Assay זול, Scalable התנהגות למדידת אתנול הרגעת רגישות וסובלנות מהירה ב

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להעריך את הרגישות להרגעה (sedation) על ידי אתנול בזבובים. דבר זה מושג על ידי הנחת זבובים בתוך מבחנות וחשיפתם לאדי אתנול. השלב השני הוא קביעת מספר הזבובים המורגעים בכל מבחנה בנקודות זמן חוזרות, עד שכל הזבובים מורגעים.

בשלב הבא, נקודת הזמן עוברת אינטרפולציה. כאשר 50% מהזבובים בכל מבחנה נמצאים תחת הרדמה, התוצאות מראות מדד של הזמן הדרוש להרדמת זבובים עם אתנול. את הפרוצדורה הזו תדגים היום סימרן סינדו, סטודנטית במעבדה שלי. כדי להתחיל את הניסוי, אספו זבובים למבחנות עם מזון טרי בקבוצות של 11 פרטים מאותו מין למשך עד חמש דקות של CO2, ואפשרו לזבובים להתאושש למשך לילה במבחנות מזון במרחב עם בקרה סביבתית.

הכינו תמיסת אתנול על ידי דילול אתנול טהור בריכוז 100% במים מזוקקים עד לריכוז סופי של 85%. אפשרו לתמיסה להגיע לטמפרטורת החדר במהלך הלילה. לפני הבדיקה, הכינו מבחנת מזון נקייה וריקה, שתשמש כמבחנת הבדיקה. הכינו פקק תאצטט צלולוז חדש, פקק סיליקון ומילליטר אחד של תמיסת אתנול עבור כל מבחנה של זבובים שתיבדק. כווננו את טמפרטורת החוחדר ל-20 עד 25 °C ואת הלחות היחסית ל-55% עד 65%. הגדירו עובד נוסף שיקצה קוד ייחודי לכל קבוצת מבחנות וירשום את הקוד להמשך. הניחו את המבחנות המקודדות עם הזבובים בחדר הבדיקה כדי שיתאכלמו למשך מספר דקות. לאחר מכן, סמנו את מבחנות הבדיקה הריקות כך שיתאימו לקודים שעל מבחנות הזבובים.

הכינו יומן בדיקה מודפס על ידי הזנת הקודים לעמודות בגיליון אלקטרוני, כאשר כל עמודה מייצגת מבחנה אחת. תוך שימוש ביומן הבדיקה כמדריך, סדרו את מבחנות המזון המקודדות עם הזבובים ואת מבחנות הבדיקה הריקות במערכים תואמים בחדר הבדיקות, והעבירו את הזבובים ממבחנות המזון למבחנות הבדיקה התואמות והמסומנות, אחת בכל פעם.

לאחר מכן, הכניסו מיד פקקי צלולוז אצטט למבחנות הבדיקה, עד שפקקי הצלולוז אצטט יהיו שני סנטימטרים מתחת לקצות המבחנות. עבור הערכת זמן אפס, אחזו בכל מבחנה בנפרד באמצעות האגודל והאצבע.

הקישו בעדינות על השולחן שלוש פעמים כדי להפיל את הזבובים לתחתית המבחנה. המתינו 30 שניות וספרו את מספר הזבובים שאינם נעים ו/או מתים. רשמו את מספר הזבובים המתים או שאינם נעים עבור כל מבחנה בנקודת הזמן.

דקה אפס ביומן הבדיקות המודפס. הפעילו את הטיימר בזמן אפס והוסיפו מיד 1 mL של אתנול לצלולוז אצטט. ערבבו בתנועה סיבובית במרווחי זמן של 5 שניות עבור ארבעת הבקבוקיות הראשונות לפי הסדר.

הבדיקה תבוצע לאחר שהאתנול יתווסף לכל ארבעת מבחני הבדיקה בסט. הכנסו פקק סיליקון לכל מבחנה כדי לאטום אותה לאחר 1, 2, 3, 4 וחמש דקות. הוסיפו מיליליטר אחד של אתנול לסטים השני, השלישי, הרביעי, החמישי והשישי של ארבעה מבחנות, בהתאמה.

המשיכו להחדיר פקקי סיליקון לאחר הוספת אתנול לכל קבוצה של ארבעה מבחנות LS בדקה השישית. בדקו את הקבוצה הראשונה של ארבעה מבחנות על ידי תפיסת כל מבחנה באמצעות אגודל ואצבע והקשה עדינה על השולחן שלוש פעמים כדי להפיל את הזבובים לתחתית המבחנה. המתינו 30 שניות, ולאחר מכן ספרו ורשמו את המספר הכולל של הזבובים שנמצאים תחת השפעת הרדמה.

סמנו את הזבובים כמרדומיים אם הם, אחת, עומדים על קרקעית המבחנה אך אינם הולכים, או שתיים, שוכבים על גבם עם או בלי נפנוף בכנפיים. טפלו בכל מבחנה בסט במרווחי זמן של חמש שניות לפי לוח זמנים זה בדקות 7, 8, 9, 10 ו-11.

בדקו את סדרות המבחנות השנייה, השלישית, הרביעית, החמישית והשישית בהתאמה, כפי שבוצע עבור הסדרה הראשונה בדקה ה-12. בדקו שוב את הסדרה הראשונה של ארבע מבחנות והמשיכו לבדוק את סדרות המבחנות השנייה, השלישית, הרביעית, החמישית והשישית בדקות 13, 14, 15, 16 ו-17 בהתאמה. המשיכו בבדיקת הזבובים עד שכולם יהיו תחת הרדמה.

הזינו את המספר הכולל של הזבובים בכל מבחנה בבדיקה ידנית. רשמו את הזבובים שאינם נעים או מתים בזמן אפס מתוך המספר הכולל של הזבובים. נתונים גולמיים ממבחן ההרגעה באתנול הומרו לאחוז הזבובים הפעילים כפונקציה של זמן.

הרגישות לסדציה באמצעות אתנול מהנתונים הראשוניים כומתה כזמן סדציה 50 או ST 50. הזמן הדרוש כדי ש-50% מהזבובים יהיו במצב של סדציה או השטח תחת העקום או AUC. הבדיקה מזהה את ההשפעות של RNAi נגד calnexin 14 D במערכת העצבים, אשר החליש את הרגישות לאתנול ביחס לבקרות; מוטציה של scab ו-rouser הגבירה את הרגישות לסדציה באתנול, ומוטציה של happy hour החלישה את הרגישות לסדציה באתנול בהשוואה לבקרות לאחר שלב ההסתגלות.

ניתן לבצע טכניקה זו בשעה וחצי אם היא מבוצעת כראוי.