בחירת גודל האוטומטי ג'ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

סרטון זה מדגים את השימוש במכשיר אוטומטי לבחירת גודל של ג'ל כדי להשיג קריאות משופרות בפלטפורמות של ריצוף הדור הבא. ראשית, נאספות דגימות ממי סביבה והן מועברות דרך סדרה של מסננים כדי להפריד באופן שיטתי חלקיקים בגודל של איקריוטים, חיידקים ונגיפים. החיידקים שנלכדו מרוכזים בהמשך באמצעות סנטריפוגציה.

לאחר מכן מוצא את ה-DNA הבקטריאלי. ה-DNA שבודד משמש להכנת ספריות שבהן מאופדים (adapters) ואינדקסים משולבים לתוך ה-DNA המקטע. לאחר מכן ה-DNA מועשר באמצעות PCR, והדגימות נטענות לתחנת העבודה של האלקטרופורזה.

לאחר מכן, מקטעי DNA בטווח ספציפי נבחרים באופן אוטומטי. ניתוח עקבות מאלקטרופורזה קפילרית מבוססת שבב ובדיקות ביו-אינפורמטיקה נוספות מוכירים כי שיטה זו מניבה כמויות מתאימות של מקטעי DNA לצורך אנליזות המשך, עם הצטברות מינימלית של מקטעים לא רצויים מתחת ל-200 base pairs. היתרון המרכזי של תחנת Electrophoresis square אוטומטית, של חרוזי פאראמגנטיים או של מערכות מסחריות אחרות, הוא שהן מאפשרות טווח בחירה הדוק וצר יותר, שבו ניתן לעבד עד 96 דגימות בהרצה אחת.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי קהילות מיקרוביאליות בדגימות מים מתוקים, ניתן להחיל אותה על מערכות אחרות כגון מי ים, טיפול בששפכים, דגימות צמחים, קרקע משקעים או מחצלאות מיקרוביאליות, ובשורה התחתונה על כל דגימת DNA שבעבורה נדרשת ברירה צרה של גדלים. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר הבחנו במקטעים קצרים ברצפים מפלטפורמת MySEQ. ניסינו מספר גישות לברירת גדלים, כולל סוגים ויחסי ריכוז שונים של חרוזי פרה (para beads), וכן גישה לברירת גדלים ידנית באמצעות ג'ל.

לאחר מכן התחלנו לשתף פעולה עם Coastal Genomics, תאגיד פרטי מקולומביה הבריטית המציע את טכנולוגיית ה-Ranger להדגמת הפרוצדורה. היום יצטרפו אלינו מייקל צ'אן, טכנאי מחקר מהמעבדה שלי, מיגל יי, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי, וג'רד סלואן, מהנדס מ-Coastal Genomics. בסרטון זה, נתאר אך ורק את טיהורו ואנליזתו של החומר שהופק מהמסננים בעלי נקביות של 0.2 micron, בעיקר חיידקים חופשיים, אך יש לזכור שניתן להשתמש בגישות דומות עבור החלקיקים האחרים שהופקו מהמסננים.

התחילו את הפרוצדורה על ידי איסוף דגימות של 40 ליטרים ממי מתיקה ממספר אתרים סביבתיים לתוך תרמיסים סטריליים בנפח של 20 ליטרים. בצעו סינון מקדים לדגימות במקום (in situ) באמצעות מסנן פוליפרופילן מסוג spectrum mesh בנקבים של 105 מיקרומטר. במקרה זה, הדגימות נאספות מאגני ניקוז המושפעים מאזורים עירוניים וחקלאיים.

לאחר האיסוף, הניחו את הדגימות במקררים והעבירו אותן בחזרה למעבדה. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 4°C. למחרת.

הקימו מערכת סינון המורכבת מבליל (carboy) לאיסוף הדגימות המחובר באמצעות משאבה פריסטלטית לקפסולת דגימה של Enviro Check בסינון של 1 micron. חברו את קפסולת הדגימה למסנן דיסק של 0.2 micron, ואת האחרון למסנן זרימה טנגנציאלית של 30 kilodalton באמצעות משאבה פריסטלטית שנייה. הפעילו את המשאבות הפריסטלטיות כדי להעביר את הדגימות דרך סדרת המסננים; התאים העקריים יבודדו בעת מעברם דרך קפסולת הדגימה.

הfracterיה הבקטריאלית תבודד על מסנן דיסק ממברנה, והחלקיקים הוויראליים יבודדו במסנן זרימה טנגנציאלית. הוצא את מסנן הממברנה בגודל 0.2 micrometer או את המסננים ממערכת סינון המים. לאחר מכן, קפל את המסנן לחצי והנח אותו בתוך מבחנה של 50 milliliter.

כשהצד הפתוח פונה כלפי מעלה. הוסיפו למבחנה 5 mL של PBS עם tween. אם נעשה שימוש ביותר ממסנן אחד במהלך הסינון, השתמשו במבחנה נפרדת עבור כל מסנן.

ניתן לאחסן את המסננים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס או לעבד אותם מיד באופן הבא. לאחר מכן, בעזרת פינצטה סטרילית, הוצא את מסנן הממברנה מהמבחנה בנפח 50 מיליליטר והנח אותו על צלחת פטרי בעזרת פינצטה סטרילית ומספריים סטריליים. גזור את המסנן לחתיכות בגודל של סנטימטר אחד על סנטימטר אחד בין הדגימות.

חטאו את המכשירים על ידי השריה ב-70% isopropanol, ניגוב עם חומר לדה-קונטמינציה של DNA מהמשטחים, ולאחר מכן שטיפה במים אולטרה-טהורים מסוג type one. החזירו את חלקי המסנן לאותה מבחנה של 50 milliliter. הוסיפו 10 milliliters של PBS עם tween כדי להביא את הנפח הכולל של הבאפר ל-15 milliliters באמצעות פינצטה סטרילית.

הוסיפו שש חרוזי טונגסטן נקיים, בקוטר שלושה מילימטרים, לכל מבחנה של 50 מיליליטר. כסו את המבחנה בפרפורפילם (paraform) ובצעו ערבוב בורטקס בעוצמה למשך 20 דקות.

לאחר ערבוב בוורטקס (vortexing), רכזו את כל התרחיפים למבחנה נקייה אחת בנפח 50 מיליליטר עבור כל דגימה. סובבו את המבחנות בצנטריפוגה במהירות 3,300 GS למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסבב, השליכו את הנוזל העליון (supernatant) והשביו מחדש את המשקע (pellet).

חלק את התאי החיידקיים בתוך 5 mL של תמיסת PBS לאליקוטים של 1 mL לתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.7 mL, וסבב במיקרו-צנטריפוגה ב-10,000 g למשך 10 דקות. לאחר הסבב, השתמש בפיפט כדי להסיר את כל הנוזל העליון (supernatant), למעט 200 µL. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של 80°C- או המשך למיצוי DNA חיידקי באמצעות ערכה מסחרית לבידוד DNA.

במהלך מיצוי DNA מחיידקים, השתמש ב-PBS או במים כביקורת מיצוי שלילית וב-e coli כביקורת מיצוי חיובית. לאחר הליך מיצוי ה-DNA, רכז את המנות מאותה דגימה לשפופרת אחת של 2 mL בבופר tris בריכוז 10 mM. לאחר מכן, בצע שקיעה ללילה על ידי הוספת תמיסה המורכבת מ-10% sodium acetate בריכוז 3 M, שני נפחים של 100% ethanol וחמישה µL של linear acrylamide. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של 80°C-.

ביום למחרת, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 17,000 GS למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסבב, שטפו את המשקע ב-1 mL של 70% ethanol קר מאוד, והניחו למשקע להתייבש באוויר בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית למשך לא יותר מחמש דקות.

לאחר מכן, השביה מחדש את משקע ה-DNA ב-10 millimolar tris-CL. לבסוף, קבע את כמות ואיכות ה-DNA באמצעות ביצוע בדיקה פלואורסצנטית רגישה למדידת כמות חומצות גרעין, ולאחריה ספקטרומטריה של מיקרו-נפחים. לאחר קביעת כמות ה-DNA בכל דגימה, הוסף כמות מתאימה של מים לכל מבחנה כדי להביא את הריכוז לכ-0.2 nanograms per microliter.

באמצעות ערכה זמינה מסחרית, הכין ספריית DNA של מקטעים עם אינדקס (indexed fragments) מננוגרם אחד של DNA בקטריאלי. כאן, מיושם תהליך המבוסס על טרנספוזאז (transposase) המכונה "tagmentation", המבצע בו-זמנית פרגמנטציה ושילוב של רצפי אדפטרים אל ה-DNA. לאחר מכן, מבוצע PCR כדי להגביר את הדגימות ולקטלג אותן בו-זמנית, ובכך לספק ברקודים ספציפיים לכל מקטע ורצפים הדרושים להיווצרות צבירים (clusters) שניתנים לקריאה על ידי פלטפורמת הריצוף.

עם השלמת ה-PCR, דלגו על שלב הניקוי הסטנדרטי שאחרי ה-PCR והוסיפו 3.5 µL של loading buffer לכל דגימה, לנפח סופי של 28.5 µL. לאחר מכן, העבירו את הדגימות לפלטה של 96 בארות. טענו את פלטת 96 הבארות לתחנת עבודה לאלקטרופורזה עם קסטה מוכנה מראש של 1.5% agarose באמצעות ממשק המשתמש של תוכנת Ranger.

הגדירו יעד לבחירת גודל של 500 עד 800 base pairs. קבעו את נפח המיצוי ל-300 µL. התחילו את ההרצה.

תחנת העבודה לאלקטרופורזה תטען באופן אוטומטי את הדגימות לתוך קסטות ה-aros. לאחר מכן, מופעל מתח חשמלי על הקסטות, ומערכת דימוי המותקנת על גשר (gantry) משמשת לזיהוי מיקום ה-DNA של הדגימה ב-aros. לאורך כל הריצה.

תוכנת ה-Ranger לוקטת תמונות ובעזרת סטנדרטים פנימיים מעריכה את מיקומו של היעד שנבחר לפי גודל בכל דגימה. לאחר זיהוי היעדים, תוכנת ה-Ranger משנה את המתח המופעל על כל דגימה כדי לסנכרן את הגעת היעדים לבארות המיצוי של הקסטה.

לבסוף, תחנת העבודה לאלקטרופורזה שואבת את המטרות ב-TBE מבארות המיצוי ומספקת אותן לתוך פלטה חדשה של 96 בארות כדי לרכז את חומר הפלט הגולמי, ומשקיפה את נפח האלוציה הגולמי באמצעות סודיום אצטט ואתנול עם אקרילאמיד ליניארי למשך לילה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. צנטריפוגו את הדגימות שוב ב-17,000 g למשך 30 דקות. לאחר הסבוב, השליכו את העלונאות והמשיכו לשטוף את פלטת ה-DNA ב-1 ml של אתנול 70% קר מאוד (בטמפרטורת קרח) באמצעות צנטריפוגה.

סבבו את הדגימות ב-17,000 GS למשך 30 דקות, השליכו את הנוזל העליון, ייבשו אותן, ובסוף השעיו מחדש את משקע ה-DNA ב-10 millimolar tris CL. המשיכו לנרמל את הדגימות באמצעות חרוזי נרמול לספריות, הנכללים בערכה להכנת ספריות transpose on base. לבסוף, המשיכו בריצוף DNA באמצעות פלטפורמת ריצוף מהדור הבא (next generation sequencing) כדי להפיק קריאות אינפורמטיביות יותר בפלטפורמות ריצוף מהדור הבא, על ידי שיפור איכותן של ספריות הריצוף.

דגימות מים נלקחו משמונה אתרים שונים באגן הניקוז וספריות DNA אינדקס הוכנו מהפракציה הבקטריאלית המבודדת כפי שמוצג באלקטרופורגראם זה. ספריות DNA שהופקו מדגימות מים מתוקים לאחר PCR, אך לפני בחירת גודל אוטומטית, הכילו מקטעים בטווח גדלים של 50 זוגות בסיסים ועד 3000 זוגות בסיסים. לאחר בחירת גודל באמצעות הפלטפורמה האוטומטית בעלת התפוקה הגבוהה, הדגימות הכילו טווח צפוף של מקטעי DNA בין 500 ל-800 זוגות בסיסים. לפיכך, שימוש בפלטפורמה אוטומטית זו לבחירת גודל על ג'ל הוביל לתנובות מתאימות וצמצם את הצבירה של מקטעים בלתי רצויים מתחת ל-200 זוגות בסיסים.

ריצוף DNA של ספרייה זו במכשיר ה-MiSeq הניב צפיפות קלאסטרים של 1198 K לממ"ר. אחוז הקלאסטרים שעברו את הסינונים היה 84.2% עם תפוקה מוערכת של 9.2 ג'יגה-בייט. יתרה מכך, ל-7.4 ג'יגה-בייט, או 82.8% מהקריאות, היה ציון איכות הגבוה או השווה ל-30.

משמעות הדבר היא כי לכ-83% מהבסיסים שרצפו באמצעות פרוטוקול משונה זה, אשר יושם על דגימות מים מהסביבה, הייתה דיוק קריאת בסיסים של לפחות 99.9%. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק נתונים אינפורמטיביים יותר מספריות ריצוף. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור את פלקציית המיקרובים אליה אתם שואפים, את בחירת הכנת הספרייה, את אורך הפרגמנט המטרה ואת פלטפורמות הריצוף.