Name: בחירת גודל האוטומטי גל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: למדו שיטת בחירת גודל אוטומטית בג'ל לטיהור DNA ושיפור ספריות רצף הדור הבא מדגימות מים סביבתיות. טכנולוגיית Ranger מספקת אוטומציה מלאה לעיבוד 96 דגימות בו-זמנית עם דיוק גבוה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי Genome BC, Genome Canada ו-Coastal Genomics. המחברים מודים לקירבי קרונין ומייקל צ'אן על עזרתם באיסוף ועיבוד הדגימות. ברצוננו גם להודות לתיאה ואן רוסום ולד"ר פיונה ברינקמן על הסיוע בביואינפורמטיקה.

אוסף מים 1. וסינון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות מים מתוקים מאתרים שונים (איור 1). לעבור דגימות באמצעות סדרה של מסננים: מסנן 1 מיקרומטר, 0.2 מיקרומטר מסנן, וזרימה משיקה מסנן 30 הפסקת kDa לשיטתי אוקריוטים נפרד, חלקיקים בגודל חיידקי וירוסים, בהתאמה. שים לב: רק הטיהור והניתוח של החומר התאושש על 0.2 מיקרומטר המסננים (חיידקי חיים-חינם) מתואר בדוח זה, אבל גישות דומות יכולות לשמש לחלקיקים האחרים התאוששו מהמסננים. </li></ol> 2. ריכוז חיידקים, הפקת DNA וטיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מסנן 0.2 מיקרומטר הקרום (ים) ממערכת סינון מים (תרשים סכמטי, איור 2). מקפלים את מסנן 0.2 מיקרומטר הדיסק במחצית ולמקם אותו לתוך צינור 50 מיליליטר עם הצד עד הפתוח. הוסף 5 מיליליטר של תמיסת פוספט שנאגרו 1x (PBS) ו0.01% Tween, pH 7.4 להצינור. אם מסנן אחד או יותר המשמש בתהליך להעסיק צינור שונה למסנן. צינור חנות (s) עם מסנן על 4 מעלות צלזיוס עד מעובד. אחרת, המשך לשלב 2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מסנן 0.2 מיקרומטר קרום מצינור 50 מיליליטר עם מלקחיים סטרילית. מסנן מקום (ים) על צלחת פטרי (לעזוב את חיץ PBS בצינור). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים סטרילית ומספריים סטרילי, לחתוך את המסנן לרצועות קטנות (1 סנטימטר x 1 סנטימטר). לחטא מלקחיים ומספריים על ידי השרייה בisopropanol 70%, מנגב עם decontaminant משטח DNA ושטיפה במי ultrapure מסוג 1 בין מדגמים שונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המסנן חתוך לרצועות האחוריות לתוך צינור 50 מיליליטר. הוסף 10 מיליליטר של 1x PBS ו0.01% Tween, pH 7.4 למסנן ולכן יש בסך הכל 15 מיליליטר של חיץ בשפופרת 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 חרוזים נקיים טונגסטן (3 מ&quot;מ קוטר) על צינור אחד 50 מיליליטר, לכסות את הצינור עם Parafilm, ומערבולת במרץ במשך 20 דקות (50 מיליליטר להשתמש מתאם מערבולת צינורות). אם multiple מסננים מעובדים ממדגם אחד, העברה והבריכה כל homogenate לתוך צינור 50 מיליליטר נקי. בצנטריפוגה הצינורות ב 3300 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה וaliquot תאי החיידקים (~ 1 מיליליטר aliquots) ל1.7 מיליליטר צינורות microcentrifuge. שים לב שלא יהיו 5 צינורות microcentrifuge לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה צינורות microcentrifuge ב10,000 XG במשך 10 דקות, ולהסיר את רוב supernatant עד ~ 200 סימן μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הדגימות ב -80 ° C, או להמשיך כדי לחלץ DNA חיידקים באמצעות ערכת בידוד DNA זמינה מסחרי בהתאם להוראות היצרן. במהלך שימוש בקטריאלי מיצוי DNA או PBS או מים כביקורת שלילית חילוץ, וא coli כביקורת חיובית חילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגלל DNA מצינורות מרובים חילוץ, בריכה תת-aliquots המקביל מהמדגם זהה לצינור 2 מיליליטר אחד. לאחר מכן לערוך O / N ממטרים באמצעות פתרון מורכב מ0.1כרכים של 3 אצטט M נתרן, 2 כרכים של 100% אתנול, ו -5 μl של 5 מיקרוגרם / acrylamide יניארי μl. מערבבים היטב ודגימות חנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות המרבית (17,000 XG) במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף גלולה עם 1 מיליליטר של אתנול קר כקרח 70%, אוויר יבש בארון בטיחות ביולוגי לשום גלולה DNA דקות יותר מ 5 וגלול בμl 34 של 10 מ&quot;מ טריס-Cl, pH 8.5. הערה: acrylamide ינארית תעזור לדמיין גלולה DNA לאחר O / הממטרים N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע כמות ה- DNA ואיכות באמצעות רגישות גבוהה assay quantitation חומצות גרעין הניאון וספקטרופוטומטר microvolume, בהתאמה, בעקבות הוראות היצרנים (ראה טבלה של חומרים). הערה: אם דוגמאות רבות מוכנות בזמן, assay הרגיש ביותר ניאון חומצות גרעין לכימות dsDNA וfluorometer / ספקטרופוטומטר פלייט מבוסס ניתן להשתמש במקום. </li></ol> 3. DNA ספריית הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; נרמל DNA חיידקים הגנומי שחולץ מן דגימות מים לריכוז של 0.2 ~ ng / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ננוגרם אנזימי בר אחד של DNA חיידקים באמצעות שיטה המבוססת על transposon (tagmentation). להוסיף רצפי מתאם ומדד על DNA מקוטע הבאים הוראות היצרן. נושא tagmented דגימות עד 12 מחזורים של PCR כפי שצוין בהוראות היצרן, ובשלב זה מדדי הרצף משולבים. </li></ol> בחירת גודל 4. האוטומטי ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלג על שלב ניקוי סטנדרטי פוסט-PCR המתואר בהוראות היצרן (ראה טבלה של חומרים). דגימות שלאחר PCR בחרו גודל ישירות באמצעות פלטפורמת בחירת גודל מבוסס ג&#39;ל אוטומטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3.5 μl של חיץ טעינה לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הפרוטוקול של היצרן, לטעון את הדגימות על תחנת העבודה אלקטרופורזה, המפרט יעד גודל בחירה של 500-800 נקודות בסיס, בתמצית 300 μlיון נפח, באמצעות 1.5% קלטת agarose יצוקים מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכז את חומר גלם הפלט (300 μl) עד 25 μl באמצעות משקעים אתנול. הערה: לחלופין, להשתמש בתחנת העבודה אלקטרופורזה כדי להפוך ריכוז למספרים גדולים יותר של דגימות באמצעות צלחת מסנן וסעפת ואקום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז גלם באמצעות 0.1 כרכים של 3 אצטט M נתרן, 2 כרכים של 100% אתנול ו 5 μl של 5 מיקרוגרם / acrylamide יניארי μl נפח elution. מערבבים היטב, דגימות מקום ב -80 CO ° / N. צנטריפוגה דגימות 17,000 XG למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatants ולהמשיך לשטוף גלולה DNA עם 1 מיליליטר של אתנול 70% קרים כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות שוב ב17,000 XG למשך 30 דקות, להשליך supernatants, אוויר יבש, ולבסוף resuspend גלולה DNA ב -25 μl של 10 מ&quot;מ טריס-Cl, pH 8.5. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) μl 1 של ספריות DNA גודל שנבחר עם פלטפורמת בחירת גודל ג&#39;ל האוטומטית השתמש לעשות חמשדילול -fold באמצעות פתרון חיץ טריס-EDTA, pH 8.0. לנתח ספריות באמצעות מכשיר אלקטרופורזה נימים מבוסס שבב לנתח איכות dsDNA על פי הוראות יצרן. </li></ol> 5. ספריית נורמליזציה ורצף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לנרמל דגימות באמצעות חרוזים ספריית נורמליזציה (כלולים בערכת הכנת ספרייה מבוססת transposon) כפי שמתואר במדריך להכנה של היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, למדוד ספריות dsDNA באמצעות assay רגישות גבוהה ניאון גרעין quantitation החומצה, ואחרי איגום ביחסי equimolar להגיע ריכוז dsDNA סופי של 2 ננומטר. המשך לפגל ספריות באמצעות 10 μl של ספריות ונקוו ו -10 μl של 0.2 N NaOH, דגירה של 5 דקות על RT. לדלל ספריות מפוגלים באמצעות מאגר הכלאה (כלול בערכת ההכנה מבוססת transposon) לנפח סופי של 1 מיליליטר וריכוז של 11.5 בערב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מדגםים בפלטפורמת רצף של הדור הבא על ידי ביצוע פרוטוקולי הרצף הסטנדרטי של היצרן. </li></ol>

<ol><li>Siuda, W., Chrost, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+susceptibility+of+dissolved+DNA+for+enzyme+degradation+in+lake+water+-+some+methodological+remarks%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks.</a> Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).</li>
<li>Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna">http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna</a> (2010).</li>
<li>Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+detection+using+environmental+DNA+from+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+letters%22%5BJournal%5D)">Species detection using environmental DNA from water samples.</a> Biology letters. 4, 423-425 (2008).</li>
<li>Liles, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery%2C+purification%2C+and+cloning+of+high-molecular-weight+DNA+from+soil+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms.</a> Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).</li>
<li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+high+molecular+weight+DNA+from+microbial+mats%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats.</a> BioTechniques. 49, 631-640 (2010).</li>
<li>Tebbe, C. C., Vahjen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+of+humic+acids+and+DNA+extracted+directly+from+soil+in+detection+and+transformation+of+recombinant+DNA+from+bacteria+and+a+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast.</a> Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).</li>
<li>Solonenko, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+platform+and+library+preparation+choices+impact+viral+metagenomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes.</a> BMC genomics. 14, 320(2013).</li>
<li>Aird, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+and+minimizing+PCR+amplification+bias+in+Illumina+sequencing+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries.</a> Genome biology. 12, R18(2011).</li>
<li>Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQuail%2C+MA+%22Current+protocols+in+human+genetics+%2F+editorial+board%2C+Jonathan+L.+Haines+..+%5Bet+al.%5D%22">Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]</a>. 18, 18(2009).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).</li>
<li>Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing%3A+tone+down+the+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).</li>
<li>Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+high-throughput+library+preparation+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing.</a> Nature Methods. 7, (2010).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).</li>
<li>Marine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+transposase+protocol+for+rapid+generation+of+shotgun+high-throughput+sequencing+libraries+from+nanogram+quantities+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA.</a> Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).</li>
<li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome research. 22, 939-946 (2012).</li>
<li>Lamble, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+workflows+for+high+throughput+library+preparation+using+the+transposome-based+nextera+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system.</a> Bmc Biotechnology. 13, (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome research. , (2014).</li>
<li>Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+Choices+for+Library+Prep%3A+A+Comparison+of+Library+Preparation+Methods+for+Whole+Genome+Sequencing+of+Cryptococcus+neoformans+Using+Illumina+HiSeq%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq.</a> PloS One. 9, e113501(2014).</li>
</ol>

ג&#39;ארד ר &#39;סלובודן ומתיו ג&#39; נסביט הן להחזיק במניות של החוף Genomics, תאגיד קולומביה הבריטית בבעלות פרטית המציע את הטכנולוגיה Ranger.

הנוכחות של הדימרים מתאם ואשכולות של גדלים להכניס קטנים מעדיפים להיות רצף בפלטפורמות הנוכחיות מייצגת ירידה בתשואות שמישים ותת-ביצוע ביכולתו של הציוד 15. השימוש בשיטות מכות חרוז בשילוב עם גישה מבוססת transposon להכין ספריות עלול לגרום ליותר גז DNA בהשוואה לשיטות אחרות של 4,5 חילוץ. עם זאת, כל השיטות של הכנת מיצוי וספריית פוטנציאל להציג את ההטיות לחלוקת הרצף קוראת 8,16. תצפיות ניסיוניות באמצעות פלטפורמה אוטומטית גרעין חילוץ חומצה, בשילוב עם שיטה המבוס...

מטגנומיקה כרוכה בריצוף של כל החומר הגנטי בדגימה כדי לאפיין את הקהילות המיקרוביאליות הקיימות. זהו תהליך מורכב ויקר הכולל המרה של חומצות גרעין שחולצו לספריות DNA ואחריו ריצוף מהדור הבא. ספריות באיכות גבוהה חיוניות לתפוקת נתונים מקסימלית ולניתוח מטא-גנומיקה מדויק. דגימות סביבתיות, כגון דגימות מים, מהוות לעתים קרובות אתגרים משמעותיים ליצירת ספריות באיכות גבוהה, בשל כמויות נמוכות של DNA שעלולות להתפרק גם1-3 ונוכחותם של מעכבי PCR4-6. 
ספריות באיכות גבוהה מורכבות באופן אידיאלי ממקטעים ארוכים יותר של DNA בטווח צר של אורכים. על מנת למקסם את כמות הנתונים השימושיים שנוצרים בכל ריצת ריצוף, אורך ה-DNA בספרייה צריך להיות לפחות ארוך כמו אורך הקריאה המרבי של שיטת הריצוף שבה נעשה שימוש. בעת שימוש בטכנולוגיית ריצוף על ידי סינתזה כגון Illumina MiSeq, גודל שברי ה-DNA משפיע על היעילות שבה נוצרים אשכולות בתא הזרימה. לדוגמה, כאשר ספרייה מכילה מקטעי DNA קצרים וארוכים יותר, הקצרים יותר יהיו מיוצגים יתר על המידה בנתוני הריצוף7,8. לעומת זאת, ספרייה עם מקטעי DNA בגודל דומה תהיה מיוצגת באופן פרופורציונלי בנתוני הריצוף. ערכות הכנה רבות לספרייה משתמשות בשיטות מבוססות קשירה כדי להוסיף מתאמים לשברי ה-DNA ויש צורך בבחירת גודל כדי להסיר דימרים של מתאמים שאינם מכילים תוספת9,10. ישנן שיטות רבות11,12 כדי להשיג זאת, אך הטכניקה היחידה שנותנת את התוצאות העקביות ביותר היא ההפרדה האלקטרופורטית של ה-DNA ואחריה שחזור האורכים הרצויים של DNA13,14. ניתן לבצע תהליך זה באופן ידני עבור מספר קטן של דגימות, אך כאשר עומדים בפני עיבוד מאות דגימות, נדרשים פתרונות אוטומטיים. הפלטפורמות הזמינות כיום לבחירת גודל ג'ל אוטומטית הן תפוקה נמוכה ויש צורך בפלטפורמות חדשות לעיבוד מספר רב של דגימות לריצוף. ניתן לשלב את טכנולוגיית הריינג'ר עם תחנות עבודה קיימות לטיפול בנוזלים כדי לאפשר שימוש באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז לבחירת גודל ולמטרות אנליטיות בקנה מידה העונה על סביבת התפוקה הגבוהה של ימינו.

<table><tbody><tr><td>משאבה פריסטלטית Masterflex P/S 1400 Series</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>1400-1620</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ומיקרו; m Supor Membrane</td><td>VWR</td><td>CA28143-969</td><td>Pall Corporation, Ann Harbor, MI</td></tr><tr><td>חרוזי טונגסטן קרביד 3 מ"מ (200)</td> <td>Qiagen</td><td>69997</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול 70%</td> <td>Jedmon Products</td><td>825751</td><td>Healthcare Plus</td></tr><tr><td>DNA away</td><td>VWR</td><td>7010</td><td>Molecular BioProducts, Inc. סן דייגו, קליפורניה</td></tr><tr><td>מערכת טיהור מים Milli-Q</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>ZMQS6VF0Y</td><td>מרק מיליפור. מערכת זו הופסקה.</td></tr><tr><td>20x PBS pH 7.5</td><td>VWR</td><td>E703-1L</td><td>Amresco, Inc., Solon, OH</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td>Fisher</td></tr><tr><td>כימיקלים מתאם מערבולת ל -2 (50&nbsp; ml) צינורות</td><td>VWR</td><td>13000-V1-50</td><td>MoBio, Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2, 120&nbsp; V (דגם G560)</td> <td>VWR</td><td>SI-0236</td><td>Scientific Industries, Inc.</td></tr><tr><td>בקמן צנטריפוגה</td><td>Raeyco מעבדת ציוד ניהול מערכות בע"מ</td><td>דגם J-6B</td><td></td></tr><tr><td>PowerLyzer Powersoil ערכת בידוד DNA</td><td>VWR</td><td>12855-100</td><td>MoBio, Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>מתאם מערבולת ל-24 צינורות (1.5-2 מ"ל)</td><td>VWR</td><td>13000-V1-24</td><td>MoBio, Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>Microfuge 18 צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Nimbus Select תחנת עבודה עם Ranger Technology</td><td>Hamilton Robotics</td><td>92720-01</td><td>כולל את תחנת העבודה לטיפול בנוזלים וערכת ריאגנטים משולבת של Ranger Tech (חומרת אלקטרופורזה)</td></tr> <tr><td>Ranger</td><td>Genomics</td><td>CG-10600-150-12-21</td><td>כולל מאגר טעינה וקלטות</td></tr><tr><td>אלכוהול אתילי (נטול מים)</td> <td>אלכוהול מסחרי</td><td>P016EAAN</td><td>Greenfield אתנול</td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>אקרילאמיד ליניארי (5&nbsp; מ"ג/מ"ל)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9520</td><td>אמביון</td></tr><tr><td>אפנדורף צנטריפוגה בקירור</td><td>Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Buffer EB (250 מ"ל)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit פלואורומטר</td><td>Life Technologies</td><td>Q32857</td><td>Invitrogen. מוצר זה הופסק.</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת Qubit dsDNA HS</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>מגיב DNA רגישות גבוהה</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>שבבי DNA רגישות גבוהה</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2011 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT ערכת הכנת דגימות</td><td>DNA Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>ערכת אינדקס Nextera XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ריאגנטים MiSeq v2 (500 מחזורים)</td> <td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>מערכת Miseq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

בחירת גודל האוטומטי ג&#39;ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

ריצוף הדור הבא של דגימות סביבתיות יכול להיות מאתגר בגלל כמות ואיכות ה-DNA המשתנה בדגימות אלה. יש צורך בספריות DNA באיכות גבוהה לקבלת תוצאות מיטביות מריצוף הדור הבא. דגימות סביבתיות כגון מים עשויות להיות באיכות נמוכה וכמויות נמוכות של DNA, כמו גם מזהמים המשקעים יחד עם DNA. התהליכים המכניים והאנזימטיים הכרוכים במיצוי והכנת הספרייה עלולים לפגוע עוד יותר ב-DNA. בחירת גודל ג'ל מאפשרת טיהור ושחזור של מקטעי DNA בגודל מוגדר ליישומי ריצוף. עם זאת, משימה זו היא אחד השלבים הגוזלים זמן רב ביותר בזרימת העבודה של הכנת ספריית ה-DNA. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר אוטומציה מלאה של העמסת ג'ל אגרוז, ניתוח אלקטרופורטי ושחזור של מקטעי DNA ממוקדים. 
במחקר זה, אנו מתארים גישה בעלת תפוקה גבוהה להכנת ספריות DNA באיכות גבוהה מדגימות מים מתוקים שניתן ליישם גם על דגימות סביבתיות אחרות. השתמשנו בגישה עקיפה כדי לרכז תאי חיידקים מדגימות מים מתוקים סביבתיים; ה-DNA חולץ באמצעות ערכת מיצוי DNA זמינה מסחרית, וספריות DNA הוכנו באמצעות פרוטוקול מסחרי מבוסס טרנספוזון. מקטעי DNA של 500 עד 800 bp נבחרו בגודל ג'ל באמצעות Ranger Technology, תחנת עבודה אוטומטית לאלקטרופורזה. ריצוף ספריות ה-DNA שנבחרו בגודל הראה שיפורים משמעותיים באורך הקריאה ובאיכות קריאות הרצף.

ריכוז ה- DNA, והערכת איכות ריכוזי DNA חיידקים נעו 0.01-0.11 ng ​​/ ml לדגימה מים של אתרי פרשת מים השונים (טבלה 1). DNA מבודד מחלק חיידקים היה 260/280 ו260/230 יחסים של 1.4-1.8 ו0.3-1.6, בהתאמה. בעוד שחלק מ260/230 היחסים היו נמוך יחסית, אין עיכוב ניכר נצפה בספרייה מוכנה ויישומים במורד הזרם אחרים. יישומים אלה כללו PCR וqPCR בדיקות מיקוד rRNA 16S וCPN ...

כתב יד זה מתאר גישה אוטומטית לבחירת גודל ג'ל לטיהור מקטעי DNA לריצוף הדור הבא. טכנולוגיית הריינג'ר מספקת אוטומציה מלאה של כל תהליך העמסת ג'ל אגרוז, ניתוח אלקטרופורטי ושחזור של שברי DNA ממוקדים המאפשרים ספריות ריצוף מהדור הבא בתפוקה גבוהה ובאיכות גבוהה.

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

סרטון זה מדגים את השימוש במכשיר אוטומטי לבחירת גודל של ג'ל כדי להשיג קריאות משופרות בפלטפורמות של ריצוף הדור הבא. ראשית, נאספות דגימות ממי סביבה והן מועברות דרך סדרה של מסננים כדי להפריד באופן שיטתי חלקיקים בגודל של איקריוטים, חיידקים ונגיפים. החיידקים שנלכדו מרוכזים בהמשך באמצעות סנטריפוגציה.לאחר מכן מוצא את ה-DNA הבקטריאלי. ה-DNA שבודד משמש להכנת ספריות שבהן מאופדים (adapters) ואינדקסים משולבים לתוך ה-DNA המקטע. לאחר מכן ה-DNA מועשר באמצעות PCR, והדגימות נטענות לתחנת העבודה של האלקטרופורזה.לאחר מכן, מקטעי DNA בטווח ספציפי נבחרים באופן אוטומטי. ניתוח עקבות מאלקטרופורזה קפילרית מבוססת שבב ובדיקות ביו-אינפורמטיקה נוספות מוכירים כי שיטה זו מניבה כמויות מתאימות של מקטעי DNA לצורך אנליזות המשך, עם הצטברות מינימלית של מקטעים לא רצויים מתחת ל-200 base pairs. היתרון המרכזי של תחנת Electrophoresis square אוטומטית, של חרוזי פאראמגנטיים או של מערכות מסחריות אחרות, הוא שהן מאפשרות טווח בחירה הדוק וצר יותר, שבו ניתן לעבד עד 96 דגימות בהרצה אחת.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי קהילות מיקרוביאליות בדגימות מים מתוקים, ניתן להחיל אותה על מערכות אחרות כגון מי ים, טיפול בששפכים, דגימות צמחים, קרקע משקעים או מחצלאות מיקרוביאליות, ובשורה התחתונה על כל דגימת DNA שבעבורה נדרשת ברירה צרה של גדלים. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר הבחנו במקטעים קצרים ברצפים מפלטפורמת MySEQ. ניסינו מספר גישות לברירת גדלים, כולל סוגים ויחסי ריכוז שונים של חרוזי פרה (para beads), וכן גישה לברירת גדלים ידנית באמצעות ג'ל.לאחר מכן התחלנו לשתף פעולה עם Coastal Genomics, תאגיד פרטי מקולומביה הבריטית המציע את טכנולוגיית ה-Ranger להדגמת הפרוצדורה. היום יצטרפו אלינו מייקל צ'אן, טכנאי מחקר מהמעבדה שלי, מיגל יי, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי, וג'רד סלואן, מהנדס מ-Coastal Genomics. בסרטון זה, נתאר אך ורק את טיהורו ואנליזתו של החומר שהופק מהמסננים בעלי נקביות של 0.2 micron, בעיקר חיידקים חופשיים, אך יש לזכור שניתן להשתמש בגישות דומות עבור החלקיקים האחרים שהופקו מהמסננים.התחילו את הפרוצדורה על ידי איסוף דגימות של 40 ליטרים ממי מתיקה ממספר אתרים סביבתיים לתוך תרמיסים סטריליים בנפח של 20 ליטרים. בצעו סינון מקדים לדגימות במקום (in situ) באמצעות מסנן פוליפרופילן מסוג spectrum mesh בנקבים של 105 מיקרומטר. במקרה זה, הדגימות נאספות מאגני ניקוז המושפעים מאזורים עירוניים וחקלאיים.לאחר האיסוף, הניחו את הדגימות במקררים והעבירו אותן בחזרה למעבדה. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 4°C. למחרת.הקימו מערכת סינון המורכבת מבליל (carboy) לאיסוף הדגימות המחובר באמצעות משאבה פריסטלטית לקפסולת דגימה של Enviro Check בסינון של 1 micron. חברו את קפסולת הדגימה למסנן דיסק של 0.2 micron, ואת האחרון למסנן זרימה טנגנציאלית של 30 kilodalton באמצעות משאבה פריסטלטית שנייה. הפעילו את המשאבות הפריסטלטיות כדי להעביר את הדגימות דרך סדרת המסננים; התאים העקריים יבודדו בעת מעברם דרך קפסולת הדגימה.הfracterיה הבקטריאלית תבודד על מסנן דיסק ממברנה, והחלקיקים הוויראליים יבודדו במסנן זרימה טנגנציאלית. הוצא את מסנן הממברנה בגודל 0.2 micrometer או את המסננים ממערכת סינון המים. לאחר מכן, קפל את המסנן לחצי והנח אותו בתוך מבחנה של 50 milliliter.כשהצד הפתוח פונה כלפי מעלה. הוסיפו למבחנה 5 mL של PBS עם tween. אם נעשה שימוש ביותר ממסנן אחד במהלך הסינון, השתמשו במבחנה נפרדת עבור כל מסנן.ניתן לאחסן את המסננים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס או לעבד אותם מיד באופן הבא. לאחר מכן, בעזרת פינצטה סטרילית, הוצא את מסנן הממברנה מהמבחנה בנפח 50 מיליליטר והנח אותו על צלחת פטרי בעזרת פינצטה סטרילית ומספריים סטריליים. גזור את המסנן לחתיכות בגודל של סנטימטר אחד על סנטימטר אחד בין הדגימות.חטאו את המכשירים על ידי השריה ב-70% isopropanol, ניגוב עם חומר לדה-קונטמינציה של DNA מהמשטחים, ולאחר מכן שטיפה במים אולטרה-טהורים מסוג type one. החזירו את חלקי המסנן לאותה מבחנה של 50 milliliter. הוסיפו 10 milliliters של PBS עם tween כדי להביא את הנפח הכולל של הבאפר ל-15 milliliters באמצעות פינצטה סטרילית.הוסיפו שש חרוזי טונגסטן נקיים, בקוטר שלושה מילימטרים, לכל מבחנה של 50 מיליליטר. כסו את המבחנה בפרפורפילם (paraform) ובצעו ערבוב בורטקס בעוצמה למשך 20 דקות.לאחר ערבוב בוורטקס (vortexing), רכזו את כל התרחיפים למבחנה נקייה אחת בנפח 50 מיליליטר עבור כל דגימה. סובבו את המבחנות בצנטריפוגה במהירות 3,300 GS למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסבב, השליכו את הנוזל העליון (supernatant) והשביו מחדש את המשקע (pellet).חלק את התאי החיידקיים בתוך 5 mL של תמיסת PBS לאליקוטים של 1 mL לתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.7 mL, וסבב במיקרו-צנטריפוגה ב-10,000 g למשך 10 דקות. לאחר הסבב, השתמש בפיפט כדי להסיר את כל הנוזל העליון (supernatant), למעט 200 µL. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של 80°C- או המשך למיצוי DNA חיידקי באמצעות ערכה מסחרית לבידוד DNA.במהלך מיצוי DNA מחיידקים, השתמש ב-PBS או במים כביקורת מיצוי שלילית וב-e coli כביקורת מיצוי חיובית. לאחר הליך מיצוי ה-DNA, רכז את המנות מאותה דגימה לשפופרת אחת של 2 mL בבופר tris בריכוז 10 mM. לאחר מכן, בצע שקיעה ללילה על ידי הוספת תמיסה המורכבת מ-10% sodium acetate בריכוז 3 M, שני נפחים של 100% ethanol וחמישה µL של linear acrylamide. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של 80°C-.ביום למחרת, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 17,000 GS למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסבב, שטפו את המשקע ב-1 mL של 70% ethanol קר מאוד, והניחו למשקע להתייבש באוויר בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית למשך לא יותר מחמש דקות.לאחר מכן, השביה מחדש את משקע ה-DNA ב-10 millimolar tris-CL. לבסוף, קבע את כמות ואיכות ה-DNA באמצעות ביצוע בדיקה פלואורסצנטית רגישה למדידת כמות חומצות גרעין, ולאחריה ספקטרומטריה של מיקרו-נפחים. לאחר קביעת כמות ה-DNA בכל דגימה, הוסף כמות מתאימה של מים לכל מבחנה כדי להביא את הריכוז לכ-0.2 nanograms per microliter.באמצעות ערכה זמינה מסחרית, הכין ספריית DNA של מקטעים עם אינדקס (indexed fragments) מננוגרם אחד של DNA בקטריאלי. כאן, מיושם תהליך המבוסס על טרנספוזאז (transposase) המכונה "tagmentation", המבצע בו-זמנית פרגמנטציה ושילוב של רצפי אדפטרים אל ה-DNA. לאחר מכן, מבוצע PCR כדי להגביר את הדגימות ולקטלג אותן בו-זמנית, ובכך לספק ברקודים ספציפיים לכל מקטע ורצפים הדרושים להיווצרות צבירים (clusters) שניתנים לקריאה על ידי פלטפורמת הריצוף.עם השלמת ה-PCR, דלגו על שלב הניקוי הסטנדרטי שאחרי ה-PCR והוסיפו 3.5 µL של loading buffer לכל דגימה, לנפח סופי של 28.5 µL. לאחר מכן, העבירו את הדגימות לפלטה של 96 בארות. טענו את פלטת 96 הבארות לתחנת עבודה לאלקטרופורזה עם קסטה מוכנה מראש של 1.5% agarose באמצעות ממשק המשתמש של תוכנת Ranger.הגדירו יעד לבחירת גודל של 500 עד 800 base pairs. קבעו את נפח המיצוי ל-300 µL. התחילו את ההרצה.תחנת העבודה לאלקטרופורזה תטען באופן אוטומטי את הדגימות לתוך קסטות ה-aros. לאחר מכן, מופעל מתח חשמלי על הקסטות, ומערכת דימוי המותקנת על גשר (gantry) משמשת לזיהוי מיקום ה-DNA של הדגימה ב-aros. לאורך כל הריצה.תוכנת ה-Ranger לוקטת תמונות ובעזרת סטנדרטים פנימיים מעריכה את מיקומו של היעד שנבחר לפי גודל בכל דגימה. לאחר זיהוי היעדים, תוכנת ה-Ranger משנה את המתח המופעל על כל דגימה כדי לסנכרן את הגעת היעדים לבארות המיצוי של הקסטה.לבסוף, תחנת העבודה לאלקטרופורזה שואבת את המטרות ב-TBE מבארות המיצוי ומספקת אותן לתוך פלטה חדשה של 96 בארות כדי לרכז את חומר הפלט הגולמי, ומשקיפה את נפח האלוציה הגולמי באמצעות סודיום אצטט ואתנול עם אקרילאמיד ליניארי למשך לילה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. צנטריפוגו את הדגימות שוב ב-17,000 g למשך 30 דקות. לאחר הסבוב, השליכו את העלונאות והמשיכו לשטוף את פלטת ה-DNA ב-1 ml של אתנול 70% קר מאוד (בטמפרטורת קרח) באמצעות צנטריפוגה.סבבו את הדגימות ב-17,000 GS למשך 30 דקות, השליכו את הנוזל העליון, ייבשו אותן, ובסוף השעיו מחדש את משקע ה-DNA ב-10 millimolar tris CL. המשיכו לנרמל את הדגימות באמצעות חרוזי נרמול לספריות, הנכללים בערכה להכנת ספריות transpose on base. לבסוף, המשיכו בריצוף DNA באמצעות פלטפורמת ריצוף מהדור הבא (next generation sequencing) כדי להפיק קריאות אינפורמטיביות יותר בפלטפורמות ריצוף מהדור הבא, על ידי שיפור איכותן של ספריות הריצוף.דגימות מים נלקחו משמונה אתרים שונים באגן הניקוז וספריות DNA אינדקס הוכנו מהפракציה הבקטריאלית המבודדת כפי שמוצג באלקטרופורגראם זה. ספריות DNA שהופקו מדגימות מים מתוקים לאחר PCR, אך לפני בחירת גודל אוטומטית, הכילו מקטעים בטווח גדלים של 50 זוגות בסיסים ועד 3000 זוגות בסיסים. לאחר בחירת גודל באמצעות הפלטפורמה האוטומטית בעלת התפוקה הגבוהה, הדגימות הכילו טווח צפוף של מקטעי DNA בין 500 ל-800 זוגות בסיסים. לפיכך, שימוש בפלטפורמה אוטומטית זו לבחירת גודל על ג'ל הוביל לתנובות מתאימות וצמצם את הצבירה של מקטעים בלתי רצויים מתחת ל-200 זוגות בסיסים.ריצוף DNA של ספרייה זו במכשיר ה-MiSeq הניב צפיפות קלאסטרים של 1198 K לממ"ר. אחוז הקלאסטרים שעברו את הסינונים היה 84.2% עם תפוקה מוערכת של 9.2 ג'יגה-בייט. יתרה מכך, ל-7.4 ג'יגה-בייט, או 82.8% מהקריאות, היה ציון איכות הגבוה או השווה ל-30.משמעות הדבר היא כי לכ-83% מהבסיסים שרצפו באמצעות פרוטוקול משונה זה, אשר יושם על דגימות מים מהסביבה, הייתה דיוק קריאת בסיסים של לפחות 99.9%. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק נתונים אינפורמטיביים יותר מספריות ריצוף. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור את פלקציית המיקרובים אליה אתם שואפים, את בחירת הכנת הספרייה, את אורך הפרגמנט המטרה ואת פלטפורמות הריצוף.

automated-gel-size-selection-to-improve-quality-next-generation

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

אפיון הקהילה המיקרוביאלית היה מטרה ארוכת שנים במיקרוביולוגיה סביבתית. שיטות ריצוף מהדור הבא מאפשרות כעת אפיון של קהילות מיקרוביאליות בעומק חסר תקדים עם עלות ועבודה מינימליות. אנו מפרטים כאן את הגישה שלנו לרצף גנים של RNA ריבוזומלי חיידקי 16S באמצעות רצף שולחני.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

ייצוג מופחת משופר ריצוף ביסולפיט הוא שיטה להכנת ספריות ריצוף לניתוח מתילציה של DNA המבוססת על עיכול אנזימי הגבלה בשילוב עם המרת ציטוזין ביסולפיט. פרוטוקול זה דורש 50 ננוגרם של חומר התחלתי ומניב נתוני רזולוציית זוגות בסיסים באזורים גנומיים עשירים ב-GC.

משופר מופחת ייצוג Bisulfite רצף להערכה של DNA מתילציה ברזולוציה בסיסי זוג

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) היא שיטה לכימות מתילציה של ציטוזין באזורים גנומיים ממוקדים של עניין. שיטה זו משתמשת בהמרת ביסולפיט בשילוב עם הגברת PCR של אזורי יעד לפני ריצוף הדור הבא כדי לייצר כימות מוחלט של מתילציה של DNA ברמה ספציפית לבסיס.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

מתוארת מערכת משולבת לריצוף ממוקד של הדור הבא של דגימות אונקולוגיות. מערכת חוצת פלטפורמות זו מותאמת לביופסיות גידול באיכות נמוכה ובכמות נמוכה, מתאימה לתשומות DNA נמוכות, כוללת בקרות מרובות וריאנטים מאופיינות היטב, וכוללת מתקשר וריאנט חדש המבוסס על אמצעי בקרת איכות כמותיים טרום-אנליטיים.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

אנחנו מתארים שיטה יעילה, איתנה, וחסכונית לחילוץ חומצות גרעין מן מטליות לאפיון של קהילות חיידקי באמצעות רצף amplicon הגן 16S rRNA. השיטה מאפשרת גישה עיבוד משותף סוגי מדגם מרובים ויכול להכיל מספר תהליכים טיפוליים במורד הזרם.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

הנפוץ ביותר ניתוח תוכן הבטן של macroinvertebrates הם חזותיים. הדורשים ידע אינטנסיבי ונעשית מורפולוגי של אורגניזמים טרף, הם מתגעגעים טרף גוף רך, בשל comminution חזקה של טרף, הם כמעט בלתי אפשרית עבור אורגניזמים מסוימים, כולל amphipods. אנו מספקים נתונים היסטוריים, רומן גישות גנטיות עבור macroinvertebrate טרף זיהוי בתזונה של amphipods.

פרוטוקול המעבדה הגנטית ניתוחים תוכן הבטן של הימית Macroinvertebrates באמצעות קבוצה ספציפית rDNA תחל

ג'ל-seq מאפשר חוקרים להכין בו זמנית ספריות עבור שניהם הדנ א - ו RNA-seq זניח עלות נוספת החל מ- 100-1000 תאים באמצעות מכשיר הידרוג פשוטה. המאמר מציג גישה מפורטת על הזיוף של המכשיר, כמו גם את הפרוטוקול הביולוגי כדי ליצור ספריות לזווג.

ג'ל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף DNA ו- RNA באמצעות מטריצות הידרוג

רצף proviral בודדים באורך מלא (היפוך) מספקת שיטה יעילה, תפוקה גבוהה עבור הגברה רצף של יחיד, ליד באורך מלא (שלמים ולא פגומה) HIV-1 הפרו-וירוס והיא מאפשרת קביעה של הפוטנציאל שלהם שכפול-כשירות. סלטות מתגבר על המגבלות של מבחני הקודם שנועדה רצף המאגר HIV-1 סמויה.

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

הזיהוי של האינטראקציות פיזי בין גנים לבין אלמנטים התקינה הוא מאתגר אבל כבר בהנחייתם של כרומוזום קונפורמציה ללכידת שיטות. שינוי זה בפרוטוקול 4C-seq מפחית את הסיכון של ה-PCR הטיה על-ידי צמצום יתר הגברה של תבניות ה-PCR ומגדיל את mappability את הקריאות על-ידי שילוב צעד תקציר של אנזים הגבלה תוספת.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

אנו מספקים פרוטוקול שניתן ליישם באופן כללי על אפטמרים נבחרים הנקשרים לווירוסים זיהומיים בלבד ולא לווירוסים שהפכו ללא מדבקים בשיטת חיטוי או לכל וירוסים דומים אחרים. זה פותח את האפשרות לקבוע את מצב ההדבקה בבדיקות ניידות ומהירות.

בחירה חוץ גופית של Aptamers כדי להבדיל וירוסים זיהומיים ולא זיהומיים

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה קלה למעקב לביצוע טיהור RNA פולי(A), המרת ביסולפיט והכנת ספרייה באמצעות ציוד סטנדרטי לדגימה ביולוגית מעניינת.

העשרת ספריית mRNA וביסולפיט-mRNA הכנה לריצוף הדור הבא

למדו שיטת בחירת גודל אוטומטית בג'ל לטיהור DNA ושיפור ספריות רצף הדור הבא מדגימות מים סביבתיות. טכנולוגיית Ranger מספקת אוטומציה מלאה לעיבוד 96 דגימות בו-זמנית עם דיוק גבוה.

בחירת גודל האוטומטי ג'ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

גלה סרטונים נוספים