Name: Assay זול, Scalable התנהגות למדידת אתנול הרגעת רגישות וסובלנות מהירה ב דרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: למד שיטה זולה וניתנת להרחבה למדידת רגישות לאתנול וסובלנות מהירה בדרוזופילה. השיטה מאפשרת חקר התנהגויות הקשורות לאתנול במודל זה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקרים אלה נתמכו על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לאלכוהוליזם ושימוש לרעה באלכוהול ל-M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). המחברים מודים לג'יל בטינגר על הדיונים המועילים ולז'קלין דלויט על הסיוע הטכני.

1. יום לפני Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף זבובים לתוך צלוחיות מזון טריות בקבוצות של 11 (חד מיני) תחת CO הקצר (1-5 דקות) 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר זבובים להתאושש O / N בבקבוקוני מזון בחלל מבוקר לסביבה (בדרך כלל 25 ° C, 60% לחות יחסית, שעות אור 12 / מחזור כהה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון אתנול (ים) על ידי דילול (100%) אתנול טהור במים מטוהרים (≥18 MΩ) לריכוז סופי (ים) מתאים לניסוי המתוכנן. לאפשר פתרון (ים) כדי לחזור לRT O / N. הערה: הדילול של אתנול פולט חום. </li></ol> 2. יום של Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל בקבוקון של זבובים להיבדק, להכין (i) בקבוקון מזון נקי, ריק; כלומר, בקבוקון בדיקות, (ii) תקע אצטט תאית חדש, (iii) פקק סיליקון ו( iv) 1 מיליליטר של תמיסת אתנול (ראה טבלה 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חדר בדיקות על ידי התאמת טמפרטורה 20-25 מעלות צלזיוס ולחות היחסית ל55-65%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש עובד נוסףלהקצות קוד ייחודי לכל קבוצה של בקבוקונים ולהקליט את הקוד לשימוש מאוחר יותר. מניחים צלוחיות מקודדות עם זבובים בחדר בדיקות כדי להסתגל לכמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית בקבוקוני בדיקות ריקות כדי להתאים קודים על בקבוקונים לטוס מ -2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות יומן עותק בדיקה קשה על ידי הזנת הקודים לעמודות (עמודה אחת / בקבוקון) בגיליון אלקטרוני דומה לטבלת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , שימוש ביומן הבדיקות כמדריך לסדר בקבוקוני מזון מקודדים עם זבובים ובקבוקוני בדיקות ריקים למערכי התאמה בחדר הבדיקה. הערה: מספר מרבי סביר של בקבוקונים לבדוק הוא 24 (כלומר, 6 סטים של 4 בקבוקונים כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זבובים מבקבוקוני מזון להתאמת בקבוקוני בדיקות ריקות שכותרתו / ולהכניס מייד תקעים אצטט תאית לתוך צלוחיות בדיקות עד תקעים אצטט תאית הם 2 סנטימטר מתחת לצמרות הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכאן והלאה, לטפל בכל שורה של ארבעה בקבוקונים כערכה במרווחים דק &#39;מדורגים 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להערכה זמן 0, לתפוס כל בקבוקון בנפרד wאגודל ואצבע ה- i, לטפוח בעדינות על השולחן שלוש פעמים לדפוק זבובים לתחתית של הבקבוקון, לחכות 30 שניות ואז לספור את מספר הזבובים שהם נייחים / מתים. רשום את מספר הזבובים נייחים / מתים עבור כל בקבוקון בזמן 0 דקות ביומן הבדיקות המודפסת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת טיימר ספירה ברציפות בזמן 0 ומייד מתחיל הוספת 1 מיליליטר של אתנול לתקעים אצטט תאית בבקבוקונים לשורה / הסט הראשון של 4 בקבוקונים. הוסף 1 מיליליטר של אתנול לתקעים אצטט תאית בבקבוקונים במרווחים של 5 שניות על מנת שייבחנו. הוספת אתנול לתקעים אצטט תאית בתנועה סיבובית, כך שאתנול נספג באופן שווה לאורך כל התקעים אצטט תאית. כאשר אתנול נוספו לכל 4 בקבוקוני הבדיקה בסט, להכניס תקע סיליקון בכל בקבוקון כדי לאטום אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמנים 1, 2, 3, 4 ו -5 דקות, להוסיף 1 מיליליטר של אתנול לרביעי, סטים השני, שלישיים, החמישי והשישי של 4 בקבוקונים, בהתאמה. המשך החדרת פקקי סיליקון לאחרהוספת אתנול לכל סט של 4 בקבוקונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן 6 דקות, לבדוק את הסט הראשון של 4 בקבוקונים ידי אחיזת כל בקבוקון עם אגודל ואצבע, הקשה בעדינות על השולחן שלוש פעמים לדפוק זבובים לתחתית של הבקבוקון, מחכה 30 שניות ולאחר מכן ספירה ורישום המספר הכולל של זבובים שהם מסוממים. ציון עף כמו מסומם אם הם (i) עומדים על רצפת הבקבוקון אבל לא ללכת או (ii) לשכב על גבם, עם או בלי נפנוף הכנפיים שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפל בכל בקבוקון בתוך נקבע על 5 מרווחי שניות באמצעות לוח הזמנים בטבלה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפעמים 7, 8, 9, 10 ו -11 דקות, לבדוק את הסטים שני, שלישיים, רביעי, חמישי והשישי של בקבוקונים, בהתאמה, כפי שנעשה לסט הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקות זמן 12, לבדוק את הסט הראשון של 4 בקבוקונים שוב כפי שמתואר ב2.12 ולהמשיך הבדיקה רביעית, הסטים שני, שלישיים, חמישי והשישי של בקבוקונים בגיל 13, 14, 15, 16 ו -17 דקות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך זבובי בדיקה כמתואר ב2.12 עד שכל הזבובים שלedated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את המספר הכולל של זבובים בכל בקבוקון ביומן עותק הבדיקה הקשה. לצנזר זבובים נייחים / מתים בזמן 0 מהמספר הכולל של זבובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את זבובי אחוזים פעילים בכל נקודת זמן הערכה ונתונים עלילה כזבובי% פעילים (ציר y) לעומת זמן (ציר x). לכמת הרגעה אתנול על ידי ביון סדציה זמן 50 ערכים (ST50, זמן להרגעת 50%) מסדר שלישי עקום פולינום או sigmoidal מתאים או חישוב שטח מתחת לעקומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף נתונים מבקבוקונים מפוענחים ולבצע ניתוחים סטטיסטיים (למשל, בכיוון אחד ANOVA עם מבחן השוואה מרובה Bonferroni) מתאים כלתכנון ניסוי. </li></ol>

<ol><li>Rehm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+disease+and+injury+and+economic+cost+attributable+to+alcohol+use+and+alcohol-use+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders.</a> Lancet. 373, 2223-2233 (2009).</li>
<li>Prescott, C. A., Kendler, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+contributions+to+alcohol+abuse+and+dependence+in+a+population-based+sample+of+male+twins%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins.</a> The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).</li>
<li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+Drosophila+melanogaster+as+a+model+for+alcohol+research%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research.</a> Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).</li>
<li>Scholz, H., Mustard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invertebrate+Models+of+Alcoholism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+behavioral+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Invertebrate Models of Alcoholism.</a> Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).</li>
<li>Rodan, A. R., Rothenfluh, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRodan%2C+AR+%22Functional+Plasticity+and+Genetic+Variation%3A+Insights+into+the+Neurobiology+of+Alcoholism%22">Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism</a>. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).</li>
<li>Schumann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+and+genetic+functional+studies+identify+autism+susceptibility+candidate+2+gene+%28AUTS2%29+in+the+regulation+of+alcohol+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).</li>
<li>Corl, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Happyhour%2C+a+Ste20+family+kinase%2C+implicates+EGFR+signaling+in+ethanol-induced+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors.</a> Cell. 137, 949-960 (2009).</li>
<li>Moore, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+intoxication+in+Drosophila%3A+Genetic+and+pharmacological+evidence+for+regulation+by+the+cAMP+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway.</a> Cell. 93, 997-1007 (1998).</li>
<li>Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hangover+gene+defines+a+stress+pathway+required+for+ethanol+tolerance+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development.</a> Nature. 436, 845-847 (2005).</li>
<li>Riley, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+dependence+is+associated+with+the+ZNF699+gene%2C+a+human+locus+related+to+Drosophila+hangover%2C+in+the+Irish+affected+sib+pair+study+of+alcohol+dependence+%28IASPSAD%29+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample.</a> Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).</li>
<li>Morozova, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+sensitivity+in+Drosophila%3A+translational+potential+of+systems+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics.</a> Genetics. 183, 733-745 (2009).</li>
<li>Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+Adh+function+on+ethanol+preference+and+tolerance+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster.</a> Chemical senses. 35, 813-822 (2010).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+GWASs+and+human+protein+interaction+networks+identifies+a+gene+subnetwork+underlying+alcohol+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+human+genetics%22%5BJournal%5D)">Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence.</a> American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).</li>
<li>Lind, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomewide+association+study+of+nicotine+and+alcohol+dependence+in+Australian+and+Dutch+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Twin+Res+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations.</a> Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).</li>
<li>Schuckit, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+level+of+response+to+alcohol+as+a+predictor+of+future+alcoholism%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism.</a> The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).</li>
<li>Schuckit, M. A., Smith, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+8-year+follow-up+of+450+sons+of+alcoholic+and+control+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+general+psychiatry%22%5BJournal%5D)">An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects.</a> Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).</li>
<li>Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Alcohol tolerance.</a> Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).</li>
<li>Chan, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+Influences+of+Drosophila+white%2Fmini-white+on+Ethanol+Sensitivity+in+Two+Different+Behavioral+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays.</a> Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).</li>
<li>Eddison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((arouser+reveals+a+role+for+synapse+number+in+the+regulation+of+ethanol+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity.</a> Neuron. 70, 979-990 (2011).</li>
<li>Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuropeptide+F+and+its+receptor%2C+NPFR1%2C+define+a+signaling+pathway+that+acutely+modulates+alcohol+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).</li>
<li>Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+for+evoked+locomotor+behavior+in+Drosophila+reveals+a+role+for+integrins+in+ethanol+sensitivity+and+rapid+ethanol+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance.</a> Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).</li>
<li>Bhandari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+intracellular+channels+modulate+acute+ethanol+behaviors+in+Drosophila%2C+Caenorhabditis+elegans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+brain%2C+and+behavior%22%5BJournal%5D)">Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice.</a> Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Bacchus+reveal+a+tyramine-dependent+nuclear+regulator+for+acute+ethanol+sensitivity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila.</a> Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).</li>
<li>Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lmo+genes+regulate+behavioral+responses+to+ethanol+in+Drosophila+melanogaster+and+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).</li>
<li>Maples, T., Rothenfluh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+way+to+measure+ethanol+sensitivity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple way to measure ethanol sensitivity in flies.</a> J Vis Exp. , e2541(2011).</li>
<li>Rothenfluh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+behavioral+responses+to+ethanol+are+regulated+by+alternate+RhoGAP18B+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms.</a> Cell. 127, 199-211 (2006).</li>
<li>Nohronha, A. Ch. 23. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRothenfluh%2C+A+%22Neurobiology+of+Alcohol+Dependence%22">Neurobiology of Alcohol Dependence</a>. 23, Elsevier. 467-495 (2014).</li>
<li>Jones, M. A., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+age-related+impairment+in+locomotor+and+other+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors.</a> Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).</li>
<li>Martin, I., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+and+age-related+functional+declines%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage and age-related functional declines.</a> Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).</li>
<li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ethanol+responses+in+Drosophila+are+sexually+dimorphic%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מבחני פשוטים שreproducibly לכמת פנוטיפים משמעותיים הם בעלי ערך רב לניתוח ההתנהגות. העבודה המתוארת כאן מטפלת במספר היבטים מעשיים של assay למדידת רגישות הרגעה אתנול וסובלנות מהירה בדרוזופילה. למרות שלא להתמקד על עבודה זו, ניתוחי התנהגות הם הקלו על ידי שמירה על איכות הסביבה וקבועה רקע גנטי לבדיקת נושאים במחקר. יתר על כן, השוואה צריכה בדרך כלל נקבעת בין קבוצות של זבובים שגדלו ונבדקו צד-by-side. לשם כך, כל הזבובים בתוך ניסויי פרט בעבודה זו היה אותו הרקע הגנטי וגודלו זה לצד זה ...

הפרעת שימוש באלכוהול (AUD) היא בעיה בריאותית עצומה ברחבי העולם (שנסקרה ב1). למרות מנגנוני הנהיגה פיתוח AUD מורכבים, יש להם הפרעות אלה מרכיב גנטי משמעותי (לדוגמא, 2). התורשתיות הגדולה של AUD והתגובות התנהגותיות המשומרות כדי אתנול על פני מינים רבים (שנסקרו ב3,4) יצרו עניין רב בשימוש באורגניזמים מודל גנטיים כדי לחקור את מעורבותם של גנים מסוימים בהתנהגויות הקשורות לאתנול להבנה טוב יותר של הבסיס המולקולרי של AUD. זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, התפתח כאורגניזם מודל מוביל לחקר מנגנונים מולקולריים-גנטיים של התנהגויות הקשורות לאתנול (שנסקרו ב3,4). מחקרים בזבובים הדגישו תפקידים במשך כמה מסלולי איתות בתגובות התנהגותיות לאתנול (הנסקרת ב 5). מעניין לציין, שחלק מהגנים והמסלולים המשפיעים על התנהגות responses לאתנול בזבובים גם היה מעורב בהתנהגויות הקשורות לאתנול מכרסם ו / או AUD האנושי (למשל, 6-14). שימור מנגנוני נהיגה התנהגויות הקשורות לאתנול בין מינים, בשילוב עם החבילה של כלים גנטיים זמינים במערכת מודל דרוזופילה, מדגיש את התועלת של מודל זבוב פירות לחקירת הגנטיקה של תגובות התנהגותיות לאתנול. רגישות וסובלנות 15,16 (הנסקרת ב -17) כדי אתנול בבני האדם קשורה להתפתחות של AUD. שתי תגובות התנהגותיות אלה כדי אתנול יכולים להיות מודל בזבובים באמצעות מגוון רחב של מבחני מעבדה (שנסקר ב3,4). כל מבחני הזבוב ידועים למחברים מבוססים על שני מושרה אתנול הרגעה / חוסר קואורדינציה תלוי זמן או זמן החלמה תלוי מהרגעת אתנול. במאמר קודם מהקבוצה שלנו בגנטיקה של רגישות אתנול וrסובלנות apid בדרוזופילה, assay התנהגות המבוסס על הרגעה מושרה אדי אתנול זבובים שימשה 18. הבדיקה בassay זה הייתה ביוזמת העברה מבוגרת חי עפה ללא הרדמה לרוקן את בקבוקוני מזון, לכידת הזבובים בצלוחיות עם תקע אצטט תאית, הוספת אתנול לראש (כלומר, הצד הלא-fly) של התקע אצטט תאית, ו איטום הבקבוקון המכיל זבובים, תקע אצטט תאית ואתנול עם פקק סיליקון (ראה סכמטי באיור S3, התייחסות 18). בקבוקונים מרובים המייצגים קבוצות שונות של זבובים הוערכו במקביל, הגדלת תפוקה של assay זה. בקבוקונים ניתנו קוד אנונימי והנסיינים לא היו מודעים לקבוצת טיפול למניעת הטיה מכוונת בהערכת ההרגעה. בניסוי סטנדרטי, זבובים בבקבוקונים שנקשו בעדינות בשעה 6 דקות במרווחים, ולאחר התאוששות 30 שניות, את מספר הזבובים מסוממים בכל בקבוקון נספר וconverteד לזבובים פעילים אחוזים. זבובים נקלטו אדי אתנול מהתקע אצטט תאית באופן תלוי זמן, גורמים לעלייה הדרגתית באתנול הפנימי 18 והרגעה (התייחסות CF 18 ואיור 1 א ו -1 B בדוח זה). הרגעה בassay זה הוגדרה מבצעי כזבובי מעמד (i) בהעדר ההליכה או (ii) שוכב על גבם, עם או בלי נפנוף הכנפיים שלהם. כאן, assay ההרגעה אתנול זה מתואר בפירוט, אופטימיזציה תפעולית נוספת הנוגע לשימוש בו מסופקת, וassay משמש לטיפול בתרומה של אפשרויות תוספי מזון על רגישות הרגעה זבוב.

<table><tbody><tr><td>בקבוקוני מזון</td><td>VWR</td><td>89092-772</td><td></td></tr><tr><td>זיזים צרים</td><td>Genesee/flystuff.com</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>פקק סיליקון</td> צר <td>פישר סיינטיפיק</td><td>09-704-1l</td><td>#4</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Pharmaco-Aaper</td><td>111000200</td><td>200 הוכחה</td></tr></tbody></table>

assay זול, scalable התנהגות למדידת אתנול הרגעת רגישות וסובלנות מהירה ב<em&gt; דרוזופילה</em

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

הפרעת שימוש באלכוהול (AUD) היא אתגר בריאותי חמור. למרות מרכיב תורשתי גדול לAUD, כמה גנים היו מעורבים באופן חד משמעי באטיולוגיה שלהם. זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, הוא מודל עוצמה לחקר מנגנונים מולקולריים-גנטיים שבבסיס התנהגויות הקשורות לאלכוהול, ולכן טומן בחובו הבטחה גדולה לזיהוי וההבנה של הפונקציה של גנים המשפיעים על AUD. השימוש במודל תסיסנית למחקרים מסוג תלוי בזמינות של מבחני שלמדוד באופן מהימן תגובות התנהגותיות לאתנול. דו&quot;ח זה מתאר assay המתאים להערכת רגישות אתנול וסובלנות מהירה בזבובים. רגישות אתנול נמדדה בassay זה מושפעת הנפח והריכוז של אתנול משמש, מגוון רחב של מניפולציות גנטיות שדווחו בעבר, וגם את משך זמן הזבובים הם שוכנו ללא מזון מייד לפני הבדיקה. בניגוד לכך, של אתנולensitivity נמדד בassay זה אינו מושפע מהמרץ של טיפול זבוב, מין של הזבובים, ותוספת של מדיום גידול באנטיביוטיקה או שמרים חיים. שלוש שיטות שונות לרגישות אתנול quantitating מתוארות, כולם מובילים לתוצאות רגישות אתנול בלתי שונה במהות. טבע מדרגי של assay זה, בשילוב עם הפשטות שלה הכוללת להגדרה והוצאה נמוכה יחסית, הופך אותו מתאים לניתוח גנטי בקנה מידה קטן וגדול של רגישות אתנול וסובלנות מהירה בדרוזופילה.

נתונים הגולמיים מassay ההרגעה אתנול זה הם המספרים של זבובים שהם מסוממים כפונקציה של זמן חשיפת אדי אתנול. הם נתונים גולמיים הוסבו לזבובים הפעילים אחוזים כפונקציה של זמן (נתונים ראשוניים, איורים 1 א &#39;, ב&#39;, ד &#39;- ו&#39;). רגישות להרגעת אתנול מנתונים הראשוניים ניתן נרשמת כסדציה זמן 50 (ST50), את הזמן הנדרש עבור 50% מזבובים להפוך מסומם או AEA מתחת לעקומה (AUC), באמצעות אינטרפולציה מהעקומה מתאימה. בעבר דיווח 18 עקומות פולינום מסדר שלישי להתאים את ה...

בדיקות פשוטות למדידת רגישות לאתנול וסבילות מהירה בדרוזופילה מקלות על השימוש באורגניזם מודל זה לחקירת התנהגויות חשובות אלה הקשורות לאתנול. כאן מתוארת בדיקה פשוטה יחסית וניתנת להרחבה למדידת רגישות לאתנול וסבילות מהירה בזבובים.

Assay זול, Scalable התנהגות למדידת אתנול הרגעת רגישות וסובלנות מהירה ב<em&gt; דרוזופילה</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להעריך את הרגישות להרגעה (sedation) על ידי אתנול בזבובים. דבר זה מושג על ידי הנחת זבובים בתוך מבחנות וחשיפתם לאדי אתנול. השלב השני הוא קביעת מספר הזבובים המורגעים בכל מבחנה בנקודות זמן חוזרות, עד שכל הזבובים מורגעים.בשלב הבא, נקודת הזמן עוברת אינטרפולציה. כאשר 50% מהזבובים בכל מבחנה נמצאים תחת הרדמה, התוצאות מראות מדד של הזמן הדרוש להרדמת זבובים עם אתנול. את הפרוצדורה הזו תדגים היום סימרן סינדו, סטודנטית במעבדה שלי. כדי להתחיל את הניסוי, אספו זבובים למבחנות עם מזון טרי בקבוצות של 11 פרטים מאותו מין למשך עד חמש דקות של CO2, ואפשרו לזבובים להתאושש למשך לילה במבחנות מזון במרחב עם בקרה סביבתית.הכינו תמיסת אתנול על ידי דילול אתנול טהור בריכוז 100% במים מזוקקים עד לריכוז סופי של 85%. אפשרו לתמיסה להגיע לטמפרטורת החדר במהלך הלילה. לפני הבדיקה, הכינו מבחנת מזון נקייה וריקה, שתשמש כמבחנת הבדיקה. הכינו פקק תאצטט צלולוז חדש, פקק סיליקון ומילליטר אחד של תמיסת אתנול עבור כל מבחנה של זבובים שתיבדק. כווננו את טמפרטורת החוחדר ל-20 עד 25 °C ואת הלחות היחסית ל-55% עד 65%. הגדירו עובד נוסף שיקצה קוד ייחודי לכל קבוצת מבחנות וירשום את הקוד להמשך. הניחו את המבחנות המקודדות עם הזבובים בחדר הבדיקה כדי שיתאכלמו למשך מספר דקות. לאחר מכן, סמנו את מבחנות הבדיקה הריקות כך שיתאימו לקודים שעל מבחנות הזבובים.הכינו יומן בדיקה מודפס על ידי הזנת הקודים לעמודות בגיליון אלקטרוני, כאשר כל עמודה מייצגת מבחנה אחת. תוך שימוש ביומן הבדיקה כמדריך, סדרו את מבחנות המזון המקודדות עם הזבובים ואת מבחנות הבדיקה הריקות במערכים תואמים בחדר הבדיקות, והעבירו את הזבובים ממבחנות המזון למבחנות הבדיקה התואמות והמסומנות, אחת בכל פעם.לאחר מכן, הכניסו מיד פקקי צלולוז אצטט למבחנות הבדיקה, עד שפקקי הצלולוז אצטט יהיו שני סנטימטרים מתחת לקצות המבחנות. עבור הערכת זמן אפס, אחזו בכל מבחנה בנפרד באמצעות האגודל והאצבע.הקישו בעדינות על השולחן שלוש פעמים כדי להפיל את הזבובים לתחתית המבחנה. המתינו 30 שניות וספרו את מספר הזבובים שאינם נעים ו/או מתים. רשמו את מספר הזבובים המתים או שאינם נעים עבור כל מבחנה בנקודת הזמן.דקה אפס ביומן הבדיקות המודפס. הפעילו את הטיימר בזמן אפס והוסיפו מיד 1 mL של אתנול לצלולוז אצטט. ערבבו בתנועה סיבובית במרווחי זמן של 5 שניות עבור ארבעת הבקבוקיות הראשונות לפי הסדר.הבדיקה תבוצע לאחר שהאתנול יתווסף לכל ארבעת מבחני הבדיקה בסט. הכנסו פקק סיליקון לכל מבחנה כדי לאטום אותה לאחר 1, 2, 3, 4 וחמש דקות. הוסיפו מיליליטר אחד של אתנול לסטים השני, השלישי, הרביעי, החמישי והשישי של ארבעה מבחנות, בהתאמה.המשיכו להחדיר פקקי סיליקון לאחר הוספת אתנול לכל קבוצה של ארבעה מבחנות LS בדקה השישית. בדקו את הקבוצה הראשונה של ארבעה מבחנות על ידי תפיסת כל מבחנה באמצעות אגודל ואצבע והקשה עדינה על השולחן שלוש פעמים כדי להפיל את הזבובים לתחתית המבחנה. המתינו 30 שניות, ולאחר מכן ספרו ורשמו את המספר הכולל של הזבובים שנמצאים תחת השפעת הרדמה.סמנו את הזבובים כמרדומיים אם הם, אחת, עומדים על קרקעית המבחנה אך אינם הולכים, או שתיים, שוכבים על גבם עם או בלי נפנוף בכנפיים. טפלו בכל מבחנה בסט במרווחי זמן של חמש שניות לפי לוח זמנים זה בדקות 7, 8, 9, 10 ו-11.בדקו את סדרות המבחנות השנייה, השלישית, הרביעית, החמישית והשישית בהתאמה, כפי שבוצע עבור הסדרה הראשונה בדקה ה-12. בדקו שוב את הסדרה הראשונה של ארבע מבחנות והמשיכו לבדוק את סדרות המבחנות השנייה, השלישית, הרביעית, החמישית והשישית בדקות 13, 14, 15, 16 ו-17 בהתאמה. המשיכו בבדיקת הזבובים עד שכולם יהיו תחת הרדמה.הזינו את המספר הכולל של הזבובים בכל מבחנה בבדיקה ידנית. רשמו את הזבובים שאינם נעים או מתים בזמן אפס מתוך המספר הכולל של הזבובים. נתונים גולמיים ממבחן ההרגעה באתנול הומרו לאחוז הזבובים הפעילים כפונקציה של זמן.הרגישות לסדציה באמצעות אתנול מהנתונים הראשוניים כומתה כזמן סדציה 50 או ST 50. הזמן הדרוש כדי ש-50% מהזבובים יהיו במצב של סדציה או השטח תחת העקום או AUC. הבדיקה מזהה את ההשפעות של RNAi נגד calnexin 14 D במערכת העצבים, אשר החליש את הרגישות לאתנול ביחס לבקרות; מוטציה של scab ו-rouser הגבירה את הרגישות לסדציה באתנול, ומוטציה של happy hour החלישה את הרגישות לסדציה באתנול בהשוואה לבקרות לאחר שלב ההסתגלות.ניתן לבצע טכניקה זו בשעה וחצי אם היא מבוצעת כראוי.

an-inexpensive-scalable-behavioral-assay-for-measuring-ethanol

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Assay פשוט למדוד את ההשפעות מרגיעים של אתנול...

דרך פשוטה למדוד את רגישות אתנול זבובים

דרוזופילה התפתחה כמערכת מודל משמעותית עבור לנתח את הבסיס התאי ומולקולרית של תגובות התנהגותיות לאלכוהול. כאן אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף נתונים רגישות אלכוהול בהקשר היממה שיכולה להיות מיושם בקלות לניסויים אחרים, והוא מתאים היטב למחקר לתואר ראשון.

FlyBar: מתן אלכוהול לזבובים

במאמר זה וידאו, אנו מתארים assay אוטומטי כדי למדוד את ההשפעה של רעב או שובע על התנהגות חיפוש מזון תלויה בריח הפירות המבוגרים לעוף melanogaster דרוזופילה.

יחיד לטוס Assay עבור התנהגות שיחור מזון ב דרוזופילה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות ההימנעות של אנשים לחוצים. פרדיגמה זו היא עוצמתית אך ידידותית למשתמש וניתן להשתמש בה כדי להעריך את ההשפעה של גנים וסביבה על סוג אחד של אינטראקציה חברתית ב-Drosophila melanogaster.

Assay הפשוט לכימות חברתיות הימנעות ב Melanogaster דרוזופילה

C. elegans הוא מודל שימושי לחקר ההשפעות של אתנול על ההתנהגות. אנו מציגים בדיקת התנהגותית שמכמתת את ההשפעות של אתנול על מהירות התנועה של תולעים זוחלות; ניתן למדוד עם הבדיקה הזו גם את הרגישות הראשונית וגם את התפתחות הסובלנות התפקודית החריפה לאתנול.

Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

אנו מתארים פרוטוקול גרימת מתגמל nonrewarding חוויות בזבובי פירות (תסיסנית) באמצעות צריכת אתנול מרצון כאמצעי לשינויים במדינות גמול.

דרך פשוטה למדוד שינויים בהתנהגות שוחרת זכה שימוש<em&gt; תסיסנית</em

שיטות נוכחיות למדידת רגישות האלכוהול בדרוזופילה נועדו לבחון קבוצות של זבובים. אנו מציגים בקלות, בעלות נמוכה, התפוקה גבוהה הערכה להערכת רגישות הרגעה אלכוהול במספר גדול של זבובים בודדים. השיטה אינה דורשת כלים מיוחדים וניתן לבצעו בכל מעבדה המשתמשת בחומרים משותפים.

שיטת תפוקה גבוהה עבור מדידת אלכוהול הרגעה זמן של הפרט דרוזופילה מלאנוגסטר

השיטת Flypub מודדת את ההתנהגויות שבהן מציג הפרי את מלאנוזופילה מלוגסטר תחת השפעת האתנול. ניתן לשלוט בקלות על ידי הניסויים בכל הרמות וליישם גירויים שונים, הקלה על שימוש בסמים ולימודי התמכרות.

Flypub ללמוד אתנול המושרה ביטול עכבה התנהגותית הרגישות

הפרוטוקול מציג שיטה בעלת תפוקה גבוהה וחסכונית להערכת רעילות עצבית בזבוב הפירות באמצעות כימות תפקוד לקומוטורי כחלופה למודלים מסורתיים של יונקים. מטרתו להעריך את ההשפעות הנוירוטוקסיות של תרכובות פרמצבטיות, גורמים סביבתיים או שינויים גנטיים באמצעות מודל רגיש, ניתן לשחזור וחיובי מבחינה אתית.

ניתוח התנהגותי של תפקוד לקומוטורי ב-Drosophila melanogaster כקריאה לרעילות עצבית

ההליך המתואר בפרוטוקול זה מראה כי הממשל טסטוסטרון ואמונות עממיות על הטסטוסטרון עשויה להיות קשורה התנהגויות חברתיות בניגוד ישירות.

שילוב של התנהגות אנדוקרינולוגיה וכלכלה ניסויית: החלטת טסטוסטרון חברתית ביצוע

למד שיטה זולה וניתנת להרחבה למדידת רגישות לאתנול וסובלנות מהירה בדרוזופילה. השיטה מאפשרת חקר התנהגויות הקשורות לאתנול במודל זה.

Assay זול, Scalable התנהגות למדידת אתנול הרגעת רגישות וסובלנות מהירה ב

גלה סרטונים נוספים