המטרה הכללית של הניסוי הבא היא ליישם מודל רדמנות (dormancy) זה in vitro כדי לחקור מנגנוים מולקולריים ותאיים, ולהעלות השערות לבדיקה במודלים in vivo מורכבים יותר מבחינה ביולוגית. מטרה זו מושגת על ידי גידול תאי סרטן שדיים עם ביטוי אסטרוגן בצלחות תרבית רקמה מקודדות פיברין בצפיפות קונגנית, שבה끔 האינטראקציות שלהם הן בעיקר עם התשתית ולא זו עם זו. כשלב שני, מצב רדמנות מופעל בחלק מהתאים עם ביטוי אסטרוגן, אשר נתמכים ונשמרים על ידי FGF two ופיברונקטין, המייצגים תאי סרטן שדיים במחול השקים.

בשלב הבא, המערכת מופרעת על ידי הוספה של נוגדנים, מעכבים, פפטידים או חומצות גרעיניות, וזאת כדי לשבש היבטים פנוטיפיים ומולקולריים שונים של התאים הרדומים ולקבוע את תפקידם בשמירה על המצב הרדום. התוצאות מראות את מספרן ומראהן של מושבות גדלות ורדומות, שהן תוצאה של טיפול בתאים שעברו אינקובציה עם FGF two על צלחות מצופות בפיברונקטין. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלה אילו מסלולי איתות, מולקולות היצמדות או מנגנונים מולקולריים ספציפיים אחרים אחראים לפיתוח ולשמירה על רדמנות בתאי סרטן שד תלויי אסטרוגן הממוקמים במיקרו-סביבה של מחולל השלשול (bone marrow).

כדי להתחיל, שאבו את מצע התרבית מלוחיות שהגיעו לכ-50% התמזגות (confluent) עם שבעת קווי התאים של CF ושטפו אותן עם PBS שחומם מראש. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של תמיסת trypsin EDTA בריכוז 0.25 המומסת במצע DMEM, high glucose ללא סרום עגל עוברי. דגרו את הלוחיות למשך אחת עד ארבע דקות ב-37 °C עד שהתאים יחלו להינתק.

ברגע שהתאים נפרדים מהצלחת ומתחילים להיווצר תמיסת תאים בודדים, פריסו גושי תאים שנותרו על ידי פיפוט למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות פיפט של שני מיליליטר. אם גושי תאים נותרו לאחר ארבע דקות של טיפול בטריפסין, השליכו את התאים והכינו תרבית חדשה; תאים שנותרים דבוקים זה לזה לאחר ארבע דקות יגרמו ככל הנראה לשגיאה בספירת מספר המושבות. צנטריפוגו את התאים שעברו טריפסין וסספנדו אותם בריכוז של 1,500 תאים למילליליטר במצע תרבית. השתמשו בפיפט של חמישה מיליליטר כדי לערבב את תמיסת התאים על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה, ספרו את התאים ואמתו כי התמיסה מורכבת בעיקר מתאים בודדים באמצעות סופר תאים אוטומטי.

ניתן לבצע זאת גם ידנית באמצעות תא ספירה תחת מיקרוסקופ ניגוד מופע (phase contrast). לאחר מכן, שאבו שלושה מיליליטר של ת сусפנזיית התאים ופזרו מיליליטר אחד לתוך שתיים מהבארות של פלטת 24 בארות מצופה בפיברונקטין בכל פעם. כדי למקסם את ההתפלגות המרחבית של התאים, הקפידו להעביר את הסוספנזיה בפיפט למרכז הבארה ואל תניעו את הפלטה עד שהתאים ישקעו וייהצמדו.

החזירו את תרחיף התאים שנותר לתערובת התאים הראשית ושוב, ערבבו את התאים לפני שאיבת שלושה מיליליטרים נוספים. הליך זה יפחית את השונות במספר התאים כיוון שהתאים שוקעים ללא הרף בשפופרת, ועבודת הפיפטה מהירה כדי לחלק את נפחי התאים הגדולים, שכן השארת התאים בתרחיף בטמפרטורת החדר ובריכוז CO2 הנוכחי תשנה את הפוטנציאל הקונגני שלהם; דגרו את התאים ב-37 degrees Celsius ו-5%CO2. זה נחשב ליום מינוס אחת.

בציר הזמנים של הניסוי. ביום אפס של הבדיקה, החליפו את המצע ב-1 mL של מצע טרי, או במצע טרי המכיל 10 ng/mL של fibroblast growth factor 2; מספר התאים הנמוך בבאר לאחר שישה ימים לא ישפיע באופן משמעותי על הרכב הנוטריאנטים או הציטוקינים ועל ה-pH של המצע המקורי.

ביום השלישי, הוסיפו 100 µL של תמיסה המכילה ריכוז של 10x מהריכוז הסופי המתוכנן של חומר משבש, כגון מעכב PI3K, LY 2 9 4 0 0 2, ביקורת שלילית LY 3 0 3 5 1 1 או ביקורת מצע, אל המיליליטר האחד של המצע שכבר נמצא בבארים, ותנו לתמיסות להתערבב על ידי דיפוזיה. החזירו את הפלטה לאינקובטור למשך שלושה ימים נוספים. ביום השישי, המסו 0.1% crystal violet בתוך תמיסה של 2% ethanol ו-10 mM sodium borate.

ב-pH 9, שאבו את המצע מהבארים והוסיפו מילליטר אחד של תמיסת סגול גבישי (crystal violet) לכל באר למשך 20 דקות. הגדירו תחנת שטיפה על ידי הנחת דלי קרח בכיור והזרמת מים רציפה אל הדלי; שטפו את הפלטות על ידי טבילה במים כאשר פתחי הבארים פונים כלפי מטה בזווית חדה אל תוך הדלי. לאחר הטבילה במים, הגו את הפלטה לזווית אופקית כך שפתחי הבארים יפנו כלפי מטה.

לאחר מכן, הטה את הפלטה חזרה לזווית חדה והוצא אותה בתנועה אחת עדינה וזורמת. חזור על פעולת הטבילה פעמיים או שלוש, עד שהמים בתחתית הבארות לא ייראו עוד ככחולים. לאחר מכן, הנח את הפלטות הפוך על מגבונים על משטח העבודה לייבוש למשך הלילה.

לאחר הייבוש, הניחו את הפלטה תחת מיקרוסקופ פאזה הפוך וספרו את מספר המושבות הצומחות והרדומות בכל באר. בהגדלה של 40x, ספרו מושבות בעלות יותר מ-30 תאים כמושבות צומחות, ומושבות בעלות 12 תאים או פחות כמושבות רדומות. מוצג כאן המראה הטיפוסי של מושבה צומחת ומושבה רדומה.

מושבות גדלות מכילות יותר מ-30 תאים ומושבות רדומות מכילות 12 תאים או פחות, שהם גדולים בהרבה מתאים גדלים, עם יחסי ציטופלזמה גרעין גבוהים, ללא הוספת FGF two לתרבית. המושבות מיוצגות בעיקר על ידי שיבוטים גדלים. בעוד שבנוכחות FGF two, הרוב המכריע של השיבוטים הם רדומים, ניתן להעריך גם את השפעתם של חומרים נוספים באמצעות המערכת. כאן, שני חומרים משבשים בריכוזים שנקבעו מראש הוספו לבארות ביום השלישי של בדיקת ה-Congenic.

האיור מייצג עיכוב מועדף של שיבוטים רדומים על ידי מעכב PI three kinase מסוג LY 2 9 4 0 2, אך היעדר השפעה של ביקרת השלילה LY 3 0 3 511. ניתן להשתמש בניסויים אלו כדי לסייע בהבנת הגורמים השולטים ברדמנות ובעמידות לטיפול. כאן, התאים הרדומים ששרדו לאחר טיפול במעכב PI i three kinase איבדו את המראה הפרוס שלהם, הפכו לדנדריטיים קטנים ונראו במצב של מצוקה.

לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להגיע להבנה טובה של האופן שבו ניתן להקים את הבדיקה הקונגנית זו לגידול תאים רדומים, כיצד להשפיע על התאים על ידי הוספת מעכבים ספציפיים או גורמים משבשים לאחר ביסוס הרדמיות, וכיצד לכמת את השפעתם של הגורמים המשבשים. ניתן להשתמש בבדיקה זו להערכת תוצאות כמותיות ואיכותיות כאחד, על ידי ספירת מושבות רדומות או מדידה של מספר כלשהו של אירועים אולטרה-מבניים, אימונו-פנוטיפיים או מולקולריים בתאים הרדומים והמושפעים. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.