כימות של הגנת עצבים וכלי דם בעקבות חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד וחלוף התיכון מוחין של עכברים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לכמת נוירופרוטקציה בעקבות התנייה מוקדמת של היפוקסיה חוזרת או RHP, על ידי מדידה סימולטנית של נפח האינפארקט ושל שלמות מחסום הדם-מוח. דבר זה מושג באמצעות חשיפת עכברים לתשע חשיפות היפוקסיות סטוכסטיות, הנבדלות הן במשך הן בעוצמה, כדי לספק הגנה נוירו-וסקולרית מפני שבץ מוחי. לאחר מכן משרה שבץ מוחי בעכבר, ולאחריו מוזרק Evan's blue.

Evan's blue נקשר באופן סלקטיבי לאלבומין ומאפשר את הכמות של פגיעה במחסום דם-מוח לאחר הקרבת החיה בעקבות ההזרקה. את המוח מוציאים וצובעים ב-TTC כדי לכמת את נפח השבץ (infarct volume). התוצאות מראות יתרונות נוירופרוטקטיביים של התנייה מוקדמת להיפוקסיה חוזרת בעכברים לאחר שבץ איסכמי.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון התניה היפוקסית בחשיפה אחת, הוא ש-RHP מייצרת הגנה עצבית למשך שמונה שבועות לפחות בעכברים. שיטת כימות כפולה זו יכולה לענות על שאלות מפתח במחקר של שבץ מוחי, כגון כיצד למדוד בו-זמנית נפחי אינפארקט ופריצה של מחסום הדם-מוח. אף על פי שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לספק תובנות לגבי שבץ איסכמי, ניתן להחיל את RHP גם על מצבים דלקתיים פרו-אינפלמטוריים אחרים במערכת העצבים המרכזית ובמערכות סיסטמיות. לתחילת העבודה, חלקו את העכברים לשתי קבוצות.

קבוצת ה-RHP, שחשופה ל-8% ו-11% חמצן, וקבוצת הביקורת, שחשופה ל-21% חמצן בו-זמנית, מסירות את מכסה המסנן העליון של כל כלוב ומניחות את הכלוב, כאשר בקבוקי המים והמזון נשארים במקומם, לתוך התאים המחוברים למיכלי החמצן המתאימים. סגרו ואבטחו את מכסה התא. פתחו את שסתום הגז הראשי של המיכלים וכווןו את הספיקה הראשונית לכל תא השראה לשני ליטרים לדקה או LPM.

לאחר חמש דקות של חשיפה, הפחית את קצב הזרימה ל-one LPM למשך שאר זמן החשיפה. עם סיום החשיפה, הפחית את הזרימה ל-zero LPM וסגור את שסתום הגז. עבור המכלים.

פתחו את מכסי התאים והחזירו את המכסה העליון עם המסנן לכל כלוב. הניחו את הכלובים בבית גידול סטנדרטי עד לחשיפה ההיפוקסית הבאה. רססו כל תא השראה עם חומר חיטוי ומסיר ריחות לאחר כל שימוש.

חשפו את עכברי ה-RHP ואת עכברי הביקורת באותו זמן ביום לאורך שבועיים של הפרוטוקול. לאחר מכן, בצעו חסימה זמנית של העורק המוחי האמצעי (A-T-M-C-A-O) כפי שמתואר בטקסט. יש לבצע הזרקה של EB כ-22 שעות לאחר הרפופרפוזיה, והיא צריכה להתרחב במחזור הדם במשך שעתיים לפני ההקרבה וצביעת NTTC.

הכינו את כמות ה-EB הדרושה להזרקה. לאחר מכן, שאבו את הכמות הרצויה בטמפרטורת החדר למזרק אינסולין של 0.3 cc. באמצעות מחט מדד 29, קבעו את העכבר באמצעות קובע בעל בסיס שטוח.

החזיקו את הזנב כך שהוריד הצדי (lateral vein) יהיה בחלקו העליון. ורידים צדיים ממוקמים משני צדי קו האמצע של הזנב. החזיקו את קצה הזנב כדי לשמור על יציבות העכבר לצורך ההזרקה.

החדירו את המחט אל תוך הווריד לעומק של כ-3 עד 5 מילימטרים. תוך כדי זהירות שלא לנקב את דופן הווריד, הזרקו את כל הצבע במשך דקה אחת. אם התמיסה נכנסת לווריד, התנגדות תהיה מינימלית בעת הפעלת לחץ על המזרק.

אשרו מתן מערכתי מוצלח של EB דרך הווריד באמצעות שינוי צבע מיידי בגפי הזנב ובעיני העכבר. הוציאו את המחט מהזנב והפעילו לחץ עדין בעזרת גזה נקייה כדי לעצור את הדימום. התחילו את תזמון המדידה.

כאשר עור העכבר נהיה כחול, יש להמתין שעתיים להסרט של ה-EB כדי שיחדור דרך מחסום הדם-מוח המוחלש. ביצוע הפרפוזיה וצביעת TTC יתבצעו 24 שעות לאחר הרפרפוזיה, 24 שעות לאחר T-M-C-A-O ושעתיים לאחר מתן ה-EB; יש להקריב את החיה באמצעות מינון יתר של isof fluorine בתא השראה קטן. יש להתחיל בפרפוזיה מיד לאחר ההקרבה כדי למזער אוטוליזה, המתחילה בהיעדרה של חמצן לאחר המוות.

קבעו במהירות את בעל החיים על פלטפורמת קלקר כאשר הזרועות מקובעות דרך הכפות.

הפעל את משאבת הפרפוזיה בקצב זרימה של 5 ml לדקה, באמצעות מזרק של 60 cc מלא ב-0.01 molar phosphate buffered saline או PBS קר מאוד, המחובר למחט עירוי עם כנפיים (winged infusion needle) בכיול 27 gauge. הכנס את קצה המחט לעומק של כ-0.5 cm לתוך החדרי השמאלי של הלב וגזור את העלייה הימנית. דם ורידי מדולל באופן פרוגרסיבי אמור לזרום החוצה מהעלייה במהלך הפרפוזיה, עד שיופיע דם ורידי חסר צבע. בצע פרפוזיה של 30 ml של 0.01 molar PBS דרך הלב.

בשלב הבא, הוסיפו חמישה מיליליטרים של תמיסת TTC לתוך 20 בקבוקי סינטילציה שקופים. מיד לאחר הפירפוזיה, בצעו עריפת ראש לבעלי החיים והוציאו את המוחות באמצעות מספריים קטנים ושפכטל במידת הצורך. ודאו שההמִיספירה הנגדית לעורק המוחה האמצעי החסום נראית חיוורת, ללא דליפה בולטת של EB או בצקת.

לאחר מכן, שפוך PBS לתוך תבנית אקרילית למוח, שנועדה להכנת חתכים קורונליים בעובי של 1.0 מילימטר של מוח עכבר. הנח את המוח בתבנית כאשר הצד הדורסלי פונה כלפי מעלה, ושפוך מיד PBS על המוח. שמור על המוח לח.

הסיר את הפקעות הריחיות על ידי הכנסת להב מפלדת אל-חלד, בעובי 0.21 millimeter, לחריץ השני מהצד הרוסטרלי של המטריצה. לאחר מכן, הסר את המוח הקטן על ידי הכנסת להב לחריץ הרביעי מהצד הקודאלי של המטריצה. הכנס להב לחריץ האמצעי מבין החריצים שנותרו במטריצה.

לאחר מכן, הכניסו את שאר הלהבים כך שיחלקו את הרקמה שנותרה לחצאים שווים, כדי להבטיח את פיזור הרקמה האחיד ביותר במהלך הפריסה. לאחר השחלת כל הלהבים, הוסיפו טיפה אחת או שתיים של PBS למוח כדי להרטיב אותו. לאחר מכן, הוציאו את הלהבים מהמטריקס one by one, החל מהאזור הרוסטרלי.

שמרו את שבע הפרוסות הראשונות לצורך אנליזת TTC. לאחר T-M-C-A-O, השתמשו במרית קטנה כדי להעביר בזהירות את הפרוסות מהלהב אל המבחנה המלאה ב-TTC. לאחר שכל החתכים נמצאים במבחנה, סגרו אותה במכסה והניחו אותה באמבט מים חמים עד שהחתכים יהפכו לוורודים.

סובב בעדינות את הבקבוק בתוך האמבט במידת הצורך כדי למנוע חפיפה של חתכים, דבר שעלול להוביל לצביעה לא אחידה. לאחר מכן, השליך את ה-TTC ושפוך תמיסת פאראפורמאלדהיד 4% אל תוך המבחנה כך שתכסה את חתכי המוח. פעולה זו מסיימת את התגובה הכימית של ה-TTC.

סדרו מיד את הפרוסות על גבי זכוכית של 1x3 אינץ' נקייה, והכווינו את הפרוסות מהחלק הרוסטרלי (קדמי) לכיוון הזנב בעת סידורן על השקופית. סרקו את השקופית. בעזרת סורק סטנדרטי, הגדירו רזולוציה של 600 DPI לפחות לצורך ניתוח התמונה.

ודאו ששם החיה וסרגל מידות מופיעים בתמונה הסרוקה. לבסוף, הפכו את השקופית וסרקו את הצד האחורי כדי להבטיח שכל הנתונים נאספו. RHP מפחית נפחי אינפארקט ב-46% בהשוואה לעכברי ביקורת, אך אין לו השפעה על נפיחות המיספירה כפי שעולה מנתוני ה-TTC באותם בעלי חיים.

RHP מפחית את פגיעת מחסום הדם-מוח כפי שהוגדרה על ידי דליפת Evans Blue מנורמלת להמיספרה המנוגדת; מוצגות צביגות TTC מייצגות הן מהקבוצה שטופלה ב-RHP והן מקבוצת הביקורת שנחשפה ל-21% oxygen. העכברים מוצגים עם נפחי האינפארקט התואמים ודליפת ה-Evans blue המפורטים תחת כל דגימה. Ipsilateral הוא ההמיספרה האיסכמית של המוח, ו-contralateral הוא הצד הבלתי פגוע של המוח.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להזריק Evan's blue כ-22 שעות לאחר ההיתוך (fusion) ולאפשר לו להסריג במשך שעתיים לפני הקרבת בעל החיים לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום המחקר הפרה-קליני של שבץ מוחי לבחון מנגנונים של הגנה אנדוגנית משבץ בעכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה ברורה כיצד למדוד את ההשפעה הנוירופרוטקטיבית של RHP באמצעות כימות כפול של שלמות מחסום הדם-מוח ונפחי השבץ (infarct volumes).