ניתוח electroretinogram של התגובה החזותית בדג הזברה זחלים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להמחיש את השלבים הדרושים לביצוע ניתוח אלקטרוגרפי על דגי זברה זחלים. זה מושג על ידי יצירת מיקרו פיפטות זכוכית בעלות צורה וגודל מתאימים. השלב השני הוא התקנה קפדנית של ציוד קריטי לניסוי, כגון אלקטרודות ייחוס והקלטה.

לאחר מכן, דג הזברה הזחל מורדם ומכוון כראוי ביחס לציוד הגירוי וההקלטה. השלב האחרון הוא מיקום נכון של מיקרו אלקטרודת הזכוכית על הקרנית של דג הזברה הזחל. בסופו של דבר דגי זברה זחלים.

ניתוח ERG שימושי לחקירת תפקוד הראייה של החרוט ברשתית כל החולייתנים החרוטיים in vivo. שיטה זו שימושית מאוד למענה על שאלות מפתח בתחום מדעי הראייה, כגון זיהוי מסלולי איתות התורמים לרגישות חזותית והסתגלות לאור בקונוסים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את המיקום הנכון של מיקרו אלקטרודת ההקלטה על הדגימה בשל גודלה הקטן של עין דג הזברה של הזחל.

כדי להתחיל בהליך זה, משוך מספר מיקרו פיפטות באמצעות נימי זכוכית בורו סיליקט מלוטשים באש עם נימה. בדוק כל מיקרו פיפטה תחת מיקרוסקופ עם סרגל גראד מתאים כדי לוודא שקוטר הקצוות הוא 10 עד 15 מיקרומטר ואפילו במראה. צור פתרון עובד ביום הניסוי על ידי דילול תמיסת צלצול של 10 x ל-x אחד.

בעזרת מסנן מים מזוקקים נטול יונים, עקר את התמיסה כדי להבטיח שחלקיקים לא יחסמו את קצה המיקרו פיפטה. לאחר מכן מחומצן עם 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני למשך 10 דקות. כסו את התמיסה בחוזקה לאחר מכן כדי להבטיח שהתמיסה תישאר מחומצנת.

כעת הניחו פלטפורמת פלסטיק ניתנת להזזה עם תחתית בולמת זעזועים פולימר אורטן ויסקו-אלסטי על השולחן נגד רעידות מתחת למקור האור. לאחר מכן, מקם את המצלמה עם מעמד ממוגנט וכוון אותה אל פלטפורמת הפלסטיק הניתנת להזזה. לאחר מכן מקם את המניפולטור המיקרו של מיקרו אלקטרודת ההקלטה על מעמד ממוגנט שני.

ודא שהמצלמה והמיקרו מניפולטור אינם מופרעים מתנועה של ציוד אחר, ואינם חוסמים את התאורה ממקור האור. לאחר מכן, חבר את המצלמה לצג וידאו ומקם אותה לכיוון הפלטפורמה. ודא שההתקנה מוארקת כהלכה עם חוט נחושת.

בשלב זה, חותכים מלבן קטן של ספוג PVA יבש שישתלב היטב בצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר עם סכין גילוח נקי. בצע חתך נוסף בספוג כדי להכיל את אלקטרודת הייחוס. לאחר מכן השתמש בטוש עמיד לכימיקלים כדי לסמן A.נקודה קטנה על הספוג שבו יונח הזחל.

לאחר מכן, יש להשרות את ספוג ה- PVA בתמיסת צלצול עד לרוויה. מוציאים ומנגבים אותו במהירות על מגבת נייר פעמיים-שלוש לפני שמניחים אותו בצלחת פטרי נקייה של 35 מילימטר. לאחר מכן, מקם את צלחת הפטרי המכילה את הספוג על משטח פלסטיק כך שהמצלמה תוכל לדמיין את הסימן.

לאחר מכן, כלוריד את האלקטרודות על ידי השרייתן בשישה עד 9% נתרן כלורי. לאחר מכן יבש אותם באוויר על מגבון קים למשך חמש דקות. הנח את גלולת כלוריד הכסף והכסף של אלקטרודת הייחוס לתוך הספוג או מתחתיו, בהתאם לסגנון החיתוך שנעשה, והצמד את כבל אלקטרודת הייחוס למערכת ההקלטה.

לאחר מכן, חבר כ -40 סנטימטרים של צינורות למזרק נעילה ללא פיתוי של חמישה מיליליטר ומלא את המזרק בתמיסת צלצול. לאחר מכן, מלאו מזרק נעילה ללא פיתוי של מיליליטר אחד בתמיסת צלצול. בעזרת מיקרופיל, מלאו בזהירות את מחזיק המיקרו אלקטרודה ומנעו היווצרות בועות.

לאחר מכן חבר את המזרק של חמישה מיליליטר ליציאת הלחץ של מחזיק המיקרו אלקטרודה עם צינורות באמצעות המיקרו-מילוי ומזרק מיליליטר אחד מלא בתמיסת צלצול. מלאו את המיקרו פיפטה מזכוכית מהקצה וודאו שאין בועות. לאחר מכן, חבר את המיקרו פיפטה מזכוכית למחזיק המיקרו אלקטרודה והקפד לשמור על חוט האלקטרודה ישר.

לאחר האבטחה, השתמש במזרק של חמישה מיליליטר כדי לאלץ בזהירות את תמיסת הצלצול דרך המיקרו אלקטרודה עד שכמות זעירה של תמיסה נראית בקצה. כעת הנח בזהירות את מיקרו אלקטרודת ההקלטה במניפולטור המיקרו והצמד את הכבל למערכת ההקלטה כדי לבדוק אם יש רעשי מערכת. הנח את אלקטרודת הייחוס ואת קצה המיקרו אלקטרודה המקליטה בצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר מלאה בתמיסת צלצול.

בדוק את רמות הרעש החשמלי של ההתקנה באמצעות אוסצילוסקופ או תכונה מובנית של מכשיר ה-ERG. רמות הרעש צריכות להיות לא יותר מ פלוס מינוס 10 מיקרו וולט מקו הבסיס. בהליך זה, חותכים כמה ריבועי מגבת נייר של סנטימטר רבוע, מרדימים שלושה עד חמישה זחלים בצלחת פטרי של 35 מילימטר על ידי הוספת טריקה לריכוז סופי של 0.02% והמתנה של דקה עד שתיים.

לאחר מכן, העבירו בזהירות זחל בודד לריבוע מגבת נייר מתחת לסטריאוסקופ מנתח עם תאורה מינימלית. בדוק את מיקום הזחלים שבוחרים מועמד שנמצא בצד הגב כלפי מעלה עם עין חסומה להקלטה של מפגשי הקלטה שנמשכים יותר מ-30 דקות. שמור על לחות הזחל על ידי זיגוג הגוף עם 3% מתיל צלולוז באמצעות מברשת שיער גמל עדינה.

לאחר מכן העבירו את ריבוע מגבת הנייר עם הזחל לספוג ה- PVA הלח. לאחר מכן, יש למרוח זרם רציף של מים רוויים ב-100% חמצן על הזחלים על ידי בעבוע הגז דרך אבן אוויר בבקבוק זרוע צד המכיל מים מזוקקים. מקם את החמצן הלח מזרוע הצד של הבקבוק ליד ראש הזחל עם צינורות בתאורה מינימלית.

השתמש במניפולטור המיקרו ובמצלמה כדי למקם את קצה המיקרו אלקטרודה בנקודת האמצע בין קצות האף והפינוק של העין ולחץ בעדינות על הגבול הגבי של הקרנית. אפשר לזחלים להסתגל לחושך למשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן רשום את תגובות הבזק הבדיקה לאור המסופק ממקור אור LED או ממריץ אופטי.

איור זה מציג רישום ERG טיפוסי בדג זברה של חמישה DPF. הדגים המותאמים לחושך נחשפו לאור LED לבן למשך 20 אלפיות השנייה בעוצמות שנעו בין 1 ל-5,000 צינורית למטר רבוע עם תחילת גירוי האור באפס שניות. קשה להבחין בפוטנציאל השלילי גל, בעוד שגל B הפוטנציאלי החיובי הוא השיא הדומיננטי של צורת הגל.

שיבוץ זה מציג את אמפליטודות תגובת גל B הממוצעות שהותאמו באמצעות המשוואה של NACA Rushed. איור זה מציג הקלטה טיפוסית של ERG בדגי זברה של חמישה זחלי DPF מותאמים כהים שטופלו ב-PB. הדגים נחשפים לאור לבן LED למשך 20 אלפיות השנייה בעוצמות הנעות בין 1 ל-5,000 צינורית למ"ר, ופוטנציאל קולטן מסת החרוט המבודד הוא האלמנט הדומיננטי בצורת הגל. שיבוץ זה מציג את אמפליטודות התגובה הממוצעות של דג זברה זחל שטופל ב-PB שהוכשר באמצעות ה-NACA Rushed במשוואה.

איור זה מציג רישום ERG טיפוסי בחמישה דגי זברה שטופלו ב-D-P-F-A-P-B. שימוש בפרדיגמת הבזק כפול. הדגים המותאמים לחושך נחשפים לאור לבן של 20 אלפיות השנייה.

LED מהבהב בעוצמה של 1000 צינורית למ"ר, וה-ISI בין ההבזקים הוא שתי שניות. תחילתו של כל גירוי אור מצוינת כאן. איור זה מציג את היחס בין התגובה הפוטנציאלית המקסימלית של קולטן מסת החרוט המבודד של הגירוי השני לזה של הגירוי הראשוני עם הגדלת ISI, מה שמעיד על התאוששות מתקדמת של רגישות קולטני האור.

בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור שאיכות ההקלטות מוכתבת על ידי שלמות חיבור הקרנית האלקטרודה ובריאות הזחלים. פיתוח טכניקה זו שיפר מאוד את יכולתם של חוקרים במדעי הראייה לחקור הסתגלות והתאוששות של חרוט ברשתית החולייתנים in vivo.