Name: הקמת מודל xenograft מיאלומה נפוצה אדם בעוף לחקר צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: חקור מודל xenograft מיאלומה נפוצה אדם בעוף לחקר צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה. שיטה זו מאפשרת סינון מעבדתי מהיר של תרופות נוגדות סרטן בסביבה תלת-ממדית מורכבת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לגב' קורנליה הייס על הסיוע הטכני המצוין שלה באימונוהיסטוכימיה והכנת עוברי תרנגולות. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע האוסטרית (מענק FWF מס' P19552) והאיחוד האירופי (פרויקט FP7 של האיחוד האירופי Optatio No: 278570).

על פי החוק האוסטרי, והמשרד של בעלי חיים במעבדת רווחה של עוברי עופות שירות בריאות הציבור האמריקאים אינם נחשבים כבעלי חיים בעלי חוליות חיים עד משרד NIH hatching.The של בעלי חיים במעבדת רווחה סיפק הדרכה נכתבה בתחום זה (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm ופרסום NIH לא .: 06-4515). 1. תא התרבות וlentiviral Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורות תאי MM תרבות OPM-2, RPMI-8226 ותאי גזע mesenchymal אדם ממח עצם במדיום RPMI1640, בתוספת 10% בסרום שור עוברי עגל ו -100 IU / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין וגלוטמין 2 מ&quot;מ בנוכחות 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect 5 x 10 6 תאי HEK 293FT עם תערובת נגיפית אריזת DNA (9 מיקרוגרם) ו -3 מיקרוגרם pLenti6 / V5 dest eGFP וקטור על ידי השימוש של מגיב transfection liposomal 30 μl ובינוני transfection (10 מיליליטר). הסר בינוני transfection לאחר 12 שעות ולהוסיף 10 מיליליטר DMEM בינוני עם 10% בסרום שור עגל וחומצות אמינו לא חיוני 1% (NEAA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 ימים, לאסוף supernatants של תאי HEK293FT לאחר צנטריפוגה של תאי שחייה (1000 XG, 5min). לקבוע כייל נגיף על ידי PCR בזמן אמת כפי שתואר במקום אחר 28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect 1 x 10 6 תאי MM עם חלקיקי eGFP lentiviral (1 x 10 5 חלקיקים) בצלחת גם 24 במדיום גידול שלם. לאחר 3 ימים, להתחיל תהליך בחירה על ידי הוספת 2 מיקרוגרם / מיליליטר blasticidin עד בינוני התרבות. לlentivirus eGFP הזמינים המסחרית, השתמש 500 מיקרוגרם / מיליליטר נאומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שבועות של בחירה, אשכולות של eGFP להביע תאי MM יופיעו; לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה (1000 XG, 5 דק &#39;) ולהרחיב אותם כOPM-2 eGFP וRPMI-8226 sublines eGFP לניסויים (סעיף 2 ו -3). </li></ol> דגם מיאלומה ספרואיד 2. 3D-מרובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוג אני קולגן צ&#39;יל פתרון ו -10 x o DMEMקרח n. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 1/10 נפח של 10 DMEM בינוני x למטריצת קולגן; להוסיף NaOH (0.2 N) לנטרל פתרון קולגן חומצי לערך ה- pH של 7.4; קולגן חנות / פתרון בינוני על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים שורות תאים מהונדסים MM (OPM-2 eGFP או RPMI-8226 eGFP; 250,000 לאליפטית,) עם תאים אנושיים mesenchymal (50,000 תאים / אליפטית, כלומר, ירידה של 30 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת תא צנטריפוגה ב 15 מיליליטר צינורות (1000 XG, 5min), להוסיף תערובת קרה מוכן קולגן (1mL) לתא גלולה ומערבבים היטב (עם 1,000 קצה μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד פיפטה 30 μl של תערובת קולגן / תא (עם 100 טיפ μl) בצלחת גם 24 על סרט פרפין סטרילי ולאפשר תערובת התא / קולגן לפלמר במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (ראה איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> spheroids MM שכבה עם מדיום תרבות 1mL המכיל 1, 10 ו 100 ננומטר בורטזומיב (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 72 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, spheroids מסמך על ידיstereomicroscopy הקרינה (ראה איור 1 ג &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כל אליפטית על ידי השימוש במלקחיים עם לסתות שטוחות רחבות בצינור תגובה למדידה של ה- GFP (ראה איור 1D). </li></ol> 3. 3D מודל xenograft מיאלומה נפוצה ברפואה המשלימה והאלטרנטיבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביצי עוף בחממה מיוחדת לביצים עופות על 37 מעלות צלזיוס ולחות 70% לשלושה ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, ביצים פתוחות ועוברי העברה לעיקור עם סירות במשקל פלסטיק אתנול,, 10 סנטימטרים מרובעים עם מכסה צלחת תרבית תאי דגירה &quot;לשעבר אובו&quot; לעוד שישה ימים, כך שCAM הוא מסוגל לפתח (ראה איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוג אני קולגן צ&#39;יל פתרון ו -10 DMEM x על קרח, לערבב 1/10 נפח של 10 x DMEM בינוני למטריצת קולגן, להוסיף NaOH (0.2 N) לנטרל פתרון קולגן חומצי לערך ה- pH של 7.4; קולגן חנות / פתרון בינוני על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים קווי MM המהונדס תא (OPM-2 eGFP אוRPMI-8226 eGFP; 250,000 לאליפטית,) עם תאי mesenchymal אנושיים (50,000 תאים / אליפטית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב 15 מיליליטר צינורות (1000 XG, 5min; לכל מתחם בדיקת בקבוקון 1), להוסיף 1mL תערובת קולגן מוכן קרה עם תרופה (בריכוז רצוי עבודה) לתא גלולה ומערבבים היטב (עם 1,000 קצה μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח טיפות קולגן (30 μl כל אחד) על parafilm ב6 גם פטה למשך 30 דקות כדי לאפשר פילמור של מטריקס על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה &quot;onplants&quot; מצעד 3.6 עם השימוש במלקחיים על פני השטח לא מטופל של CAM (2 סנטימטרים מהעובר) של עוברי תרנגולת 9 יום בן (4 onplants לכל עובר עוף, ראה איור 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 ימים של צמיחה בvivo בחממת ביצה על 37 מעלות צלזיוס ולחות 70%, xenografts מסמך על ידי stereomicroscopy הקרינה (ראה איור 2 ג). להרדים עוברי עוף בהיפותרמיה על 4 מעלות צלזיוס במקרר 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר xenografts עם רקמת CAM subjacent ידי מספריים עיניים ומלקחיים עם לסתות שטוחות רחבות. השתמש בם למדידה של ה- GFP (סעיף 4, ראו איור 2 ד) או לצורך ניתוח immunohistochemical של כלי דם ו / או תאים פולשים גידול (סעיף 5). </li></ol> 4. כימות חלבון eGFP ידי ELISA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כל אליפטית MM או xenograft נכרת ל0.5 מיליליטר Ripa מאגר המכיל 200 מיקרוגרם / מיליליטר מעכבי פרוטאז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize אליפטית / xenograft עם homogenizer רקמות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע שלוש הקפאה / הפשרה מחזורים בחנקן נוזלי ו -37 ° C אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> homogenate צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (12,000 ז) וsupernatants חנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דגימות 01:20 במאגר assay (200 μl) של ערכת ELISA. למדוד GFP-ידי רמות ה- GFP מסחרי ELISA ערכה באמצעות נוגדנים אנטי-GFP biotinylated, על פי הפרוטוקול של היצרן. </li></ol> 5. Immunohiניתוח stochemical של כלי דם ותאי גידול פולשים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן xenografts נכרת בשטח CAM ב -4% O paraformaldehyde / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח xenografts הקבוע לקלטות הטבעה ולהעביר אותם לתחנת הטבעת רקמות עם סדרת הגדלת מדורגת אלכוהול (50%, 70%, 80%, 95% אתנול, xylol ופרפין; כל דקות שלב 60). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> xenografts סעיף (5 מיקרומטר) על ידי השימוש בmicrotome הסיבובי benchtop. אופה חלקי פרפין על O שקופיות זכוכית / N ב 56 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי Deparaffinize על ידי סדרת אלכוהול מדורגת יורדת למים מזוקקים כפולים (xylol, 95%, 80%, 70%, 50% אתנול, מים מזוקקים כפולים; כל שלב 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע אחזור אנטיגן באמבט מים (95 מעלות צלזיוס, 20 דקות) עם פתרון אחזור אנטיגן (חיץ citrate-; pH 7.0; נפח 100 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום פעילות peroxidase אנדוגני עם H 100 μl 3% 2 O 2 / מתנול למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי בלוק בPBS המכיל10% עוברי עגל בסרום במשך 45 דקות (נפח 100 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם במשך שעה 1 עם של נוגדן ראשוני (1μg / מיליליטר) מדולל PBS המכיל 1% בסרום עגל עוברי ב RT 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת 3 פעמים-ב PBS, דגירה של 1h עם נוגדן biotinylated המשני (0.1 מיקרוגרם / מיליליטר) בPBS המכיל 1% בסרום עגל עוברי ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת 3 פעמים-בPBS לבצע תגובת צבע על ידי פתרון avidin מצע / יוטין-מורכב (ABC) וdiaminobenzidine (DAB) על פי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5.11. עצור תגובה על ידי העברת חלקים למים מזוקקים כפולים, counterstain עם hematoxylin והר חלקים עם הרכבה בינונית סינטטי. </li></ol>

<ol><li>Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+evolving+genetic+events+and+host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions.</a> Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).</li>
<li>Kumar, S. K., Gertz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+adapted+therapy+for+multiple+myeloma%3A+back+to+basics%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics.</a> Leuk.Lymphoma. , (2014).</li>
<li>Prideaux, S. M., Conway, O. E., Chevassut, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+architecture+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Hematol%22%5BJournal%5D)">The genetic architecture of multiple myeloma.</a> Adv.Hematol. 2014, 864058(2014).</li>
<li>Chauhan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+orally+active+proteasome+inhibitor+ONX+0912+triggers+in+vitro+and+in+vivo+cytotoxicity+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A novel orally active proteasome inhibitor ONX 0912 triggers in vitro and in vivo cytotoxicity in multiple myeloma.</a> Blood. 116 (23), 4906-4915 (2010).</li>
<li>Kuehl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+can+predict+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models can predict cancer therapy.</a> Blood. 120 (2), 238-240 (2012).</li>
<li>Nefedova, Y., Gabrilovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+clinical+prospects+of+Notch+inhibitors+in+the+therapy+of+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Resist.Updat%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and clinical prospects of Notch inhibitors in the therapy of hematological malignancies.</a> Drug Resist.Updat. 11 (6), 210-218 (2008).</li>
<li>Yaccoby, S., Barlogie, B., Epstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+myeloma+cells+growing+in+SCID-hu+mice%3A+a+model+for+studying+the+biology+and+treatment+of+myeloma+and+its+manifestations%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Primary myeloma cells growing in SCID-hu mice: a model for studying the biology and treatment of myeloma and its manifestations.</a> Blood. 92 (8), 2908-2913 (1998).</li>
<li>Dazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+chronic+phase+CML+hematopoietic+cells+repopulate+NOD%2FSCID+bone+marrow+with+different+kinetics+and+cell+lineage+representation%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol.J%22%5BJournal%5D)">Normal and chronic phase CML hematopoietic cells repopulate NOD/SCID bone marrow with different kinetics and cell lineage representation.</a> Hematol.J. 1 (5), 307-315 (2000).</li>
<li>Lock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic%2Fsevere+combined+immunodeficient+%28NOD%2FSCID%29+mouse+model+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+reveals+intrinsic+differences+in+biologic+characteristics+at+diagnosis+and+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse.</a> Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).</li>
<li>Feuring-Buske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+progenitor+cells+in+beta+2-microglobulin-deficient+NOD%2FSCID+mice+and+in+NOD%2FSCID+mice+transgenic+for+human+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors.</a> Leukemia. 17 (4), 760-763 (2003).</li>
<li>Pearce, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AML+engraftment+in+the+NOD%2FSCID+assay+reflects+the+outcome+of+AML%3A+implications+for+our+understanding+of+the+heterogeneity+of+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML.</a> Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+inhibition+of+Notch+signaling+and+Bcl-2%2FBcl-xL+results+in+synergistic+antimyeloma+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Combined inhibition of Notch signaling and Bcl-2/Bcl-xL results in synergistic antimyeloma effect.</a> Mol.Cancer Ther. 9 (12), 3200-3209 (2010).</li>
<li>Tassone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinically+relevant+SCID-hu+in+vivo+model+of+human+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A clinically relevant SCID-hu in vivo model of human multiple myeloma.</a> Blood. 106 (2), 713-716 (2005).</li>
<li>Ranga, A., Gjorevski, N., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+through+stem+cell-based+organoid+models%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Drug+Deliv.Rev%22%5BJournal%5D)">Drug discovery through stem cell-based organoid models.</a> Adv.Drug Deliv.Rev. 69-70, 19-28 (2014).</li>
<li>Pereira, R. F., Barrias, C. C., Granja, P. L., Bartolo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+biofabrication+strategies+for+skin+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine.%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Advanced biofabrication strategies for skin regeneration and repair.</a> Nanomedicine.(Lond). 8 (4), 603-621 (2013).</li>
<li>Fischbach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+tumors+with+3D+scaffolds%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering tumors with 3D scaffolds).</a> Nat.Methods. 4 (10), 855-860 (2007).</li>
<li>Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+human+stem+cells+into+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo.</a> J.Vis.Exp. (41), (2010).</li>
<li>Deryugina, E. I., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+2.+Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+models+to+quantify+angiogenesis+induced+by+inflammatory+and+tumor+cells+or+purified+effector+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter 2. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules.</a> Methods Enzymol. 444, 21-41 (2008).</li>
<li>Deryugina, E. I., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+model+systems+to+study+and+visualize+human+tumor+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis.</a> Histochem.Cell Biol. 130 (6), 1119-1130 (2008).</li>
<li>Kern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GRP-78+secreted+by+tumor+cells+blocks+the+antiangiogenic+activity+of+bortezomib%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GRP-78 secreted by tumor cells blocks the antiangiogenic activity of bortezomib.</a> Blood. 114 (18), 3960-3967 (2009).</li>
<li>Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gelatin+sponge-chorioallantoic+membrane+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay.</a> Nat.Protoc. 1 (1), 85-91 (2006).</li>
<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+model+for+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology.</a> Exp.Cell Res. , (2014).</li>
<li>Dohle, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay%3A+how+it+really+works%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works.</a> J.Vis.Exp. (33), (2009).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chick+embryo+model+for+metastatic+human+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.Urol%22%5BJournal%5D)">A chick embryo model for metastatic human prostate cancer.</a> Eur.Urol. 34 (2), 154-160 (1998).</li>
<li>Koop, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+melanoma+cells+entering+the+microcirculation%3A+over+80%25+survive+and+extravasate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fate of melanoma cells entering the microcirculation: over 80% survive and extravasate.</a> Cancer Res. 55 (12), 2520-2523 (1995).</li>
<li>Martowicz, A., Spizzo, G., Gastl, G., Untergasser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype-dependent+effects+of+EpCAM+expression+on+growth+and+invasion+of+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.Cancer%22%5BJournal%5D)">Phenotype-dependent effects of EpCAM expression on growth and invasion of human breast cancer cell lines.</a> BMC.Cancer. 12, 501(2012).</li>
<li>Martowicz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM+overexpression+prolongs+proliferative+capacity+of+primary+human+breast+epithelial+cells+and+supports+hyperplastic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cancer%22%5BJournal%5D)">EpCAM overexpression prolongs proliferative capacity of primary human breast epithelial cells and supports hyperplastic growth.</a> Mol.Cancer. 12, 56(2013).</li>
<li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> 6, 34(2006).</li>
<li>Farnoushi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+testing+of+drug+response+in+multiple+myeloma+made+possible+by+xenograft+to+turkey+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo testing of drug response in multiple myeloma made possible by xenograft to turkey embryos.</a> Br.J.Cancer. 105 (11), 1708-1718 (2011).</li>
<li>Wunderlich, M., Krejci, O., Wei, J., Mulloy, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD34%2B+cells+expressing+the+inv%2816%29+fusion+protein+exhibit+a+myelomonocytic+phenotype+with+greatly+enhanced+proliferative+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human CD34+ cells expressing the inv(16) fusion protein exhibit a myelomonocytic phenotype with greatly enhanced proliferative ability.</a> Blood. 108 (5), 1690-1697 (2006).</li>
<li>Hideshima, T., Mitsiades, C., Tonon, G., Richardson, P. G., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+multiple+myeloma+pathogenesis+in+the+bone+marrow+to+identify+new+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Cancer%22%5BJournal%5D)">Understanding multiple myeloma pathogenesis in the bone marrow to identify new therapeutic targets.</a> Nat.Rev.Cancer. 7 (8), 585-598 (2007).</li>
<li>Parikh, M. R., Belch, A. R., Pilarski, L. M., Kirshner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+tissue+culture+model+to+study+primary+human+bone+marrow+and+its+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies.</a> J.Vis.Exp. (85), (2014).</li>
<li>Schuler, J., Ewerth, D., Waldschmidt, J., Wasch, R., Engelhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+multiple+myeloma%3A+a+critical+appraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.Opin.Biol.Ther%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of multiple myeloma: a critical appraisal.</a> Expert.Opin.Biol.Ther. 13, Suppl 1. S111-S123 (2013).</li>
<li>Kirshner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+three-dimensional+model+for+evaluating+the+impact+of+therapy+on+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma.</a> Blood. 112 (7), 2935-2945 (2008).</li>
<li>Jilani, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+binding+of+lectins+to+embryonic+chicken+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Selective binding of lectins to embryonic chicken vasculature.</a> J.Histochem.Cytochem. 51 (5), 597-604 (2003).</li>
</ol>

יש הסופרים לא אינטרסים כלכליים מתחרים

הפיתוח של תרופות חדשות לMM עקשן דורש פחות זמן רב ומערכות ב- vivo יקרים להעריך רגישות של תאי MM אנושיים לתרופות. עד כה, רק מעטים מערכות ב- vivo זמינות להערכה פרה-קלינית של טיפולים אנטי-מיאלומה חדשות. לכולם יש את המגבלות שלהם להקרנה בקנה מידה גדולה של ספריות מתחם 29. הדגמים הנוכחיים הטובים ביותר עבור תאי MM אנושיים הם עכברי חיסון הלקוי ביותר 7,13,30 ועוברי טורקיה 29. שני העכבר SCID ומודלי xenograft עובר עופות יכולים לשמש כדי לחקור את הבי...

מיאלומה נפוצה (MM) מאופיינת בריבוי של תאי פלזמה ממאירים במח העצם, נגעי עצם וכשל חיסוני 1. למרות שקיימות אפשרויות טיפול חדשות כגון מעכבי פרוטאזום (בורטזומיב) ותרופות מווסתות חיסון (פומלידומיד ולנלידומיד), MM עדיין נותר ממאיר חשוך מרפא עם פרוגנוזה עגומה 2. ניתן להסביר את הפרוגנוזה הגרועה על ידי ההטרוגניות יוצאת הדופן של שיבוטי תאי MM התורמת לתגובות משתנות לטיפול, במיוחד תחת טיפול ממושך ולחץ בחירה של שיבוטי MM 3.
בדיקה פרה-קלינית של תרופות חדשות ושילובים שלהן in vitro ו-in vivo היא צעד קריטי וגוזל זמן לפיתוח תרופות עתידיות. לפיכך, נדרשים מודלים שימושיים של MM כדי להשיג הבנה טובה יותר של הביולוגיה של המחלה ולאפשר גילוי של תרופות חדשות. למעשה, המודלים הטובים ביותר להשתלות זרות עבור ממאירויות וטיפולים המטולוגיים הם עכברים חסרי חיסון, כגון עכברי חסר חיסוני משולב חמור (SCID) 4-7, עכברי סוכרת/SCID (NOD/SCID) שאינם שמנים 8,9 או עכברי NOD/SCID עם β מיקרוגלובולין נוקאאוט 10,11.
למרות שמודלים עכבריים של MM אנושי יכולים בהיבטים מסוימים להידמות לפנוטיפ של מחלות אנושיות, עכברים חסרי חיסון מולדים, ולכן מדמים רק תגובה בודדת אחת לתרופה והעלויות גבוהות מאוד. בשל דיכוי חיסוני בעלי חיים דורשים תנאי תחזוקה מיוחדים והשתלת MM אנושי בעכברים דורשת 6 שבועות עד חודשיים 9,12, אלא אם כן תאים מושתלים ישירות למח העצם באמצעות הליך תובעני מבחינה טכנית עם שיעורי הישרדות נמוכים יותר של בעלי חיים 7,13. לכן, הוקמו שיטות חדשות המשתמשות במודלים אורגנואידים מבוססי תאי גזע 14, הנדסת רקמות 15 או מודלים מתוחכמים של תרביות תאים תלת מימדיות 16. הם יתחרו בעתיד הקרוב בניסויים קלאסיים בבעלי חיים לניסויים פרה-קליניים בתרופות, אך אינם יכולים להחליף בדיקות רעילות מערכתיות באורגניזמים חיים.
עובר התרנגולת הוכח בעבר כאורגניזם מתאים להשתלת תאים ורקמות אנושיות עקב היעדר תגובה חיסונית נרכשת עד לבקיעת 17-19. יתר על כן, כל עובר תרנגולת משקף תגובה אינדיבידואלית לתרופות יישומיות או לתאי גידול עקב המגוון הגנטי באוכלוסיית התרנגולות. הממברנה הכוריואלנטואית (CAM) היא מערכת מבוססת היטב לחקר אנגיוגנזה תלוית גידול 20-22. כאשר גידולים מוצקים מושתלים ב-CAM, הם מציגים מאפיינים רבים של סרטן in vivo, כולל התפשטות, פלישה, אנגיוגנזה וגרורות 23-27. 
בהתבסס על הניסיון הקודם של קבוצתנו עם מודלים של CAM xenograft20,26,27, הוקם מודל MM אנושי המשלב את היתרון של מערכת תרבית תלת מימדית אנושית עם מודל של עוברי תרנגולות המתפתחים ex ovo. מערכת מודל MM זו מאפשרת ניטור בזמן אמת של התקדמות צמיחת MM, כימות מסת התא ובדיקות תרופות פרה-קליניות.

<table><tbody><tr><td>תאי RPMI-8226 תאי</td><td>DSMZ</td><td>ACC 9</td><td>STR פרופיל</td></tr><tr><td>OPM-2 תאי גזע</td> מזנכימליים אנושיים <td>DSMZ</td><td>ACC 50</td><td>STR פרופיל</td></tr><tr><td>תאי גזע מזנכימליים אנושיים&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>PC-C-12974</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT תאים&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R700-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 בינוני</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי&nbsp; HyClone</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut- עט- תמיסת סטרפטוקוקוס</td><td>Sigma</td><td>G6784</td><td></td></tr><tr><td>DMEM בינוני</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Transfection Medium/Opti-MEM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>eGFP חלקיקים נגיפיים</td><td>GeneCopoeia</td><td>LPP-EGFP-LV105</td><td>מוכן לשימוש חלקיקים נגיפיים</td></tr><tr><td>pLenti6/V5Dest6 eGFP וקטור</td><td>Invitrogen</td><td>PN 35-1271</td><td>מהמחברים</td></tr><tr><td>ViralpowerTM תערובת אריזות&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 35-1275</td><td></td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה/ ליפופקטמין 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>Biochrom</td><td>A2912</td><td></td></tr><tr><td>קולגן-Type1&nbsp; Rat Tail BD</td><td>Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>אבקת DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>Art.Nr. 10338582</td><td></td></tr><tr><td>plitidepsin</td><td>Pharmamar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bortezomib</td><td>LKT Lab., Inc.</td><td>B5871</td><td></td></tr><tr><td>SPF-ביצי תרנגולת לבנות</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td></td><td>מופרות &nbsp; לבנה Leghorn &nbsp; ביצי עוף</td></tr><tr><td>סירות שקילה מפלסטיק</td><td>neoLab</td><td>Art.Nr. 1-1125</td><td>לתרבית ex-ovo</td></tr><tr><td>ריבוע פטרידיש (מכסים)</td> <td>Simport</td><td>D210-16</td><td>לתרבית ex-ovo</td></tr><tr><td>RIPA Buffer (10x)</td> <td>איתות תאים</td> #<td>9806</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאז טבליות מעכב</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>שלם מיני נטול EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP ELISA</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>AKR-121</td><td></td></tr><tr><td>Histocette II</td><td>Simport</td><td>M493-6</td><td></td></tr><tr><td>PFA&nbsp; 37%</td><td>Roth</td><td>7398.1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>אתנול אבסולוט</td><td>נורמאפור</td><td>20,821,321</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histol</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6640.4</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Sigma</td><td>A6330</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ SuperFrost</td><td>R. Langenbrinck&nbsp;</td><td>סעיף-מס' 1</td><td></td></tr><tr><td>Labor- u. Medizintechnik</td><td>03-0060</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation Wash Buffer 10x</td><td>DakoCytomation</td><td>Code-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 3006</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פתרון אחזור יעד (10x)&nbsp; pH 6,1</td><td>DAKO</td><td>Code-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 1699</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu שיבוט ASMA 1A4</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu CD138 שיבוט MI15</td><td>DAKO</td><td>M7228</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu שיבוט Vimentin V9</td><td>DAKO</td><td>M0725</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu שיבוט Desmin D33</td><td>DAKO</td><td>&nbsp; M0760</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Ki67&nbsp; שיבוט MIB-1&nbsp; &nbsp;</td><td>דאקו</td><td>&nbsp; M7240</td><td></td></tr><tr><td>עז ביוטינילית- אנטי עכבר IgG</td><td>Vector Laboratories Inc.</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain עלית ABC ערכת</td><td>וקטור מעבדות בע"מ</td># סט טאבלטים <td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>FAST DAB.</td><td>סיגמא ביוכימיקלים</td> <td># D4293</td><td></td></tr><tr><td>מאייר s תמיסת hamalaun</td><td>Merck</td><td>1,092,490,500</td><td></td></tr><tr><td>Roti Histokitt</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6638.2</td><td></td></tr><tr><td>ספסל עליון מיקרוטום סיבובי</td><td>Thermo Electron, Shandon Finesse ME +</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>תחנת הטמעת רקמות</td><td>Leica, TP1020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חממת ביצים</td><td>Grumbach&nbsp;</td><td>BSS160</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו המצויד במצלמה דיגיטלית מחוברת (אולימפוס E410) ואור קר גמיש&nbsp;</td><td>אולימפוס, SZX10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אולטרה טורקס&nbsp;</td><td>הומוגנייזר</td> <td>IKA T10</td><td></td></tr></tbody></table>

הקמת מודל xenograft מיאלומה נפוצה אדם בעוף לחקר צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

מיאלומה נפוצה (MM), מחלה ממארת של תאי פלזמה, נותרת חשוכות מרפא ותרופות חדשניות נדרשות כדי לשפר את הפרוגנוזה של חולים. בשל חוסר microenvironment העצם וגורמי גדילה אוטומטי / אוטוקריני תאי MM אנושיים קשים לטפח. לכן, יש צורך דחוף בהקמה נכונה במבחנה ובמערכות תרבות vivo ללמוד את הפעולה של תרופות חדשניות בתאי MM אנושיים. כאן אנו מציגים מודל לגדל תאי מיאלומה נפוצים אנושיים בסביבת 3D מורכבת במבחנת in vivo. שורות תאי MM OPM-2 וRPMI-8226 היו transfected להביע GFP transgene ועובדו בנוכחות של תאי mesenchymal אנושיים וקולגן סוג אני מטריקס כspheroids תלת-ממדי. בנוסף, spheroids היה מורכב על קרום chorioallantoic (רמ&quot;א) של עוברי עופות וגידול היה פיקוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו. שני הדגמים מאפשרים המחקר של DRU הטיפולי החדשניGS בסביבת 3D מורכבת והכימות של מסת התאים הסרטניים לאחר הומוגניזציה של שתלים בGFP-ELISA transgene הספציפי. יתר על כן, תגובות angiogenic של המארח והפלישה של תאי גידול לרקמות מארח subjacent יכולות להיות במעקב יומי על ידי מיקרוסקופ סטריאו ונותחו על ידי מכתים immunohistochemical נגד תאי גידולים בבני אדם (קי-67, CD138, vimentin) או תאי ציור קיר מארח מכסים כלי דם (Desmin / ASMA). לסיכום, מערכת onplant מאפשרת לימוד צמיחת תאי MM ואנגיוגנזה בסביבת 3D מורכבת ומאפשרת הקרנה לתרכובות טיפוליות חדשניות מיקוד הישרדות והתרבות של תאי MM.

בניתוח מבחנה של תרכובות יעד במבחני אליפטית מיאלומה נפוצה 3D בשל המגבלה של תאי culturing MM אנושיים ראשוניים במבחנה הקמנו מודלים תרבות במבחנה חדשים 3D עבור שורות תאים אנושיות MM עושים שימוש במטריקס צמיחה ותאי mesenchymal תומכים עיקריים אנושיים ממח עצם (איור 1 א &#39;, ב&#39;). שורות תאים המהונדס MM EGFP לאפשר הדמיה וכימות של מסת גידול MM לאחר צמיחת 3D בs...

תאים אנושיים מסוג מיאלומה נפוצה (MM) דורשים מייקרו-הסביבה התומכת של תאי mesenchymal ורכיבי מטריצה ​​תאיים להישרדות ושגשוג. הקמנו in vivo מודל עובר עוף עם תאי מיאלומה וmesenchymal אדם engrafted ללמוד השפעות של תרופות לסרטן על צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה.

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להקים מודל in vivo של עובר תרנגולת עם השתלה של תאי מילומה ותאי מזנכימה אנושיים, על מנת לחקור את השפעותיהם של תרופות לסרטן על גדילת הגידול, פלישתו ותהליכי אנגיוגנזה. מטרה זו מושגת על ידי יצירת תאי מילומה מרובה אנושיים טרנסגניים לצורך ניתוח במודלים תלת-ממדיים in vitro ו-in vivo. התאים עוברים טרנספקציה באמצעות לנטי-וירוס המספק GFP לצורך ויזואליזציה ועמידות לבלאסטין לצורך סלקציה של התאים שעברו טרנספקציה.כשלב שני, וירואידים בתלת-ממד. בעזרת התאים שעברו טרנספקציה, נוצרים תאים מזנכימליים ומטריצה חוץ-תאית, המאפשרים סריקה רחבה של תרופות אנטי-סרטניות בסביבת in vitro תלת-ממדית מורכבת. לאחר מכן, גידול תלת-ממדי.ניתן לגדל PHE in vivo בעוברים של תרנגולות כדי לבחון השפעות של תרופות חדשניות על צמיחת גידולים, פלישה ואנגיוגנזה. בסופו של דבר, ניתן לתעד את גודל הגידול ואת התגובות האנגיוגניות מדי יום ולאחר ההדרה. ניתן לבחון את הגידולים באמצעות GFP, Eliza ואימונוהיסטוכימיה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מודלים של השתקת קסנוגרפט (xenograft), הוא היכולת של ECX לטפל ולדגם גידולים אנושיים. תאי גידול אנושיים, יחד עם תאי תמיכה אנושיים ומרכיבי מטריצה חוץ-תאית, יכולים לגדול in vivo בעוברים של תרנגולות שעדיין חסרים תגובות חיסוניות אדפטיביות. שיטה זו יכולה לסייע בפיתוח טיפולים חדשניים ולאפשר סריקה פרה-קלינית מהירה עבור הטיפול בחולים הסובלים ממיאלומה נבובת.ההדגמה הוויזואלית של שיטה זו היא קריטית, מאחר שתאי מיאלומה מרובה אנושיים עוברים אפופטוזיס בקלות עקב סטרס, ועוברים של דגים עלולים למות כאשר הם אינם מטופלים נכון או בשל תנאי תרבית Ex vivo שאינם הולמים. את הפרוצדורה וכל השלבים הקריטיים שלה תדגים קורנליה, טכנאית מנוסה מהמעבדה שלנו. עבור פרוטוקול זה, הכינו תרביות של שורות תאי מיאלומה מרובה, OPM 2 RPMI 8 2 2 6, ותאי גזע מזנכימליים אנושיים ממח העצם. דגרו את התאים באופן רגיל במדיום מועשר בהתאם לפרוטוקול הכתוב. בצעו טרנספקציה למיליון תאי מיאלומה מרובה עם 100,000 חלקיקים לנטי-ויראליים.בפלטת 24 בארות עם מצע גידול מלא לאחר שלושה ימים, התחילו בברירה של תאים שעברו טרנספקציה על ידי הוספה של 2 µg של blastin לכל 1 mL של מצע תרבית, או השתמשו ב-500 µL של neomycin לכל 1 mL עבור lentivirus EGFP זמין מסחרית. לאחר שבועיים של ברירה, חפשו מקבצי תאים המבטאים EGFP. אספו מקבצי תאים צפים או דבקים על ידי השעייה ระגובה שלם בתוך מבחנה לצנטריפוגה; רספו את תאי ה-D-E-G-F-P ב-1000 ×g למשך חמש דקות והרחיבו אותם כקווי תת-משנה. לאחר הברירה וההפצה של תאי מילומה מרובה המבטאים GFP, בדקו תמיד את יכולתם לפני השימוש בהם לניסויים נוספים.כדי להתחיל, קהילו תמיסת קולגן מסוג 1 ו-10 XDMM על קרח. לאחר הקירור, ערבבו נפח של אחד למאה של מצע 10 X-D-M-E-M לתוך תמיסת הקולגן. לאחר מכן, הוסיפו נתרן הידרוקסיד 0.2 נורמלי בטיפות כדי לנטרל את התמיסה ל-pH של 7.4.שמרו את התמיסה על קרח ואשרו את ה-pH באמצעות סרט בדיקה. לאחר מכן, ערבבו את מקווי התאים של המטומיה מרובה של המודל הטרנסגני עם התאים המזנכימליים האנושיים. כעת, סנטריפוגו את תערובת התאים במבחנות של 15 milliliter במהירות של 1000 Gs למשך חמש דקות, השליכו את העלייה (supernatant) ובעזרת פיפטה P 1000 השהו מחדש את המשקע ב-milliliter אחד של תערובת הקולגן הקרה.בעזרת טיפ P 100 העבירו מיד מנות של 30 µL מהתערובת על פאראפין סטרילי. בתוך פלטת תרבית בעלת 24 בארות, המתינו 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C עד שהתערובת תעבור פולימריזציה ותיצור סטרואידים. לאחר מכן, כסו את הסטרואידים במיליליטר של מצע תרבית שהוכן עם טיפולים שונים.לדוגמה, ניתן להחיל תרופה בריכוזים שונים. לאחר 72 שעות של דגירה ב-37 °C, תיעדו את ה-PHE באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. לאחר מכן, בעזרת פינצטה רחבה ושטוחה, העבירו כל סטרואיד למבחנה כדי למדוד את ביטוי ה-GFP.כהכנה להליך זה, דגרו ביצי תרנגולת במדגרה לביצים בטמפרטורה של 37 °C ובלחות של 70% למשך שלושה ימים. לאחר מכן, פתחו את הביצים והעבירו את העוברים לסירות שקילה פלסטיק ריבועיות סטריליות בגודל 10 centimeter עם פלטות לתרבית תאים, וזאת כדי להשיג שיעורי הישרדות גבוהים יותר של עוברי תרנגולת בתרבית X OVO. השתמשו בסירות שקילה מפלסטיק במקום בצלחות תרבית רקמות של 10 centimeter.בנוסף, עקרים והספיגו ב-PBS למשך זמן המתנה לפני השימוש. המשיכו לדגור את הביצים X ovo למשך שישה ימים נוספים, במהלכם יתפתח ה-CAM. כעת הכינו תרחיץ של תאי מילומה מרובה ותאי גזע מזנכיים (PHE) כפי שבוצע בהליך הקודם, אך בלוח של שישה בארות, ולאחר מכן, בעזרת פינצטה, העבירו את הסטרואידים אל פני השטח הבלתי מטופלים של ה-cam, במרחק של כשני סנטימטרים מעוביו של עובר עוף בן תשעה ימים.מקמו ארבעה צמחים על כל עובר של תרנגולת. הניחו לעוברים בשיטת ex ovo עם הצמחים להישאר במדגרת הביצים למשך חמישה ימים. לאחר מכן, תיעדו את השת Transplantations (xenografts) באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי.לאחר התיעוד, השתמש במספרי עיניים ובפינצטה כדי להסיר את הש移植ים (xenografts) יחד עם מעט מרקמה סמוכה של ה-camp. כדי למדוד ביטוי של GFP או לבצע אנליזה אימונוהיסטוכימית, התחל בהעברה של כל ש移植 סטרואידי של מילומה מרובה או ש移植 חתוך לתוך 0.5 milliliters של RIPA עם מעכבי פרוטאז. לאחר מכן, השתמש בהומוגניזר על קרח כדי לערבב את הרקמות; לאחר ההומוגניזציה, הקפא והפשר את ההומוגנאטים באמצעות חנקן נוזלי ולאחר מכן במקלחת מים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.בצע זאת שלוש פעמים, לאחר מכן סנטריפוג את ההומוגנאטים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ב-12,000 G ושמור את העיליונים. לאחר מכן, דלל חלק מהעילוי ביחס של 1 ל-20 בבuffer של ערכת ה-ELISA. לאחר מכן, מדוד את רמות ה-GFP באמצעות נוגדנים אנטי-GFP ביוטיניליים בעזרת ערכה.התחל בקיבוע למשך לילה של השסנים (xenografts) שהוצאו בפרהפורמאלדהיד. למחרת, בצע דהידרציה וטמינה של השסנים המקובעים. ראשית, העבר אותם לקסטות.לאחר מכן, העבירו את הקסטות דרך סדרה מדורגת של אלכוהול. השאירו כל רחצה למשך שעה שלמה וסיימו את התהליך בקיבוע בפרפין. לאחר מכן, הכינו חתכים של חמישה מיקרון של השתלה זרה (xenografts) באמצעות מיקרוטום סיבובי שולחני, ואפו את חתכי הפרפין שנאספו על שקופיות זכוכית למשך לילה בטמפרטורה של 56 °C.ביום למחרת, בצעו דה-פרליזציה (de-parize) של החתכים באמצעות סדרת אלכוהול מדורגת יורדת עד למים מזוקקים פעמיים. השקופית צריכה להישאר בכל אמבטיה למשך 10 דקות בלבד. כעת עקבו אחר הפרוטוקול הכתוב לדגירה עם הנוגדי הפרמריים והשניוניים המתאימים, ובצעו זיהוי קולורימטרי עם אנזים ותסריף (substrate). לאחר הצביעה בנוגדנים, בצעו צביעה נגדית עם המטין והצמידו את החתכים באמצעות מדיום הרכבה סינתטי.שתי שורות תאים של מיאלומה נשריה המבטאות EGFP הוקמו וגודלו למשך שלושה ימים בנוכחות התרופה Bortezomib וסטרואידים, ולאחר מכן תאי הגידול נצפו באמצעות ביטוי של GFP במיקרוסקופ פלואורסצנציה סטריאוסקופי.מסת תאי הגידול לאחר הטיפול התרופתי נמדדה לאחר הומוגניזציה של PHE ומדידת תכני EGFP באמצעות A GFP Eliza. בניסוי אחר, עוברים של תרנגולות בני שלושה ימים תורגדו ex ovo למשך שישה ימים. ביום התשעי, הוקשרו PHE של תאי מילומה מרובה.ארבעה השתלה של צמחים חוברו לכל עובר. החומר המטרה bortezomib הוחל באופן מקומי בריכוז של 1 mol לאחר חמישה ימים; בצמחים המהשואלים נוצרו גידולים בהשוואה לבקרה. bortezomib עיכב את צמיחת תאי מילומה מרובה בהשתלה, בהתבסס על הדמיה של מסת הגידול הפלואורסצנטית.ש transplanted graft בודד משלושה בעלי חיים שונים הוצא, עבר הומוגניזציה ולאחר מכן נמדד באמצעות GFP Eliza. בהשוואה לבקרות, רקמה שטופלה ב-bortezomib הכילה מסה משמעותית נמוכה יותר של תאי מיאלומה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד לבצע ניסויים להשתלת תאי סרטן הנחקרים בעוברי תרנגולות שגודלו ex over, במטרה לנתח את צמיחת הגידול, את הגנזה ואת הפלישתו לרקמת המאכסן לאחר התפתחותו.טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום המיילומה המרובה לבחון תרכובות או תרופות חדשניות באורגניזם מודל הנוח לטיפול, דבר ההכרחי לבדיקות פרה-קליניות של תרופות.

establishment-human-multiple-myeloma-xenograft-model-chicken-to-study

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

באמצעות PCR כמותי, אנו מדגימים כיצד המודל ומבוססת חומוס CAM ניתן להשתמש כדי לנתח את כמותית גרורות של תאים סרטניים אנושיים לאיברים רחוקים.

ניתוח כמותי של גרורות סרטן באמצעות דגם העובר העופות

סרטון זה מדגים את ההליך של הזרקה תוך ורידית של תאים סרטניים לתוך כלי הדם של קרום כוריואלנטואי תרנגולת כדי ליצור מודל גרורות סרטניות CAM. התאים המוזרקים יוצרים בסופו של דבר מושבות מפוזרות של תאים חד-סרטניים, מה שמאפשר לחקור פלישה וגרורות של סרטן.

הזרקה תוך ורידית של תאים סרטניים לתוך כלי הדם של קרום כוריואלנטואי עוף: הליך להקמת מודל סרטן קרום כוריואלנטואי לחקר פלישה לסרטן וגרורות

xenografts גידול האנושי בעכברים עם מערכת חיסון חלשים הם כלים רבי ערך כדי ללמוד ביולוגיה בסרטן. פרוטוקולים ספציפיים כדי ליצור xenografts תת עורי וintrahepatic מתאי אנושיים hepatocellular קרצינומה או שברי גידול מתוארים. התחדשות כבד הנגרמת על ידי כריתה חלקית בעכברי נמען מוצגת כאסטרטגיה כדי להקל על קליטתם intrahepatic.

דור של תת עורי וintrahepatic אדם xenografts קרצינומה hepatocellular בעכברים עם מערכת חיסון חלשים

הטכניקה המבוססת לחסן xenografts orthotopic פולשנית העיקרית לסרטן שלפוחית ​​השתן דורשת laparotomy והתגייסות של שלפוחית ​​השתן. הליך זה גורם תחלואה משמעותית בעכברים, הוא מאתגר מבחינה טכנית ודורש זמן רב. לפיכך, אנו פיתחנו דיוק גבוה, בגישה מלעורית ניצול הנחיית אולטרסאונד.

פולשנית הקמת Murine Orthotopic שלפוחית ​​השתן xenografts

הממברנה הכוריואלנטואית של הגוזל (CAM) היא חסרת חיסון ובעלת כלי דם גבוהים, מה שהופך אותה למודל טבעי in vivo של צמיחת גידול ואנגיוגנזה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה אמינה לגידול גידולי קרצינומה תלת מימדיים של הכבד (HCC) באמצעות בדיקת CAM.

<em&gt; באוב</emAssay&gt; אפרוח chorioallantoic ממברנה (CAM) כמודל xenograft יעיל של Hepatocellular Carcinoma

סרטן הערמונית הוא הגורם השני בשכיחותו למקרי מוות הקשורים לסרטן בארצות הברית. מודל סרטן אורתוטופי מספק גישה שימושית להבנת הביולוגיה של סרטן הערמונית ולהערכת היעילות של משטרי טיפול. פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים הדרושים להקמת מודל עכבר אורתוטופי לסרטן הערמונית.

דגם Murine Orthotopic פרה-קליני של סרטן ערמונית האדם

ברור גרורות תא כליות קרצינומה של תאים היא מחלה ללא מודל בעל חיים כולל לחקירה יסודית מראש. פרוטוקול זה ממחיש שני מודלים של בעלי חיים חדשניים עבור המחלה: מודל העכבר המושתל אורתולמריחה ומודל ממברנה של עוף כוראלואלי, שניהם הפגינו גרורות בריאות הדומה למקרים קליניים.

השוואת הכליה גרורות תא כליות קרצינומה של תא מודל הוקמה בתוך כליה העכבר על עוף כוראולאלי ממברנה

אנו מציגים את המודל ממברנה העוף כוראואליאלי כחלופה, השתלה שולחן, במודל vivo עבור החרט של גינקולוגית ואורולוגית תאים לסרטן וגידולים הנגזר החולה.

שימוש בקרום כוראלאלי ממברנה במודל Vivo כדי ללמוד גינקולוגית ואורולוגיים סרטן

זוהי שיטה יעילה לסנן מדכאים או נהגים של גרורות סרטן. תאים, המועברים בספריית ביטויים, מוזרקים לתוך כלי הקרום chorioallantoic עוף כדי ליצור מושבות גרורתיות. מושבות שיש להם ירידה או פולשניות מוגברת הם excised, מורחב, reinjected כדי לאשר פנוטיפ שלהם, ולבסוף, מנותח באמצעות רצף תפוקה גבוהה.

גילוי של רגולטורים גרורתיים באמצעות מודל ממברנה צ'יק תוך-ויאטואי מהיר וכמותי

פרוטוקול זה מתאר השתלת ביצית של תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה B ו-T (ALL) שמקורם בחולה, המתרחשת 4 ימים לאחר ההזרקה.

ב Ovo Xenografting של תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) שמקורם בחולה (PDX-ALL)

חקור מודל xenograft מיאלומה נפוצה אדם בעוף לחקר צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה. שיטה זו מאפשרת סינון מעבדתי מהיר של תרופות נוגדות סרטן בסביבה תלת-ממדית מורכבת.

הקמת מודל xenograft מיאלומה נפוצה אדם בעוף לחקר צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה

גלה סרטונים נוספים