Name: כימות של הגנת עצבים וכלי דם בעקבות חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד וחלוף התיכון מוחין של עכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: למדו כיצד לכמת הגנת עצבים בעכברים לאחר חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד, באמצעות מדידה כפולה של נפח אינפארקט ושלמות מחסום דם-מוח. שיטה זו מסייעת לחוקרים להעריך אסטרטגיות נוירופרוטקטיביות בחקר שבץ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודה מיוחדת למעבדת Gidday על עבודתם בפיתוח פרוטוקול RHP, כמו גם למתקן המודלים הנוירולוגיים (UTSW) על הסיוע בניתוחי tMCAo. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מאיגוד הלב האמריקאי (AMS), מרכז האגרטי לפגיעות ותיקון מוח (UTSW; AMS), והקרן לחקר שיתוק ספסטי של מחוז אילינוי-מזרח איווה של קיוואניס אינטרנשיונל (JMG).

למחברים אין מה לחשוף.

חשיפה יחידה להיפוקסיה המערכתית (כלומר, 2 שעות של 11% O 2) בעכברים &quot;זמני&quot; מגנה על המוח מפני tMCAo, 29 כלומר התגובה אפיגנטיים לאתגר נפשית מראש חוסר חמצן הוא קצר-טווח, ואת הפנוטיפ הבסיס משוחזר ב ימים. מצגות חוזרות ונשנות של הגירוי נפשית מראש חוסר חמצן באופן דרמטי להאריך את משך הזמן של פנוטיפ neuroprotective. 6 מחקרים רבים הראו כי התדירות, עוצמה ומשך רכבת הגירוי חוזר על עצמו הם גורמים קריטיים של תגובה זו. לדוגמא, פשוט חוזר על אותה הע...

כגורם המוביל למוגבלות מבוגרים והגורם המוביל הרביעי של מוות, שבץ הוא אחת מדינות המחלה המתישות ביותר העומדות בפני האוכלוסייה הבוגרת בארצות הברית. מודלים של בעלי החיים 1 לשבץ לאפשר לחקירה ניסיונית של שיטות חדשות לצמצום פגיעת איסכמית ו שיפור התאוששות שבץ-פוסט. שדרת רומן אחד למחקר translational כזה נפשית מראש. אכשור קד הוא השימוש המכוון של גירוי נזק הלא-מנת להפחית את הנזק שמלאחר מכן, וחמורה יותר, פציעה. 2 נפשית מראש חוסר חמצן הוכח לייצר שינויי pleiotropic במוח המספקים הגנה מפני שבץ בשני in vivo ובניסויים במבחנה . 3 עם זאת, חשיפה יחידה להיפוקסיה מציעה רק neuroprotection לטווח קצר, וישכנע פחות מ -72 שעות של סובלנות נגד איסכמיה בעכברים בוגרים. 4 גם לאחר ארבעה שבועות של חשיפות יומיות 14 שעות להיפוקסיה hypobaric, לין ואח &#39;. FOund neuroprotection שספג רק לנפשי מראש אחד בשבוע. 5 חוזרים חוסר חמצן (RHP) מאופיין בסטיות אקראיות בתדירות, משך, ועוצמת חשיפות חוסר חמצן. בניגוד לאתגר נפשית מראש יחיד, RHP גורם פנוטיפ cerebroprotective שנמשך עד שמונה שבועות בעכברים. 6 RHP מופחת כרכי אוטם, מחסום דם-מוח הפרעה (BBB), דלקת של כלי דם, וdiapedesis יקוציט במשך שבועות לאחר חשיפת חוסר חמצן הסופית . RHP מופחת במיוחד דלקת במוח איסכמי על ידי הפחתה של תאי T, מונוציטים, ואוכלוסיות מקרופאג, תוך שמירה על אוכלוסיות תאי B בחצי כדור איסכמי. 7 למעשה, RHP מושרה פנוטיפ לדיכוי המערכת החיסונית בעכברים לפני כל פגיעה במערכת העצבים המרכזית, כולל שבץ. תאי B שטופל RHP המבודדים מעכברים בריאים שטופל RHP הציגו פנוטיפ אנטי דלקתי ייחודי, עם downregulation של שתי מצגת אנטיגן וייצור נוגדנים.ירידה כללית במנגנונים חיסוניים אדפטיבית פרו-דלקתיים גורמת RHP מתודולוגיה מצוינת לגרום לדיכוי חיסוני אנדוגני למחלות דלקתיות של מערכת העצבים המרכזית ספציפיות לא רק, אלא גם דגמי פציעה או מחלה מערכתיות הכוללים פתולוגיה פרו-דלקתית. RHP מפחית שני האוטם הבא חסימה חולפת אמצע מוחי עורק (tMCAo) נפח ושיבוש BBB. מודלים של בעלי חיים של שבץ, כגון tMCAo הנפוץ, לשפר באופן דרמטי את ההבנה של הפתופיזיולוגיה של שבץ, כמו גם את העיצוב של Neurotherapeutics היעיל יותר. ראשון שפותח על ידי אל קואיזומי et., בשנת 1986, 8 הליך tMCAo הוא שיטה נפוצה של גרימת שבץ במכרסמים ואחת מהשיטות המועדפות לחקירת הדלקת הבאה reperfusion. כשיטות לtMCAo להתפתח, השימוש עדכנית יותר של חוטים מצופים סיליקון לצמצם עוד יותר את הסיכון לדימום תת-עכבישים בהשוואה לדגמים אחרים 9,10 &lt;/ Sup&gt; ולשפר את האמינות, אם כי למרבה הצער tMCAo לעתים קרובות מייצר וריאציה רחבה בכמויות אוטם. 11-13 רוב המחקרים האלה להתוות אזורי אוטם בחלקים במוח עטרה על ידי צביעה עם כלוריד triphenyltetrazolium 2,3,5- (TTC), נחשב תקן זהב לכימות אוטם כי זה הוא דרך פשוטה וזולה כדי לייצר תוצאות חיות, לשכפול. TTC משמש כמצע של dehydrogenases הנוכחי במיטוכונדריה. כאשר פרוסות מוח נחשפות לפתרון TTC, TTC נלקח באופן סלקטיבי לתאים חיים שבו המוצר שלה שאינן מסיס בהפחתה, formazan, שוקע לצבע אדום עמוק במיטוכונדריה קיימא. בגלל תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ברקמה איסכמית, רקמה זו נשארה לבנה, המאפשרת להתמיינות של רקמות פגועות ובריאים. 14 RHP גם מפחית הפרעה BBB בחצי כדור איסכמי. 6 לכן, הכימות הכפול של שלמות BBB בתוך אותה בגשמים כמבוססים TTC נפח אוטם קביעות 15 היו לספק מידע שימושי על היעילות המלאה של הגנת אנדוגני, וקשרים סיבתיים אפשריים בין ההפרעה BBB ואוטם בבעלי חיים שלא טופלו ומטופלים. הזרם של דם היקפי באמצעות BBB שיבש, המשני לשבץ, מגביר אוכלוסיות יקוציט, ציטוקינים פרו-דלקתיים, סטרס חמצונים, בצקת vasogenic, ושינוי המורגי בחצי כדור איסכמי, סופו של דבר להגדיל את שיעורי זיהום ותמותה בחולים עם שבץ איסכמי . 16,17 שיטה נפוצה למדידת ההפרעה BBB במודלים של בעלי חיים היא דרך כימות של אוונס כחול דליפת צבע (EB) לתוך המוח. 15,18-21 EB נקשר באופן סלקטיבי לסרום אלבומין, חלבון כדורי (MW = 65 KDA) שלא לחצות את BBB בבעלי החיים ללא כל פגע. 22 בעקבות שבץ איסכמי, EB מחלחלת למוח, ומאיר ב620 ננומטר, המאפשרת למדידת צפיפות האופטית within perfused parenchyma נפצע. 22 הצפיפות האופטית היא ביחס ישר לחדירות של BBB כאשר EB כבר דהויה של כלי הדם בקליפת המוח שלאחר המוות על ידי זלוף transcardiac. עם העיבוד המיידי של מוח הצבעוני TTC בבעלי חיים עם ממשל EB, שני נפח האוטם ושיבוש BBB ניתן לכמת בצורה יעילה. יש לציין, עם זאת, כי פגיעה עצבית וההפרעה BBB אינם תהליכים מקבילים במוח השבץ-פוסט, 23,24 כך את הבחירה של זמן של הקרבה הוא שיקול חשוב. הפרוטוקול שלהלן מפרט את שיטת RHP, שיטת tMCAo גרימת חסימת עורקים זמנית שמודלי חסימות אמצע מוחי עורק בחולים אנושיים, ושיטות היסטולוגית הכפולה לקביעת נקודות קצה פציעת שבץ עצבית וכלי דם. TTC מודד מוות של תאים ונזק לרקמות מצטברות, המאפשר לכימות של כרך אוטם כוללUme, בעוד EB מספקת לכימות חצאי המוח של נזק BBB.

<table><tbody><tr><td>מדי זרימה, רגולטורים</td><td>VetEquip, Inc</td><td>הזמנה מיוחדת</td><td>ארבעה מדי זרימה מחוברים לצינורות PVC גמישים בגודל 6.0 מ"מ המתחברים ליציאת הכניסה בכל תא אינדוקציה עם מחבר נקבה מפלסטיק. מדי זרימה אלה מוברגים למוט מתכת בגודל 6.5 אינץ' x 1 אינץ' x 1 אינץ'. מוט מתכת זה מוברג למד לחץ MI-246-P עם שקע DISS. ניתן לחבר את מד הלחץ וציוד מד הזרימה הזה לכל בלון גז חדש באמצעות מפתח ברגים.</td></tr><tr><td>21% O2 tank</td><td>AirGas</td><td>OX USP200</td><td></td></tr><tr><td>11% O2 tank</td><td>AirGas</td><td>Specialty הזמנה</td><td></td></tr><tr><td>8% O2 tank&nbsp;</td><td>הזמנת</td><td></td> <td>AirGas</td> Specialty</tr><tr><td>תאי אינדוקציה 15 ליטר</td><td>VetEquip</td><td>941454</td><td></td></tr><tr><td>Moor Laber Dopper Flow&nbsp;</td><td>מור אינסטרומנטס&nbsp;</td><td>moorVMS-LDF1-HP</td><td>בדיקה בקוטר 0.8 מ"מ&nbsp;</td></tr><tr><td>תאורה בעוצמה גבוהה&nbsp;</td>מיקרוסקופ סטריאו זום <td>NI-150</td><td></td> <td>של ניקון</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>NIkon</td><td>SMZ800</td><td>ניתן להשתמש במיקרוסקופים כירורגיים אחרים.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kent Scientific Right Temperature CODA</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>הופסק</td><td>התחליף המומלץ הוא PhysioSuite עם ניטור טמפרטורה RightTemp ובקרה הומותרמית (Kent Scientific, #PS-RT).</td></tr><tr><td>חממת Hovabator</td><td>2362-E</td><td>של סטרומברג</td><td>הדגם שלנו הוא 2362N. 2362E הוא דגם מאוחר יותר וכולל תרמוסטט אלקטרוני.</td></tr><tr><td>מערכת הרדמה V010&nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>901807</td><td>כולל: צינור חמצן בלחץ גבוה של עשרה רגל, מסגרת, מד זרימה, מכלול שטיפת חמצן, וופורייזר, מעגל נשימה, תא, קונוסים, צינורות פינוי גז פסולת ושני מסנני VapoGuard</td></tr><tr><td>250 מ"ל איזופלורן&nbsp;</td><td>באטלר שיין</td><td>NDC-11695</td><td></td></tr><tr><td>D-6 וטרינר לקצץ גוזם אלחוטי לבעלי חיים&nbsp;</td><td>אנדיס&nbsp;</td><td>#23905</td><td>להבים חלופיים זמינים מ-Andis (#23995)</td></tr><tr><td>Betadine&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>19-898-867&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>טיפים</td><td>למוכרים מרובים&nbsp;</td><td>מספר קטלוגי אינו זמין&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>רפידות גזה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>67622</td><td></td></tr><tr><td>וילון כירורגי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>GM300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תפרי משי&nbsp;</td><td>התמחויות כירורגיות Look/Div</td><td>SP115</td><td></td></tr><tr><td>תפרי ניילון</td><td>Look/Div התמחויות כירורגיות</td><td>SP185</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #5 מלקחיים (2)&nbsp;</td><td>כלים מדעיים&nbsp;</td><td>11251-35</td><td>זווית 45&deg;</td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td>כלים מדעיים עדינים &nbsp;</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"מ Vannas</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INS600177</td><td>להב ישר</td></tr><tr><td>הרטמן המוסטטים&nbsp;</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>13002-10</td><td></td></tr><tr><td>חוטי הסתרה</td> חוטי <td>הזמנה מיוחדים</td> של <td>אוניברסיטת וושינגטון</td><td>מצופים סיליקון באוניברסיטת וושינגטון ומסופקים למתקני UTSW תמורת תשלום.</td></tr>נייר סינון <tr><td>אוונס כחול</td><td>סיגמא אלדריץ'</td><td>E2129-10G</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריך</td><td>WHA1001150</td><td>150 מ"מ, עיגולים, דרגה 1&nbsp;</td></tr><tr><td>סירות שקילה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-202-101</td><td>קוטר 2.5 אינץ'</td></tr><tr><td>0.9% הזרקת נתרן כלורי USP&nbsp;</td><td>בקסטר פרמצבטיקה&nbsp;</td><td>2B1321</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אינסולין 0.3 סמ"ק עם מחט מד 29</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>מסנן תחתון שטוח&nbsp;</td><td>בריינטרי סיינטיפיק&nbsp;</td><td>FB&nbsp; M</td><td>קוטר 2.0 אינץ'</td></tr><tr><td>TTC</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7.4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>מוכרים מרובים&nbsp;</td><td>מספר קטלוגי אינו זמין&nbsp;</td><td>צינורות נצנוץ עם TTC עשויים להיות מוחזקים ידנית מתחת למים חמים זורמים כחלופה לאמבט המים.</td></tr><tr><td>לוח קלקר</td><td>מוכרים מרובים&nbsp;</td><td>מספר קטלוגי אינו זמין&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מזרקים גדולה</td><td>PumpSystems Inc</td><td>P-SYRKIT-LG</td><td></td></tr><tr><td>משאבת זלוף</td><td>PumpSystems Inc</td><td>NE-300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 60 סמ"ק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC9203256</td><td></td></tr><tr><td>סט עירוי מכונף 27 מד</td><td>Kawasumi Laboratories, Inc</td><td>D3K1-25G 1</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון נצנוץ 20 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-367-126</td><td></td></tr><tr><td>מרית נירוסטה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-373-25A</td><td></td></tr><tr><td>אלטו אקריליק 1.0 מ"מ מוח עכבר, CellPoint עטרה</td><td> מדעי&nbsp;</td><td>מספר קטלוגי אינו זמין&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>להבי נירוסטה 0.21 מ"מ, 25 pk</td><td>CellPoint Scientific&nbsp;</td><td>מספר קטלוגי אינו זמין&nbsp;</td><td>להבי קריוסטט לשימוש חוזר הם אלטרנטיבה זולה.</td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה&nbsp;</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ סופרפרוסט&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HP Scanjet G4050</td><td>מוכרים מרובים&nbsp;</td><td>מספר קטלוגי אינו זמין&nbsp;</td><td>סורקים מסחריים אחרים מתאימים לשלב זה בפרוטוקול.</td></tr><tr><td>תמונהJ&nbsp;</td>המספר הקטלוגי <td>של המכון הלאומי לבריאות</td><td>אינו זמין&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>איזון אנליטי</td><td>מטלר טולדו&nbsp;</td>תנור קומפקטי <td>מדויק XSE 205U</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td>PR305225M</tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל (Eppendorfs)</td><td>דנוויל סיינטיפיק&nbsp;</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP228-100</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-9</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר מיקרופלייט אפוק&nbsp;</td><td>ביוטק&nbsp;</td><td>מספר קטלוגי אינו זמין&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות של הגנת עצבים וכלי דם בעקבות חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד וחלוף התיכון מוחין של עכברים

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

מודלים של בעלי חיים ניסיוניים של שבץ הם כלים רבות ערך להבנת הפתולוגיה שבץ ופיתוח אסטרטגיות טיפול יעילים יותר. פרוטוקול 2 שבוע לנפשי מראש חוסר חמצן חוזר (RHP) גורם הגנה לטווח ארוך מפני פגיעה במערכת עצבים מרכזית (CNS) במודל של עכברים של שבץ איסכמי מוקדי. RHP מורכב של 9 חשיפות סטוכסטיים להיפוקסיה שמשתנות בשני המשך (2 או 4 שעות) והעצמה (8% ו -11% O 2). RHP מפחית כרכי אוטם, הפרעה דם-מוח מכשול (BBB), ותגובה הדלקתית השבץ-פוסט לשבועות בעקבות החשיפה האחרונה להיפוקסיה, המצביע על אינדוקציה ארוכת טווח של פנוטיפ CNS-מגן אנדוגני. המתודולוגיה לכימות הכפול של אוטם נפח ושיבוש BBB היא יעילה בהערכת הגנת עצבים וכלי דם בעכברים עם RHP או neuroprotectants המשוער אחר. עכברים השוויצריים וובסטר מבוגר גברים היו מותנים מראש על ידי RHP או חשיפות משך-שווה ערך ל 21% O <sub&gt; 2 (אוויר חדר כלומר). חסימת 60 דקות חולפת אמצע מוחי עורק (tMCAo) הייתה מושרה 2 שבועות בעקבות חשיפת חוסר חמצן האחרונה. שתי החסימה וreperfusion אושרו על ידי Flowmetry דופלר לייזר transcranial. עשרים ושתיים שעות לאחר reperfusion, אוונס הכחול (EB) הייתה בהזרקה לוריד דרך הזרקה לוריד זנב. 2 שעות מאוחר יותר, בעלי החיים הוקרבו על ידי סעיפי יתר ומוח isoflurane הוכתמו כלוריד 2,3,5- triphenyltetrazolium (TTC). כרכי אוטמים אז היו לכמת. בשלב הבא, EB הופקה מהרקמה מעל 48 שעות כדי לקבוע הפרעה BBB לאחר tMCAo. לסיכום, RHP הוא פרוטוקול פשוט שניתן לשכפל, עם עלות מינימאלית, כדי לגרום להגנה לטווח ארוך אנדוגני עצבים וכלי דם מפציעה שבץ בעכברים, עם פוטנציאל translational למצבי מחלה פרו-דלקתיים אחרים המבוססים על מערכת העצבים המרכזית ומערכתיים.

<html> מחקר זה כלל 25 עכברי זכרים השוויצריים וובסטר שהיו 10 שבועות של גיל בתחילת האקראית לRHP (n = 10) או 21% O 2 קבוצות (n = 15). שבועיים לאחר חשיפת RHP הסופית, ניתוחים בוצעו, עם קבוצות שהתעוורו ומתאזנים בין ימים. בעקבות tMCAo, עכבר 1 מת במהלך התאוששות שלאחר ניתוח ועכבר 1 לא נכלל במחקר, כי זה לא עומד בקריטריון CBF reperfusion. שני העכברים נכללו היו מקבוצת 21% O 2. בהתאם להנחיות לאסוף נוסעות, 28 טבלה 2 מראה פרמטרים כירורגית. כרכים עקיפים אוטם, נפיחו...

פרוטוקול זה מתאר התניה מוקדמת היפוקסית חוזרת ונשנית, או חשיפות קצרות להיפוקסיה מערכתית המפחיתות את נפחי האוטם והפרעה במחסום הדם-מוח בעקבות חסימה חולפת של עורק המוח האמצעי בעכברים. הוא גם מפרט כימות כפול של נפח האוטם והפרעה במחסום הדם-מוח לאחר שבץ מוחי כדי להעריך את היעילות של הגנה נוירו-וסקולרית.

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לכמת נוירופרוטקציה בעקבות התנייה מוקדמת של היפוקסיה חוזרת או RHP, על ידי מדידה סימולטנית של נפח האינפארקט ושל שלמות מחסום הדם-מוח. דבר זה מושג באמצעות חשיפת עכברים לתשע חשיפות היפוקסיות סטוכסטיות, הנבדלות הן במשך הן בעוצמה, כדי לספק הגנה נוירו-וסקולרית מפני שבץ מוחי. לאחר מכן משרה שבץ מוחי בעכבר, ולאחריו מוזרק Evan's blue.Evan's blue נקשר באופן סלקטיבי לאלבומין ומאפשר את הכמות של פגיעה במחסום דם-מוח לאחר הקרבת החיה בעקבות ההזרקה. את המוח מוציאים וצובעים ב-TTC כדי לכמת את נפח השבץ (infarct volume). התוצאות מראות יתרונות נוירופרוטקטיביים של התנייה מוקדמת להיפוקסיה חוזרת בעכברים לאחר שבץ איסכמי.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון התניה היפוקסית בחשיפה אחת, הוא ש-RHP מייצרת הגנה עצבית למשך שמונה שבועות לפחות בעכברים. שיטת כימות כפולה זו יכולה לענות על שאלות מפתח במחקר של שבץ מוחי, כגון כיצד למדוד בו-זמנית נפחי אינפארקט ופריצה של מחסום הדם-מוח. אף על פי שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לספק תובנות לגבי שבץ איסכמי, ניתן להחיל את RHP גם על מצבים דלקתיים פרו-אינפלמטוריים אחרים במערכת העצבים המרכזית ובמערכות סיסטמיות. לתחילת העבודה, חלקו את העכברים לשתי קבוצות.קבוצת ה-RHP, שחשופה ל-8% ו-11% חמצן, וקבוצת הביקורת, שחשופה ל-21% חמצן בו-זמנית, מסירות את מכסה המסנן העליון של כל כלוב ומניחות את הכלוב, כאשר בקבוקי המים והמזון נשארים במקומם, לתוך התאים המחוברים למיכלי החמצן המתאימים. סגרו ואבטחו את מכסה התא. פתחו את שסתום הגז הראשי של המיכלים וכווןו את הספיקה הראשונית לכל תא השראה לשני ליטרים לדקה או LPM.לאחר חמש דקות של חשיפה, הפחית את קצב הזרימה ל-one LPM למשך שאר זמן החשיפה. עם סיום החשיפה, הפחית את הזרימה ל-zero LPM וסגור את שסתום הגז. עבור המכלים.פתחו את מכסי התאים והחזירו את המכסה העליון עם המסנן לכל כלוב. הניחו את הכלובים בבית גידול סטנדרטי עד לחשיפה ההיפוקסית הבאה. רססו כל תא השראה עם חומר חיטוי ומסיר ריחות לאחר כל שימוש.חשפו את עכברי ה-RHP ואת עכברי הביקורת באותו זמן ביום לאורך שבועיים של הפרוטוקול. לאחר מכן, בצעו חסימה זמנית של העורק המוחי האמצעי (A-T-M-C-A-O) כפי שמתואר בטקסט. יש לבצע הזרקה של EB כ-22 שעות לאחר הרפופרפוזיה, והיא צריכה להתרחב במחזור הדם במשך שעתיים לפני ההקרבה וצביעת NTTC.הכינו את כמות ה-EB הדרושה להזרקה. לאחר מכן, שאבו את הכמות הרצויה בטמפרטורת החדר למזרק אינסולין של 0.3 cc. באמצעות מחט מדד 29, קבעו את העכבר באמצעות קובע בעל בסיס שטוח.החזיקו את הזנב כך שהוריד הצדי (lateral vein) יהיה בחלקו העליון. ורידים צדיים ממוקמים משני צדי קו האמצע של הזנב. החזיקו את קצה הזנב כדי לשמור על יציבות העכבר לצורך ההזרקה.החדירו את המחט אל תוך הווריד לעומק של כ-3 עד 5 מילימטרים. תוך כדי זהירות שלא לנקב את דופן הווריד, הזרקו את כל הצבע במשך דקה אחת. אם התמיסה נכנסת לווריד, התנגדות תהיה מינימלית בעת הפעלת לחץ על המזרק.אשרו מתן מערכתי מוצלח של EB דרך הווריד באמצעות שינוי צבע מיידי בגפי הזנב ובעיני העכבר. הוציאו את המחט מהזנב והפעילו לחץ עדין בעזרת גזה נקייה כדי לעצור את הדימום. התחילו את תזמון המדידה.כאשר עור העכבר נהיה כחול, יש להמתין שעתיים להסרט של ה-EB כדי שיחדור דרך מחסום הדם-מוח המוחלש. ביצוע הפרפוזיה וצביעת TTC יתבצעו 24 שעות לאחר הרפרפוזיה, 24 שעות לאחר T-M-C-A-O ושעתיים לאחר מתן ה-EB; יש להקריב את החיה באמצעות מינון יתר של isof fluorine בתא השראה קטן. יש להתחיל בפרפוזיה מיד לאחר ההקרבה כדי למזער אוטוליזה, המתחילה בהיעדרה של חמצן לאחר המוות.קבעו במהירות את בעל החיים על פלטפורמת קלקר כאשר הזרועות מקובעות דרך הכפות.הפעל את משאבת הפרפוזיה בקצב זרימה של 5 ml לדקה, באמצעות מזרק של 60 cc מלא ב-0.01 molar phosphate buffered saline או PBS קר מאוד, המחובר למחט עירוי עם כנפיים (winged infusion needle) בכיול 27 gauge. הכנס את קצה המחט לעומק של כ-0.5 cm לתוך החדרי השמאלי של הלב וגזור את העלייה הימנית. דם ורידי מדולל באופן פרוגרסיבי אמור לזרום החוצה מהעלייה במהלך הפרפוזיה, עד שיופיע דם ורידי חסר צבע. בצע פרפוזיה של 30 ml של 0.01 molar PBS דרך הלב.בשלב הבא, הוסיפו חמישה מיליליטרים של תמיסת TTC לתוך 20 בקבוקי סינטילציה שקופים. מיד לאחר הפירפוזיה, בצעו עריפת ראש לבעלי החיים והוציאו את המוחות באמצעות מספריים קטנים ושפכטל במידת הצורך. ודאו שההמִיספירה הנגדית לעורק המוחה האמצעי החסום נראית חיוורת, ללא דליפה בולטת של EB או בצקת.לאחר מכן, שפוך PBS לתוך תבנית אקרילית למוח, שנועדה להכנת חתכים קורונליים בעובי של 1.0 מילימטר של מוח עכבר. הנח את המוח בתבנית כאשר הצד הדורסלי פונה כלפי מעלה, ושפוך מיד PBS על המוח. שמור על המוח לח.הסיר את הפקעות הריחיות על ידי הכנסת להב מפלדת אל-חלד, בעובי 0.21 millimeter, לחריץ השני מהצד הרוסטרלי של המטריצה. לאחר מכן, הסר את המוח הקטן על ידי הכנסת להב לחריץ הרביעי מהצד הקודאלי של המטריצה. הכנס להב לחריץ האמצעי מבין החריצים שנותרו במטריצה.לאחר מכן, הכניסו את שאר הלהבים כך שיחלקו את הרקמה שנותרה לחצאים שווים, כדי להבטיח את פיזור הרקמה האחיד ביותר במהלך הפריסה. לאחר השחלת כל הלהבים, הוסיפו טיפה אחת או שתיים של PBS למוח כדי להרטיב אותו. לאחר מכן, הוציאו את הלהבים מהמטריקס one by one, החל מהאזור הרוסטרלי.שמרו את שבע הפרוסות הראשונות לצורך אנליזת TTC. לאחר T-M-C-A-O, השתמשו במרית קטנה כדי להעביר בזהירות את הפרוסות מהלהב אל המבחנה המלאה ב-TTC. לאחר שכל החתכים נמצאים במבחנה, סגרו אותה במכסה והניחו אותה באמבט מים חמים עד שהחתכים יהפכו לוורודים.סובב בעדינות את הבקבוק בתוך האמבט במידת הצורך כדי למנוע חפיפה של חתכים, דבר שעלול להוביל לצביעה לא אחידה. לאחר מכן, השליך את ה-TTC ושפוך תמיסת פאראפורמאלדהיד 4% אל תוך המבחנה כך שתכסה את חתכי המוח. פעולה זו מסיימת את התגובה הכימית של ה-TTC.סדרו מיד את הפרוסות על גבי זכוכית של 1x3 אינץ' נקייה, והכווינו את הפרוסות מהחלק הרוסטרלי (קדמי) לכיוון הזנב בעת סידורן על השקופית. סרקו את השקופית. בעזרת סורק סטנדרטי, הגדירו רזולוציה של 600 DPI לפחות לצורך ניתוח התמונה.ודאו ששם החיה וסרגל מידות מופיעים בתמונה הסרוקה. לבסוף, הפכו את השקופית וסרקו את הצד האחורי כדי להבטיח שכל הנתונים נאספו. RHP מפחית נפחי אינפארקט ב-46% בהשוואה לעכברי ביקורת, אך אין לו השפעה על נפיחות המיספירה כפי שעולה מנתוני ה-TTC באותם בעלי חיים.RHP מפחית את פגיעת מחסום הדם-מוח כפי שהוגדרה על ידי דליפת Evans Blue מנורמלת להמיספרה המנוגדת; מוצגות צביגות TTC מייצגות הן מהקבוצה שטופלה ב-RHP והן מקבוצת הביקורת שנחשפה ל-21% oxygen. העכברים מוצגים עם נפחי האינפארקט התואמים ודליפת ה-Evans blue המפורטים תחת כל דגימה. Ipsilateral הוא ההמיספרה האיסכמית של המוח, ו-contralateral הוא הצד הבלתי פגוע של המוח.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להזריק Evan's blue כ-22 שעות לאחר ההיתוך (fusion) ולאפשר לו להסריג במשך שעתיים לפני הקרבת בעל החיים לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום המחקר הפרה-קליני של שבץ מוחי לבחון מנגנונים של הגנה אנדוגנית משבץ בעכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה ברורה כיצד למדוד את ההשפעה הנוירופרוטקטיבית של RHP באמצעות כימות כפול של שלמות מחסום הדם-מוח ונפחי השבץ (infarct volumes).

quantification-neurovascular-protection-following-repetitive-hypoxic

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

יש מצטבר ראיות, שנפשי מראש איסכמי (PC) - אתגר איסכמי שאינו מזיק למוח - מעניק הגנה זמנית לעלבון איסכמי מזיק שלאחר מכן. הקמנו הבילטרלי חסימת עורק תרדמה משותפת (BCCAO) כגירוי נפשית מראש כדי לגרום לסובלנות איסכמי מוקדם (IT) לאיסכמיה מוחית מוקדי חולפים (הנגרם על ידי חסימה של עורק מוח אמצעי, MCAO) בC57BL6 / י עכברים.

ספיגה דו צדדי משותף עורק תרדמה כגירוי נפשית מראש מספיק כדי לגרום סובלנות איסכמי מוקדמת לאיסכמיה מוחית מיקוד

מקור: Zheng, Y., et al. מודלים ניסיוניים לחקר ההגנה העצבית של התניה חומצית מפני איסכמיה מוחית. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את היישום של התניה לאחר חומצה (APC) כדי להעריך את ההשפעות הנוירו-פרוטקטיביות שלה מפני פגיעה איסכמית במודל עכבר של חסימת עורק המוח האמצעי (MCAO). הוא מתאר את השלבים הכרוכים ברפרפוזיה במודל MCAO ויישום APC במהלך רפרפוזיה, כדי להפחית אקסיטוטוקסיות, מתח חמצוני ומוות עצבי.

 הערכת ההשפעות הנוירו-פרוטקטיביות של התניה חומצית במודל עכבר של איסכמיה מוחית

מקור: Poinsatte, K., et al., כימות הגנה נוירו-וסקולרית בעקבות התניה מוקדמת היפוקסית חוזרת וחסימת עורק מוח אמצעי חולף בעכברים. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את השיטה של התניה מוקדמת היפוקסית חוזרת (RHP) על ידי חשיפת עכבר למחזורי היפוקסיה מבוקרים לפני גרימת שבץ איסכמי. הניסוי מעריך את השפעותיו על יציבות מחסום הדם-מוח, הסתגלות עצבית ודלקת.

הסתגלות עצבית להתניה מוקדמת היפוקסית חוזרת בעכברים

מקור: Lee, S. E., et al. הערכת ההשפעות הנוירו-פרוטקטיביות של תמצית Glycyrrhizae Radix et Rhizoma באמצעות מודל עכבר חולף של חסימת עורק המוח האמצעי. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את ההליך להערכת ההשפעה הנוירו-פרוטקטיבית של תרכובת בדיקה במודל עכבר חסימת עורק המוח האמצעי. התרכובת נכנסת למוח, מונעת מוות עצבי ומפחיתה את נפח האוטם, ומאשרת את השפעתו הנוירו-פרוטקטיבית בהשוואה לעכבר לא מטופל.

הערכת ההשפעות הנוירו-פרוטקטיביות של תרכובת בדיקה במודל עכבר חסימת עורק מוחי אמצעי

על מנת להבין את פתופיזיולוגיה של שבץ, חשוב להשתמש במודלים אמינים. מאמר זה יתאר את אחד דגמי שבץ הנפוצים ביותר בשימוש בעכברים, כינה את חסימת עורק המוח האמצעי (MCAo) המודל (המכונה גם נימת intraluminal או מודל תפר) עם reperfusion.

גישה ניתוחית עבור העורקים התיכון ספיגה מוחין ושבץ reperfusion מושרה של עכברים

חסימה כירורגי של ענף עורק דיסטלי באמצע המוח (MCAo) היא מודל משמש לעתים קרובות במחקר שבץ ניסיוני. כתב יד זה מתאר את הטכניקה הבסיסית של MCAo קבע, בשילוב עם הכניסה של חלון גולגולתי לרוחב, אשר מציעה את ההזדמנות עבור מיקרוסקופיה intravital אורך בעכברים.

הכנת חלון גולגולת כרוני לרוחב מאפשרת In vivo תצפית בעקבות העורקים התיכון ספיגה מוחין דיסטלי של עכברים

אנו מתארים מודל עכבר של שבץ מוחי הנגרם על ידי חסימה של עורק המוח האמצעי באמצעות תפר מצופה סיליקון. ניתן ליישם את הפרוטוקול כדי לגרום לחסימה קבועה או איסכמיה זמנית, ואחריה רפרפוזיה.

אינדוקציה של שבץ איסכמי ו איסכמיה reperfusion בעכברים באמצעות הטכניקה ויזואליזציה ספיגות עורקים התיכונים של אזור האוטם

Accic postconditioning מגן מפני איסכמיה מוחית. כאן אנו מציגים שני מודלים לביצוע APC. הם מושגים בהתאמה על ידי העברת פרוסות corticostriatal למאגר חומצי לאחר מחסור בגלוקוז חמצן במבחנה ועל ידי שאיפה 20% CO 2 לאחר חסימת עורק המוח התיכון in vivo .

מודלים ניסיוניים לחקר הנוירו-פרוטקציה של התסמינים החומציים נגד איסכמיה מוחית

דגם העכבר של איסכמיה מוחית-פגיעה reperfusion הוקמה כדי לחקור הפתופיזיולוגיה של שבץ. אנו יש מאתרים ומפסיקים את עורק המוח התיכון נכון ולא נכון עורק תרדמני, להחזיר את זרימת הדם לאחר 10 או 40 דקות של איסכמיה.

שתיים, כלי סגר דגם העכבר של איסכמיה מוחית-פגיעה reperfusion

פרוטוקול זה מתאר את המודל של איסכמיה מוחית מוקדית חולפת בעכברים באמצעות חסימה תוך לומינלית של עורק המוח האמצעי. בנוסף, דוגמאות להערכת תוצאות מוצגות באמצעות הדמיית תהודה מגנטית ומבחני התנהגות.

מודל חולף של חסימת עורק מוחי אמצעי חולף

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביסוס מודל חסימת עורק מוחי אמצעי דיסטלי (dMCAO) באמצעות אלקטרוקואגולציה טרנס-גולגולתית בעכברי C57BL/6J ומעריכים את ההתנהגות הנוירולוגית והתכונות ההיסטופתולוגיות שלאחר מכן.

השראת שבץ איסכמי חריף בעכברים באמצעות טכניקת חסימת העורק האמצעי הדיסטלי

למדו כיצד לכמת הגנת עצבים בעכברים לאחר חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד, באמצעות מדידה כפולה של נפח אינפארקט ושלמות מחסום דם-מוח. שיטה זו מסייעת לחוקרים להעריך אסטרטגיות נוירופרוטקטיביות בחקר שבץ.

כימות של הגנת עצבים וכלי דם בעקבות חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד וחלוף התיכון מוחין של עכברים

גלה סרטונים נוספים