום הנדידה נקבובי לעבר תרבית רקמת עצם; נדידה חזקה נצפתה בתשלומי העל בשלושת הבארים העליונים בהשוון לנקרים של ביקורת. מצע נצפה בשלושת הבארים התחתונים. כמו כן נצפתה נדידה לשלושה שברי עצם מדגימת THR נתונה, בעוד שלא נצפתה נדידה אל החרוזיקים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיקe רגמנים של רקמת עצם אנושית מדגימה של ראש הפמור ולהחדירם לבדיקות של תרבית משולבת (co-culture) למדידת התנהגויות של תאי סרטן השד, כולל נדידה, התיישבות ושגשוג.