Name: ניתוח electroretinogram של התגובה החזותית בדג הזברה זחלים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: למדו לבצע ניתוח אלקטרורטינוגרפי בזחלי דג הזברה כדי להעריך תפקוד ראייה חי. שיטה זו מאפשרת למדענים לחקור תפקוד קונים ברשתית בעלת חיים בצורה יעילה ומהימנה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מתקן החקלאות הימית של דג הזברה של UNC על תחזוקת דג הזברה. ברצוננו גם להודות ל-Diagnosys, LLC על הסיוע בהקמת מנגנון ה-ERG. תודה נוספת לד"ר פורשיה מקוי ולמעבדה של ד"ר בן פילפוט על הסיוע בשיטות אלקטרופיזיולוגיות. ברצוננו גם להודות לליזי גריפיתס על האיור שלה של דג זברה זחל. עבודה זו נתמכה על ידי פרסי המכונים הלאומיים לבריאות F32 EY022279 (ל-J.D.C) ו-R21 EY019758 (ל-E.R.W).

אחזקת בעלי חיים ופרוטוקולי ניסוי אושרו על ידי ועדות הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ&#39;אפל היל, ולעמוד בכל הדרישות של משרד NIH של בעלי חיים במעבדת רווחה והאגודה להערכה והסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים בינלאומיים. הערה: פרוטוקולים כדי להשיג זחלים לניתוח ERG, שפורסם לגידול דג הזברה סטנדרטי ותחזוקה הועסקו 18. זחלים שהושגו באמצעות רבייה טבעית, ושוכנו בשעה 14 מחזור אור / חושך 10 שעות. פרוטוקול זה כבר מותאם לזחלים ב5-7 ימים לאחר הפריה (DPF), אבל יכול להתבצע באופן אידיאלי על דגים מבוגרים עם שינויים קטנים להליך. כאן, להשתמש בלחץ TL של זחלי דג הזברה wild-type בשעה 5 DPF. 1. Micropipette הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך כמה micropipettes באמצעות 1.5 x 0.86 מ&quot;מ (קוטר חיצוני על ידי קוטר פנימי) נימי זכוכית בורוסיליקט אש מלוטשת עםחוט להט (טמפרטורת התכה, 821 ° C) וFlaming / בראון micropipette פולר P-97 מצויד בנימת חום תיבה. השתמש בתכנית לעיצוב micropipettes המתואר בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כל micropipette תחת מיקרוסקופ עם שליט graticule מתאים כדי להבטיח שטיפים הם 10-15 מיקרומטר בקוטר ויש לו טיפ פתיחה חלקה (כלומר, ללא קצוות משוננים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחסן בזהירות micropipettes כדי למנוע נזק קצה וחשיפה לאבק. אפשרויות אחסון כוללות צלחות פטרי עם מעבדה קלטת, קופסות מרופדות קצף, או מיכלי אחסון micropipette זמין מסחרי. ניתן להשתמש בנימי מושכי micropipette אחרים וזכוכית ארוכות כמו הקוטר הנכון של micropipette וקצה באיכות גבוהה מושגת: הערה. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לחץ </td><td> חום </td><td> משוך </td><td> Velocity </tד&gt; <td> זמן </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> טבלת 1: תכנית לייצור micropipettes באמצעות / micropipette פולר חום P-97 Flaming המצויד בנימת חום תיבת Micropipettes מבוצעים באמצעות 1.5 x 1.0 מ&quot;מ 2 (קוטר חיצוני על ידי קוטר פנימי) נימי זכוכית בורוסיליקט אש מלוטשת עם נימה. (טמפרטורת היתוך, C 821 °). 2. הצפת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מסונן, המאגר של רינגר דג זהב מחומצן 19 בנימי microelectrode וכדי להרוות את ספוג אלכוהול פוליוויניל (PVA) על שהזחלים ממוקמים לניסויים. לחלופין, השתמש ב- E3<html> תקשורת עובר או תמיסת מלח מאוזנת של האנק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 10x רינגר דג זהב כפי שמתואר בטבלה 2. התאימו לpH 7.8, ולעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן את המניה 10x על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור פתרון עבודה ביום של הניסוי על ידי דילול הפתרון של רינגר 10x ל1X עם מים ללא יונים, מזוקקים. לסנן באמצעות מערכת סינון 0.22 מיקרומטר. חמצן על ידי מבעבע עם 95% O גז 2 CO 2/5% במשך 10 דקות. כובע בחוזקה לאחר מכן על מנת להבטיח שהפתרון נותר מחומצן. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> NaCl </td><td> 1.25 M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 26 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 25 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 100 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; טבלה 2: הכנת פתרון 10x רינגר דג זהב. 3. electroretinogram פלטפורמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניסויי ERG על שולחן נגד רעידות בתוך כלוב פאראדיי כדי לשפר את יחס האות לרעש. צרף פלטפורמת פלדה מותאמת אישית לשולחן נגד הרעידות באמצעות אגוזי משושה. הנח פלטפורמת פלסטיק מטלטלין עם תחתית viscoelastic פולימר urethane הלם קליטה על השולחן מתחת למקור האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את המצלמה עם מעמד ממוגנט, שמטרה למטה בפלטפורמת פלסטיק מטלטלין. מקם את micromanipulator (אשר יחזיק microelectrode ההקלטה) עם מעמד ממוגנט שני מהימין לפלטפורמת פלסטיק מטלטלין. ודא שהמצלמה וmicromanipulator לא יופרעו על ידי התנועה של ציוד אחר ושהם לא לחסום תאורה ממקור האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המצלמה לצג וידאו ולמקם אותו כדי להציג את עינו שלזחל להצבת אלקטרודה במיקום הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שההגדרה היא מוארקת כראוי עם חוטי נחושת. כדי לבדוק את הרעש, למקם את האלקטרודה התייחסות וקצה microelectrode ההקלטה בגודל 35 מ&quot;מ צלחת פטרי מלא עם הפתרון של רינגר. בדוק את רמות הרעש החשמלית של ההתקנה עם אוסצילוסקופ או תכונה מובנית של מנגנון ERG. רמות רעש צריכה להיות לא יותר מ ± 10 μV מנקודת ההתחלה. </li></ol> 4. ספוג הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך מלבן קטן של ספוג PVA היבש שיתאים בנוחות בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ. העובי של הספוג לא צריך להיות גדול יותר מהעומק של המנה. השתמש בסכין יפני בסכין גילוח נקי לחיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך קיצוץ נוסף לתוך הספוג כדי להתאים את האלקטרודה ההתייחסות (או לחתוך רדוד לאורך בחלק התחתון של הספוג או פרפר לחתוך אנכי דרך אחד הקצוות הקטנים יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סמן עמיד כימיכדי לסמן נקודה קטנה על ספוג (שבו הזחל יוצב) שיכול לשמש למיצוב המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את ספוג PVA בפתרון של רינגר עד רווי. הסר ולמחוק במהירות על מגבת נייר 2-3 פעמים. מניחים את הספוג בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את צלחת פטרי המכילה את הספוג על פלטפורמת הפלסטיק כך שהסימן יכול להיות דמיין ידי המצלמה. </li></ol> 5. אלקטרודה הכנה הערה: התקנת דג הזברה מורכבת אלקטרודה התייחסות במגע עם ספוג רינגר-רווי פתרון PVA והאלקטרודה הקלטה במגע עם הקרנית. האלקטרודה ההתייחסות מורכבת מגלולת Ag / AgCl. האלקטרודה ההקלטה היא micropipette זכוכית משך מלא בפתרון של רינגר ומוחזק על ידי בעל microelectrode מכיל חוט Ag. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלוריד אלקטרודות ידי טבילתם ב6-9 hypochlorite נתרן% (אקונומיקה) במשך 5 דקות (MICR ההקלטהחוט oelectrode) או 15 דקות (האלקטרודה ההתייחסות). אוויר יבש על Kimwipe במשך 5 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לסגנון של חתך שנעשה בשלב 4.2, למקם את כדור Ag / AgCl של האלקטרודה ההתייחסות ל( לקיצוץ הפרפר האנכי) או מתחת (לחתך הרדוד לאורך בתחתית) את הספוג. צרף להוביל אלקטרודה התייחסות למערכת ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, אם יש לו את התקנת ERG אילוצי שטח או שיש חפצי פוטו חזקים במיוחד מן האלקטרודה Ag / AgCl, לחבר את האלקטרודה ההתייחסות לספוג באמצעות גשר מלח אגר להעביר את האלקטרודה מנתיב האור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף ~ 40 סנטימטרים של צינורות בגודל המתאים ל5 מיליליטר מזרק מנעול שאינו Luer. מלא את המזרק עם הפתרון של רינגר. בעלי microelectrode בעל יציאות לחץ בדרך כלל ספינה עם מתאמים כדי להתאים צינורות בקטרים ​​פנימיים של 1/16 &quot;, 3/32&quot;, 1/8 &quot;או 5/32&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שאינו Luer מזרק 1 מיליליטר מנעול עםהפתרון של רינגר ו, באמצעות מיקרו-fil, למלא בקפידה את בעל microelectrode. למנוע היווצרות של בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את מזרק 5 מיליליטר ליציאת הלחץ של בעל microelectrode עם צינורות ולהשתמש בו כדי להבטיח כי בעל microelectrode מלא של הפתרון של רינגר. השימוש במייקרו-fil ומזרק 1 מ&quot;ל מלא הפתרון של רינגר, למלא את כוס micropipette מהקצה ולהבטיח כי אין בועות נמצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף micropipette הזכוכית לבעל microelectrode, להיות זהיר, כדי לשמור על ישר חוט האלקטרודה. ברגע שהשיג, להשתמש במזרק 5 מיליליטר לכפות זהירות הפתרון של רינגר דרך microelectrode עד כמות זעירה של פתרון נראית לעין בקצה. יישום מזדמן של לחץ למזרק (כאשר לא חל על קרנית) ימנע היווצרות של בועות אוויר, כמו גם חסימות בשל אבק או הצטברות מלח, בקצה micropipette. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הפתרון יוצא כזרם, להחליף את gmicropipette ילדה, כפתיחת טיפ גדולה מדי או פגומה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות במקום microelectrode ההקלטה בmicromanipulator ולצרף את יתרון מערכת ההקלטה. </li></ol> 6. ניתוח electroretinogram הערה: עקב הדומיננטיות חרוט של רשתית הזחל, ניתן להשיג תוצאות ERG באיכות גבוהה כאשר הכנות להקלטה מתבצעות תחת רמות נמוכות של אור לבן עקיף (&lt;סוויטה דה לוקס 1) או לתקופות קצרות (&lt;1 דקות) בעוצמה גבוהה יותר ( ≤250 אור סוויטה דה לוקס) עובד. תקופה קצרה של הסתגלות כהה עדיין נדרשת לפני ההקלטה (ראה שלב 6.7). עם זאת, ניתן לבצע ניסויים באור אדום או באינפרא האדום עמום באמצעות מצלמת אינפרא אדום רגישה. כל הניסויים בוצעו במי מערכת עיקור מסנן (0.22 מיקרומטר) ממתקן UNC דג הזברה חקלאות המים אך יכול לשמש אמצעי תקשורת חלופי עובר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריבועי נייר מגבת לחתוך מדידה כ 12 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מדידת פוטנציאל קולט המוני קונוס מבודד, דגירה 3-5 זחלים במי מערכת עם 500 מיקרומטר (±) -2--4-phosphonobutyric חומצת אמינו (APB) במשך 5 דקות. הערה: בעוד APB הוא תערובת של רצמית הפעיל (L) וצורות לא פעילים (R) של AP4, זה יעיל כמו L-AP4 ופחות יקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי 3-5 זחלים במי מערכת עם 0.02% (w / v) Tricaine עד, כ 1-2 דקות להגיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במשאבת פיפטה ופיפטה פסטר להעביר בזהירות זחלים בודדים על ריבועי נייר מגבת תחת stereoscope לנתח באמצעות תאורה מינימאלית (≤250 סוויטה דה לוקס ל&lt; 1 דקות). בדוק את המיקום של כל זחל ולבחור מועמד שהוא למעלה בצד גב עם עין unoccluded. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקלטות ארוכות (&gt; 30 דקות), לשמור את הזחל לח על ידי זיגוג הגוף עד, אבל לא כולל את הראש עם methylcellulose 3% בעזרת מברשת משיער הגמל בסדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להעביר את squar מגבת ניירדואר עם הזחל לספוג PVA הלח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקלטות ארוכות (&gt; 30 דקות), יחול זרם רציף של O 100% רוויי מים 2 גז על הזחל ידי מבעבע הגז דרך airstone בבקבוק בצד זרוע המכיל מים מזוקקים. מקם את צינור יציאה בצד זרוע הבקבוק שמעביר את חמצן humidified ליד ראשו של הזחל. הערה: שלב 6.4.1 וצעד 6.5.1 יהיה להאריך את החיים של הדגים 16. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת תאורה מינימאלית, להשתמש micromanipulator ומצלמה לעמדת קצה microelectrode בנקודת האמצע בין האף וקצות הזנב של העין ולחץ בעדינות על גבול הגב של הקרנית. הערה: מיקום שגוי של קצה האלקטרודה לאזורים הרחוק הדיסטלי של הקרנית יכול לגרום לגל ERG של קוטביות הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר זחל אל dark-להסתגל למשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא תגובות הבזק מבחן לאור הניתן ממקור אור LED או ממריץ אופטי באמצעות avaiציוד גירוי והקלטת lable. להתאים את הפרמטרים פרוטוקול כגון עוצמת הבזק, אורך הבזק, הבזק צבע, עוצמת רקע והגדרות צבע ומסנן כדי להתאים את הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר סיימו עם הניסוי, להרדים זחלים על פי הנחיות AVMA / IACUC. </li></ol>

<ol><li>Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDowling%2C+JE+%22The+retina%3A+an+approachable+part+of+the+brain%22">The retina: an approachable part of the brain</a>. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1987).</li>
<li>Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inexpensive+device+for+non-invasive+electroretinography+in+small+aquatic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates.</a> J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).</li>
<li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).</li>
<li>Heckenlively, J. R., Arden, G. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeckenlively%2C+JR+%22Principles+and+Practice+of+Clinical+Electrophysiology+of+Vision%22">Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision</a>. , 2nd edn, The MIT Press. Cambridge, MA. (2006).</li>
<li>Perlman, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerlman%2C+I+%22Webvision%3A+The+Organization+of+the+Retina+and+Visual+System%22">Webvision: The Organization of the Retina and Visual System</a>. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. , (1995).</li>
<li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22ProgRetin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li>
<li>Doerre, G., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+photoreceptor+cell+development+in+the+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina.</a> Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+stimulates+a+transducin-independent+increase+of+cytoplasmic+Ca2%2B+and+suppression+of+current+in+cones+from+the+zebrafish+mutant+nof%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof.</a> J Neurosci. 23, 470-480 (2003).</li>
<li>Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cone-specific+kinase+GRK7+in+larval+zebrafish+leads+to+impaired+cone+response+recovery+and+delayed+dark+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation.</a> Neuron. 47, 231-242 (2005).</li>
<li>Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+visual+system+development%3A+more+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye.</a> Genes Dev. 21, 367-378 (2007).</li>
<li>Branchek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+photoreceptors+in+the+zebrafish%2C+brachydaniorerio.+II.+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function.</a> J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).</li>
<li>Schmitt, E. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+retinal+development+in+the+zebrafish%2C+Daniorerio%3A+light+and+electron+microscopic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses.</a> J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+contributions+to+the+electroretinogram+of+the+dark-adapted+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish.</a> Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).</li>
<li>Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+bipolar+cell+input+mechanisms+in+giant+danio%5BTitle%5D)+AND+%22I.+Electroretinographic+analysis.+J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio.</a> I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).</li>
<li>Nelson, R. F., Singla, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+model+for+signal+elements+isolated+from+zebrafish+photopicelectroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram.</a> Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).</li>
<li>Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EML1+%28CNG-modulin%29+controls+light+sensitivity+in+darkness+and+under+continuous+illumination+in+zebrafish+retinal+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors.</a> J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).</li>
<li>Gurevich, L., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+waveforms+of+the+ON+bipolar+neuron+and+the+b-wave+of+the+electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram.</a> Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Daniorerio%29%22">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio)</a>. , 5th edn, University of Oregon Press. Portland, OR. (2007).</li>
<li>Kim, D. Y., Jung, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+contributions+to+the+goldfish+electroretinogram+at+the+photopic+illumination+level%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+PhysiolPharmacol%22%5BJournal%5D)">Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level.</a> Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+retinal+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish retinal mutants.</a> Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).</li>
<li>Naka, K. I., Rushton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-potentials+from+colour+units+in+the+retina+of+fish+%28Cyprinidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae).</a> J Physiol. 185, 536-555 (1966).</li>
<li>Naka, K. I., Rushton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-potentials+from+luminosity+units+in+the+retina+of+fish+%28Cyprinidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae).</a> J Physiol. 185, 587-599 (1966).</li>
<li>Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+behavioral+screen+for+isolating+zebrafish+mutants+with+visual+system+defects%5BTitle%5D)+AND+%22ProcNatlAcadSci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects.</a> ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).</li>
<li>Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroretinogram+%28ERG%29+Measurements+in+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish.</a> CSH protocols. , (2008).</li>
<li>Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganzfeld+ERG+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Doc+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ganzfeld ERG in zebrafish larvae.</a> Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).</li>
<li>Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lazy+eyes+zebrafish+mutation+affects+M%C3%BCller+glial+cells%2C+compromising+photoreceptor+function+and+causing+partial+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness.</a> J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).</li>
<li>Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celsr3+is+required+for+normal+development+of+GABA+circuits+in+the+inner+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+genetics%22%5BJournal%5D)">Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina.</a> PLoS. genetics. 7, e1002239(2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בפרוטוקול זה הליך פשוט להקלטות ERG של דג הזברה זחל מפורט. הליך זה מאפשר לassay מהיר והמקיף של function.There החזותי מספר שלבים קריטיים בכל ההליך שצריך להיות כל הזמן בראש. זחלי דג הזברה צריכים להיות בריאים לפני הניסוי למניעת מוות בטיפולים תרופתיים פוטנציאליים ולהבטיח פרנסה ממושכת במהלך הקלטות ERG. בנוסף, חשוב שהזחלים מנוצלים בניסויים הם באופן הדוק באותו גיל. זאת בשל ההתפתחות המהירה של הרשתית (כלומר, פיתוח ההפרש של תת קונוס) וגם המורפולוגיה והפיסיולוגיה הכוללות של הזחלים. ל...

Electroretinogram (ERG) הוא שיטה לא פולשנית אלקטרו שכבר נעשה שימוש נרחב במרפאת לקביעת התפקוד של הרשתית בבני אדם. הפעילות החשמלית בתגובה לגירוי אור נמדדת על ידי הנחת אלקטרודות הקלטה על פני השטח החיצוניים של הקרנית. המאפיינים של הפרדיגמה הגירוי וצורת גל התגובה להגדיר את תאי העצב ברשתית תורמים לתגובה. שיטה זו הותאמה לשימוש עם מספר המודלים של בעלי חיים, כולל עכברים ודג זברה. יש תגובת ERG חוליות הטיפוסית ארבעה מרכיבים עיקריים: א-גל, שהוא פוטנציאל קרנית-שלילית הנגזר מפעילות תאי קולטי אור; ב-הגל, פוטנציאל קרנית-חיובית הנגזר מON תאים דו קוטביים; ד-הגל, פוטנציאל קרנית-חיובית להתפרש כפעילות של התאים דו קוטביים OFF; וג-הגל, אשר מתרחש כמה שניות לאחר b-הגל ומשקף פעילות בגליה מולר והמילאפיתל הפיגמנט INAL 1-4. אזכור נוסף להבנת ההיסטוריה והעקרונות של ניתוח ERG בבני אדם ובעלי חיים מודל הוא ספר הלימוד המקוון, Webvision, מאוניברסיטת יוטה וטקסטים כגון עקרונות ותרגול של אלקטרופיזיולוגיה הקלינית של 4 Vision, 5. rerio Danio (דג הזברה) כבר העדיף ארוך כמודל לפיתוח חוליות, בשל ההבשלה המהירה שלה ושקיפות, אשר מאפשרת ניתוח לא חודרני המורפולוגי של מערכות איברים, מבחני התנהגות והן קדימה לאחור מסכי גנטיים (לסקירה, ראה Fadool ו דאולינג 6). זחלי דג הזברה הם נוחים מאוד למניפולציה גנטית ותרופתית, אשר, כאשר יחד עם הפוריות הגבוהה שלהם, לגרום להם מודל חיה מצוין לניתוחים ביולוגיים תפוקה גבוהה. היחס גבוה יותר של קונוסים למוטות בדג הזברה זחל - בערך 1: 1 בהשוואה לעכברים (~ קונוס 3%ים) - להפוך אותם שימושי במיוחד ללימוד הפונקציה חרוט 7-9. ברשתית החוליות, קונוסים לפתח לפני מוטות 10. מעניין, קונוסים דג הזברה הם אופרטיביים מוקדם ככל 4 DPF, המאפשרים ניתוח אלקטרו סלקטיבית של קונוסים בשלב זה 6, 11,12. בניגוד לכך, תגובות ERG במוטות מופיעות בין 11 ל 21 DPF 13. לכן, זחלי דג הזברה ב4-7 DPF לשרת תפקודי כרשתית כל-קונוס. עם זאת, תגובת ERG photopic יליד 4-7 זחלי DPF נשלט על ידי b-הגל. יישום של סוכנים תרופתיים, כגון L - (+) - 2-אמינו-4-phosphono-butyric חומצה (L-AP4), אגוניסט לגלוטמט metabotropic קולט (mGluR6) בא לידי ביטוי בON תאים דו קוטביים, חוסם ביעילות את הדור של ב-הגל ומגלה את הפוטנציאל המבודד ההמוני קונוס קולט, (&quot;גל&quot;) 14-17. כאן אנו מתארים פשוטים וreliablשיטת דואר לניתוח ERG באמצעות ציוד ERG זמין מסחרי מיועד לשימוש עם עכברים שהותאמו לשימוש עם זחלי דג הזברה. מערכת זו יכולה להיות מנוצלת על זחלי דג הזברה של משתנה רקע גנטי, כמו גם אלו שטופלו בסוכנים תרופתיים, כדי לסייע לחוקרים בזיהוי של מסלולי איתות שתורמים לרגישות חזותית והסתגלות אור 16. הפרוצדורות מפורטות בפרוטוקול זה תדריך את החוקרים בשימוש בניתוח ERG כדי לענות על מגוון של שאלות ביולוגיות הנוגעות לראייה, ומדגימות את הבנייה של התקנת ERG גמישה.

<table><tbody><tr><td>כלוב פאראדיי</td><td>80/20 בע"מ</td><td>מותאם</td><td>אישית אלומיניום מעוצב בהתאמה אישית "סט זקוף תעשייתי" למסגרת כלוב</td></tr><tr><td>ספוג PVA</td><td>אמזון</td><td></td><td>B000ZOWG1C מספק פלטפורמה רכה ולחה להצבת זחלי דג הזברה</td></tr><tr><td>150 מ"ל מערכות סינון סטריליות</td><td>קורנינג</td><td>431154</td><td>פתרונות סינון למניעת מפרקים קטנים לחסום מיקרופיפטות</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>מערכת אלקטרופיזיולוגיה מודולרית המסוגלת לייצר גירויים חזותיים לכל ממריץ והקלטה דיגיטלית וניתוח תגובות באמצעות תוכנה קניינית, מידע נוסף בכתובת</td></tr><tr><td>http://www.diagnosysllc.com Colordome</td><td>Diagnosys, LLC</td><td></td><td>מגע ממריץ אור עם RGB LED ומקורות אור קסנון עבור Ganzfeld ERG, מידע נוסף ב</td></tr><tr><td>http://www.diagnosysllc.com Micromanipulator</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>החזקה ומיקום של מיקרואלקטרודת ההקלטה</td></tr><tr><td>מעמד טבעת מגנטית</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>החזקה ומיקום של המצלמה ואלקטרודת ההתייחסות</td></tr><tr><td>הרחבות עופרת</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>כבלי עופרת רזרביים נקבה לזכר 1.5 מ"מ לחיבור אלקטרודות</td></tr><tr><td>סיכה זכר לנקבה טכנולוגיות דשא</td><td></td> <td>מתאם SAFELEADDF-215/10</td><td>חיבור פינים 2 מ"מ ל-1.5 פיני ראש מיטה</td></tr><tr><td>מסגרת מסך חלון (מתכת) וספליין</td><td>Lowes או הום דיפו</td><td>שונים</td><td>לחיבור רשת נחושת למסגרת כלוב פאראדיי</td></tr><tr><td>מסנני Steriflip 50 מ"ל</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>פתרונות סינון למניעת חסימת מפרקים קטנים</td></tr><tr><td>מתאם BNC</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>חיבור מצלמה לכבל BNC</td></tr><tr><td>כבל BNC</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>חיבור מצלמה למתאם וידאו</td></tr><tr><td>עדשת מצלמה</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>הדמיית מיקום המיקרואלקטרודת ההקלטה על קרנית הזחל</td></tr><tr><td>מצמד מצלמה</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>הדמיית מיקום המיקרואלקטרודת ההקלטה על קרנית הזחל</td></tr><tr><td>Luna BNC to VGA + HDMI</td><td>ממיר Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>מתאם BNC ל-VGA המאפשר להקרין תמונת מצלמה על צג מחשב</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>mGluR6 אגוניסט, חוסם גל b המאפשר ניתוח של פוטנציאל קולטן מסת החרוט</td></tr><tr><td>המבודד זכוכית בורוסיליקט</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>זכוכית בורוסיליקט מלוטשת אש (טמפרטורת מטלינג = 821&deg; ג) עם נימה ומידות של 1.5 מ"מ x 0.86 מ"מ (קוטר חיצוני לפי קוטר פנימי)&nbsp;</td></tr><tr><td>P97 חולץ בוער/חום</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>למשיכת מיקרופיפטות זכוכית</td></tr><tr><td>גיליון סורבוטן</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>פולימר אורטן ויסקו-אלסטי סינטטי, המונח מתחת לתושבות בידוד פסיביות ופלטפורמת ERG לספיגת זעזועים ומניעת החלקה, ניתן לחתוך לגודל</td></tr><tr><td>לוח לחם</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>פלטת בידוד רעידות עבור ממריץ ERG ודגימת</td></tr> <tr><td>דג זברהתושבות בידוד פסיביות</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>מספק בידוד רעידות ללוח אב-טיפוס</td></tr><tr><td>רשת נחושת</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>כדי לרפד משאבת פיפטות כלוב פאראדיי</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>משמש עם פיפטות פסטר להעברה בזהירות של זחלי דג זברה</td></tr><tr><td>פיפטות פסטר</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>משמש עם משאבת פיפטה להעברה זהירה של זחלי דג הזברה</td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>Watec</td><td>WAT-902B</td><td>הדמיה של מיקום המיקרואלקטרודה המקליט על קרנית הזחל</td></tr><tr><td>טריקאין (MS-222)</td> <td>Western Chemical</td><td>Tricaine-S</td><td>חומר הרדמה בדרגה פרמצבטית,</td></tr> <tr><td>מיקרו-פיל</td><td>WPI</td><td>MF28G-5</td><td>מילוי מחזיק מיקרואלקטרודה ומחזיק מיקרואלקטרודה זכוכית מיקרואלקטרודה</td></tr><tr><td></td><td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>מחזיק מיקרו-אלקטרודה מזכוכית, מתחבר לציוד ERG</td></tr><tr><td>אלקטרודה התייחסות</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>נתק בזהירות את הסנטימטר האחרון של המעטפת כדי לנקז אלקטרוליט ולחשוף אלקטרודת גלולה Ag/AgCl מסונטרת</td></tr><tr><td>אלקטרודת ייחוס (אלטרנטיבית)</td> <td>WPI</td><td>EP1</td><td>חלופה ל-DRIREF-5SH. אלקטרודה Ag/AgCl שיש לחווט/להלחם לחיבור עופרת</td></tr><tr><td>כבל רעש נמוך למחזיק מיקרואלקטרודה</td><td>WPI</td><td>13620</td><td>חיבור מחזיק מיקרו-אלקטרודה הקלטה למתאם/ראש המיטה</td></tr></tbody></table>

ניתוח electroretinogram של התגובה החזותית בדג הזברה זחלים

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

Electroretinogram (ERG) הוא שיטה לא פולשנית אלקטרו לקביעת תפקוד רשתית. באמצעות המיקום של האלקטרודה על פני השטח של הקרנית, פעילות חשמלית שנוצרה בתגובה לאור ניתן למדוד ומשמש להערכת הפעילות של תאים ברשתית in vivo. כתב יד זה מתאר את השימוש של ERG למדוד תפקוד ראייה של דג הזברה. דג הזברה ארוכה כבר נוצל כמודל לפיתוח חוליות בשל הקלות של דיכוי גן על ידי oligonucleotides morpholino ומניפולציה תרופתית. ב5-10 DPF, רק קונוסים הם פונקציונליים ברשתית הזחל. לכן, דג הזברה, בניגוד לבעלי חיים אחרים, היא מערכת מודל עוצמה לחקר תפקוד הראייה קונוס in vivo. פרוטוקול זה משתמש הרדמה סטנדרטית, מיקרומניפולציה ופרוטוקולי stereomicroscopy כי הם נפוצים במעבדות המבצעות מחקר דג הזברה. שיטות שתוארו לעשות שימוש בEQ אלקטרופיזיולוגיה הסטנדרטיuipment ומצלמה אור נמוך כדי להנחות את המיקום של microelectrode ההקלטה על גבי קרנית הזחל. לבסוף, אנו מדגימים כיצד ממריץ / מקליט ERG זמין מסחרי שנועד במקור לשימוש עם עכברים יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם דג הזברה. ERG של דג הזברה זחל מספק שיטה מצוינת שלו מנסה לאמוד פונקציה חזותית חרוט בבעלי חיים ששונו על ידי הזרקת oligonucleotide morpholino כמו גם בשיטות של הנדסה גנטית חדשות יותר כגון אצבע nucleases (ZFNs) האבץ, תמלול Activator-כמו מפעיל nucleases (TALENs), ו חזרות התקבצו באופן קבוע Interspaced הקצר Palindromic (CRISPR) / Cas9, אשר כולם בצורה ניכרת את היעילות והיעילות של גן המיקוד בדג זברה. בנוסף, אנו מנצלים את היכולת של סוכנים תרופתיים לחדור זחלי דג הזברה להעריך את המרכיבים המולקולריים התורמים לphotoresponse. פרוטוקול זה מתאר התקנה שיכולה להיות משונית ושימוש על ידי חוקריםעם מטרות ניסוי שונות.

בדרך כלל, ERGs נרשמים מזחלי דג הזברה בשעה 5 DPF, מאז מספר מחקרים שפורסמו הקלטות ERG בשלב זה 9, 16,20. תגובות הזחל נמדדו בתנאים כהים מותאם ללא תאורת רקע באמצעות גירוי msec 20 אור LED הלבן. אנו מנוצלים מערכת זמינה מסחרי בהיקף של ERG ממריץ Ganzfeld אור ובקר / צורב במחשב. ממריץ משתמש אפנון רוחב מערכת פיקוח הדוק דופק קניינית (PWM) כדי לשלוט בעוצמת ההארה של שני הרקע ופלאש גירוי. תגובות נרשמו באמצעות מגבר ההפרש במלואו קניינית עם מסנן אנטי-aliasing חומרת נהיגה אנלוגי 16-bit ממי...

אנו מציגים שיטה לניתוח אלקטרורטינוגרפי (ERG) של זחלי דג הזברה תוך שימוש בטכניקות מיקרומניפולציה ואלקטרורטינוגרפיה. זוהי שיטה פשוטה ופשוטה לבדיקת תפקוד חזותי של זחלי דג הזברה in vivo.

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים את השלבים הדרושים לביצוע אנליזה אלקטרוגרפית בזבובי זברה בשלב הזחלים. דבר זה מושג תחילה על ידי ייצור מיקרו-פיפטות זכוכית בצורה ובגודל המתאימים. השלב השני הוא הגדרה קפדנית של הציוד הקריטי לניסוי, כגון אלקטרודות ייחוס והקלטה.בשלב הבא, זחל דג הזברה מוהרדם וממוקם בצורה נכונה ביחס לציוד הגירוי וההקלטה. השלב האחרון הוא הנחה נכונה של מיקרו-אלקטרודת הזכוכית על קרנית זחל דג הזברה. בסופו של דבר, זחלי דג זברה.ניתוח ERG הוא שימושי לחקירת התפקוד הראייתי של המדוכים ברשתית של חולייתנים בעלי מדוכים בלבד in vivo. שיטה זו מועילה מאוד למתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדע הראייה, כגון זיהוי מסלולי העברה התורמים לרגישות חזותית ולהסתגלות לאור במדוכים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן המיקום הנכון של מיקרו-אלקטרודת ההקלטה על הדגימה הוא קשה ללמידה בשל גודלה הקטן של עינו של זברון הזברא בשלב הזחלי.כדי להתחיל בהליך זה, ישוך מספר מיקרו-פיפטות באמצעות קפילרות זכוכית בורו-סיליקט שעברו ליטוש באש עם פילמנט. בדוק כל מיקרו-פיפטה תחת מיקרוסקופ עם סרגל מדורג מתאים כדי לוודא שקוטר הקצוות הוא 10 עד 15 micrometers ושמראהם אחיד. הכן תמיסת עבודה ביום הניסוי על ידי דילול של תמיסת ringer בריכוז 10x לריכוז 1x.סננו את התמיסה באמצעות מסנן מים מזוקקים דה-יוניזציה כדי להבטיח שחלקיקים לא יחסמו את קצה המיקרופיפט. לאחר מכן, חמצנו את התמיסה ב-95% oxygen ו-5% carbon dioxide למשך 10 דקות. סגרו את התמיסה היטב לאחר מכן כדי להבטיח שהתמיסה תישאר מחומצנת.כעת הניחו פלטפורמת פלסטיק ניידת עם בסיס בולם זעזועים מפולימר אוריתן ויסקו-אלסטי על שולחן נגד רעידות מתחת למקור האור. לאחר מכן, מקמו את המצלמה באמצעות מעמד מגנטי וכוונו אותה אל פלטפורמת הפלסטיק הניידת. לאחר מכן מקמו את המיקרו-מניפולטור של מיקרו-אלקטרודת ההקלטה על מעמד מגנטי שני.יש לוודא שהמצלמה והמיקרו-מניפולטור אינם מושפעים מתנועת ציוד אחר, וכי הם אינם חוסמים את התאורה ממקור האור. לאחר מכן, חברו את המצלמה למסך וידאו ומקמו אותה לכיוון הפלטפורמה. ודאו שהמערכת מוארקת כראוי באמצעות חוט נחושת.בשלב זה, חתוך באמצעות להב תער נקי מלבן קטן של ספוג PVA יבש שיתאים בדיוק לצלוחית פטרי של 35 מילימטר. בצע חתך נוסף בספוג כדי לאפשר את הכנסת אלקטרודת הייחוס. לאחר מכן, השתמש בטוש עמיד לכימיקלים כדי לסמן נקודה קטנה על הספוג במקום שבו תמוקם הזחול.לאחר מכן, השרו את ספוג ה-PVA בתמיסת רינגר עד לרוויה. הוציאו את הספוג וספגו אותו במהירות בנייר סופג פעמיים עד שלוש פעמים לפני הנחתו בצלחת פטרי נקייה בקוטר 35 מילימטרים. לאחר מכן, מקמו את צלחת הפטרי המכילה את הספוג על פלטפורמה מפלסטיק כך שהסימון יהיה גלוי למצלמה.בשלב הבא, בצעו כלורידציה לאלקטרודות על ידי השרייתן בנתרן כלוריד בריכוז של 6% עד 9%. לאחר מכן, ייבשו אותן באוויר על נייר ניגוב מסוג Kim wipe למשך חמש דקות. מקמו את כדור הכסף-כלוריד של אלקטרודת הייחוס בתוך הספוג או מתחתיו, בהתאם לסגנון החיתוך שבוצע, וחברו את מוליך אלקטרודת הייחוס למערכת ההקלטה.בשלב הבא, חברו כ-40 סנטימטרים של צינורית למזרק של 5 מיליליטר ללא לור-לוק (non lure lock) ומלאו את המזרק בתמיסת רינגר. לאחר מכן, מלאו מזרק של 1 מיליליטר ללא לור-לוק בתמיסת רינגר. באמצעות מיקרופיל (microfill), מלאו בזהירות את מחזיק המיקרו-אלקטרודה ומנעו היווצרות של בועות.לאחר מכן, חברו את המזרק בנפח 5 מיליליטר לפתח הלחץ של מחזיק המיקרו-אלקטרודה באמצעות צינורית, תוך שימוש ב-microfill ובמזרק של 1 מיליליטר מלא בתמיסות רינגר. מלאו את המיקרו-פיפטית מזכוכית מהקצה וודאו שאין בתוכה בועות. לאחר מכן, חברו את המיקרו-פיפטית מזכוכית למחזיק המיקרו-אלקטרודה והקפידו לשמור על חוט האלקטרודה ישר.לאחר הקיבוע, השתמש במזרק של 5 ml כדי לדחוף בזהירות את תמיסת הרינגר דרך המיקרו-אלקטרודה עד שכמות קטנה של תמיסה תהיה גלויה בקצה. כעת, מקם בזהירות את מיקרו-אלקטרודת ההקלטה במיקרו-מניפולטור וחבר את המוליך למערכת ההקלטה כדי לבדוק רעשים במערכת. מקם את אלקטרודת הייחוס ואת קצה מיקרו-אלקטרודת ההקלטה בצלחת פטרי של 35 mm המלאה בתמיסת רינגר.בדקו את רמות הרעש החשמלי של המערך באמצעות אוסצילוסקופ או תכונה מובנית של מכשיר ה-ERG. רמות הרעש לא יעלו על פלוס או מינוס 10 microvolts מקו הבסיס. בהליך זה, גזרו מספר ריבועים של נייר סופג בגודל סנטימטר רבוע אחד, הרדימו שלוש עד חמש זחלים בצלחת פטרי של 35 millimeter על ידי הוספת trica לריכוז סופי של 0.02% והמתנה של דקה עד שתי דקות.לאחר מכן, העבר בזהירות זחל בודד למרובע של נייר סופג תחת מיקרוסקופ סטריאו עם תאורה מינימלית. בדוק את מיקום הזחלים ובחר מועמד שנמצא בצד הגבי (dorsal side up) עם עין חסומה עבור מפגשי הקלטה הנמשכים יותר מ-30 דקות. שמור על לחות הזחל על ידי ציפוי הגוף ב-3% methylcellulose באמצעות מברשת שערה של גמל עדינה.לאחר מכן, העבירו את ריבוע נייר הספיגה עם הזחל לספוג PVA לח. בשלב הבא, יישמו זרם רציף של מים רוויים ב-100% oxygen על הזחלים, על ידי בעבוע של הגז דרך אבן אוויר בתוך בקבוק עם זרוע צד המכיל מים מזוקקים. מקמו את ה-oxygen הלח שיוצא מזרוע הצד של הבקבוק סמוך לראש הזחל באמצעות צינור, תחת תאורה מינימלית.השתמשו במיקרו-מניפולטור ובמצלמה כדי למקם את קצה המיקרו-אלקטרודה בנקודת האמצע שבין הקצוות הנחירים והזנביים של העין, ולחצו בעדינות על הגבול הדורסלי של הקרנית. אפשרו לזחלים להסתגל לחושך במשך 5 עד 10 דקות. לאחר מכן, רשמו את התגובות להבזקי מבחן של אור המגיע ממקור תאורה מסוג LED או ממגרה אופטית.איור זה מציג הקלטת ERG טיפוסית בזבוב דג זברה בעל חמישה DPF. דגים שהותאמו לחושך נחשפו לאור LED לבן למשך 20 milliseconds בעוצמות שנעו בין 1 ל-5,000 canula למטר רבוע, כאשר תחילת גירוי האור הייתה בשנייה אפס. קשה להבחין בגל a בעלת הפוטנציאל השלילי, בעוד שגל b בעל הפוטנציאל החיובי הוא השיא הדומיננטי של צורת הגל.תוספת זו מציגה את אמפליטודות התגובה הממוצעות של גל B שהותאמו באמצעות משוואת Naka-Rushton. דמות זו מציגה הקלטת ERG טיפוסית של זריעת דג זברה ביום 5 DPF המותאמת לחושך מטופלת ב-PB. הדגים נחשפו לאור LED לבן למשך 20 milliseconds בעוצמות הנעות בין 1 ל-5,000 canula למטר רבוע, ופוטנציאל הקולט של מסת המדוכים המבודדת הוא האלמנט הדומיננטי של צורת הגל. תוספת זו מציגה את אמפליטודות התגובה הממוצעות של זריעת דג זברה מטופלת ב-PB שהותאמו באמצעות משוואת Naka-Rushton.איור זה מציג רישום ERG טיפוסי בזבוב דגים (zebra fish) בשלב הלרבה שעובד ב-five D-P-F-A-P-B. תוך שימוש בפרדיגמה של הבזק כפול. הדגים המותאמים לחושך נחשפים להבזקים עקביים של אור לבן למשך 20 millisecond.נורית LED מהבהבת בעוצמה של 1000 canula למטר רבוע, וה-ISI בין ההבזקים הוא שתי שניות. תחילתו של כל גירוי אור מסומנת כאן. איור זה מציג את היחס בין תגובת פוטנציאל הקולטן המקסימלית של מסת קונוסים מבודדת לגירוי השני לבין התגובה לגירוי הראשוני ככל שה-ISI עולה, דבר המעיד על ההתאוששות ההדרגתית של רגישות הפוטורצפטורים.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי איכות ההקלטות נקבעת על ידי תקינות החיבור של האלקטרודה לקרנית ובריאותן של הזחלים. פיתוח טכניקה זו שיפר משמעותית את יכולתם של חוקרים במדעי הראייה לבחון הסתגלות והתאוששות של קונוסים ברשתית של חולייתנים in vivo.

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פיתחנו את תגובת חזותית-Motor כדי לכמת את הפלט המוטורי של דג הזברה הזחל בתגובה במרווחים ו decrements אור. בחנו גם מוטנטים דג הזברה חזון, כולל לא optokinetic (NRC) מוטנטים בתגובה, אשר נחשבו עיוור לחלוטין, כאשר נבדק על ידי assay אחר חזון, רפלקס optokinetic.

Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

בתגובה Optokinetic כבר בשימוש נרחב על מנת להעריך את תפקודי הראייה של דג הזברה הזחל. עם זאת, פרוטוקול סטנדרטי דגים הזחל עדיין לא החלים בקלות...

שימוש בתגובה optokinetic ללמוד לתפקד החזותי של דג הזברה

VisioTracker היא מערכת אוטומטית לניתוח הכמותי של ביצועים חזותיים של דגים בוגרים וזחל קטנים המבוססים על ההקלטה של ​​תנועות עיניים. הוא כולל שליטה מלאה על תכונות גירוי חזותיים וניתוח בזמן אמת, המאפשר מחקר תפוקה גבוהה בתחומים כגון פיתוח מערכת ראייה ותפקוד, פרמקולוגיה, מחקרי מעגלים עצביים ואינטגרציה חושית.

VisioTracker, גישה אוטומטית חדשנית לניתוח oculomotor

סרטון זה מתאר את בדיקת התגובה הפוטומוטורית של דגי זברה וזחלי מיננו שמנים באמצעות תוכנת מעקב אוטומטית. הפרוטוקול מודד את התגובה ההתנהגותית של דגי הזחל בעקבות שינוי פתאומי בתנאי התאורה.

בדיקת תגובה פוטומוטורית: שיטה למדידת התגובה ההתנהגותית של דגי זברה זחלים לשינוי פתאומי במצב התאורה

סרטון זה מתאר את בדיקת התגובה האופטוקינטית בדגי זברה. הסרטון מודד את תנועות העיניים הרפלקסיביות בהתבסס על הגירוי החזותי הנע וקובע את חדות הראייה בדגי זברה.

בדיקת תגובה אופטוקינטית: שיטה למדידת חדות ראייה בדגי זברה

סרטון זה מדגים את השיטה לחקר זיהוי טרף חזותי בזחלי זברה טרנסגניים באמצעות הדמיה פלואורסצנטית מבוססת מחוון סידן כאשר תאי העצב שלהם מבטאים קומפלקסים של אינדיקטור סידן פלואורסצנטי.

ניתוח הפעילות העצבית המעוררת טרף בזחל דג זברה מהונדס

דג הזברה הייתה כלי חשוב לתחומי מחקר רבים. כאן אנו מדגימים שיטה כדי לעורר תגובה חזותית ולחשב את חדות ראייה תפקודיות בדג הזברה המבוגר.

תגובת Optokinetic כמדד כמותי של חדות ראייה בדג הזברה

אנו מציגים שיטה יעילה לתאי גנגליון רשתית (RGCs) בדג זברה בוגר.

תיוג מדרדר של תאים ברשתית גנגליון מבוגרים דג הזברה עם צבעי ניאון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להתפתחות ואפיון של מודל דג זברה של אפילפסיה הנובע מהעיכוב הארעי של הגן DEPDC5.

ניתוח התנהגותי ופיזיולוגי במודל דגי זברה של אפילפסיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אשר מפשט את המדידה של אור electroretinogram עורר תגובות דג זברה זחל. אלקטרודה הרומן בצורת חרוט ספוג-עצה יכולים לעזור להפוך את המחקר של פיתוח ויזואלי בזחל דג זברה שימוש את electroretinogram ארג קל יותר להשיג עם תוצאות אמינות ועלות נמוכה יותר.

הקלטת Electroretinogram דג זברה זחל באמצעות אלקטרודה ספוג-טיפ בצורת חרוט הרומן A

המאמר מסביר כיצד להסיר באופן כירורגי עיניים מזחלי דגי זברה חיים כצעד ראשון לקראת חקירת האופן שבו קלט רשתית משפיע על צמיחת והתפתחות של טקטום אופטי. בנוסף, המאמר מספק מידע על הרדמה של זחלים, קיבוע וכריתת מוח, ולאחר מכן אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית.

הסרת עיניים בזחלי דגי זברה חיים לבחינת גדילה והתפתחות תלויי עצבנות של מערכת הראייה

למדו לבצע ניתוח אלקטרורטינוגרפי בזחלי דג הזברה כדי להעריך תפקוד ראייה חי. שיטה זו מאפשרת למדענים לחקור תפקוד קונים ברשתית בעלת חיים בצורה יעילה ומהימנה.

ניתוח electroretinogram של התגובה החזותית בדג הזברה זחלים

גלה סרטונים נוספים