Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק בדיקת מיקרו-פלטות תלת מימדית במבחנה, חצי אוטומטית, של פלישת תאי גידול. זה מושג על ידי יצירת סטרואידים גידוליים בגודל חוזר בהשעיה בחיבור אולטרה-נמוך עגול תחתון 96, צלחות באר בבת אחת סטרואידים בכל באר. השלב השני הוא להסיר חלקים מהמדיום ולהוסיף קרום בסיס כמו מטריצה או BMM ישירות לכל באר כדי לספק מטריצה חצי מוצקה אליה פולשים תאי הגידול מגוף הסטרואידים.

לאחר מכן, פלישת הסטרואידים של הגידול מנוטרת במרווחים לאורך תקופה של 72 עד 96 שעות שבמהלכן רכישת התמונה מתבצעת באופן אוטומטי על ציטומטר או באופן ידני במיקרוסקופ. השלב האחרון הוא ניתוח פלישת תאי הגידול באמצעות ציטומטר אוטומטי או תוכנת הדמיה. בסופו של דבר, בדיקת פלישת סטרואידים לגידול תלת מימדי משמשת למודל פלישת סרטן במבחנה בפורמט רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית וניתן למחקרי אימות ובדיקת תרופות.

אנו מאמינים שטכניקה זו משלימה את מבחני התפשטות התאים הדו-ממדיים הפשוטים המשמשים בדרך כלל לאימות מטרה ובדיקת תרופות בחקר הסרטן מכיוון שהיא גם מאפשרת לנו לחקור פלישה, שהיא היבט מרכזי של התקדמות הסרטן בפורמט תלת מימדי רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כאשר ביצעתי אופטימיזציה של הגידול התלת-ממדי phe, הגידול על מיקרופלייט. חשבתי שיהיה טוב להשתמש באותה התקנה ובמבט גם על הפלישה, והתוצאה הייתה קלה רק להסיר חלק מהמדיום מכל באר ולהחליף אותו בקרום המרתף באותה מטריצה.

הדגמה חזותית של שיטה זו חיונית מכיוון ששמירה על הסטרואידים במיקום מרכזי של כל באר לאחר מסורת ה-BMM יכולה להיות קשה בהתחלה. זה יכול לגרום לניתוח תמונה לא אופטימלי בגלל שהסטרואידים נמצאים במישורי מוקד שונים. עם ניסיון.

זה קורה לעתים רחוקות, אך במידת הצורך ניתן להקל על התהליך על ידי צנטריפוגה עדינה של הצלחת. כדי להתחיל את כל ה-BMM על ICE למשך הלילה, שמור סט של קצות סינון סטריליים עבור פיפטות P 10 E 200 ו-P 1000 וצינורות סטריליים הם מינוס 20 מעלות צלזיוס. הנח גם את החיבור הנמוך במיוחד 96 צלחות באר המכילות סטרואידים בני ארבעה ימים על קרח.

בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הסר בעדינות 100 מיקרוליטר לבאר של מצע גידול מלוחות הדרור. עבור שלב זה זווית את הקצה לכיוון הקיר הפנימי של תחתית ה-U. ובכן הימנעות ממגע עם קרקעית הבאר ומיקום הכדור.

על מנת למזער את ההפרעה של הסטרואידים באמצעות קצות קרים כקרח, העבירו את ה-BMM לצינורות קרים כקרח. לפלישה הנגרמת על ידי ציטוקינים או למחקרי הערכת תרופות, הוסף ריאגנטים ל-BMM באמצעות טיפים קרים כקרח. לדוגמה, השתמש בגורם גדילה אפידרמלי או EGF כדי לעורר פלישה של תאי קרצינומה קשקשית Cal S ו-cal r.

לאחר מכן הוציאו בעדינות 100 מיקרוליטר של ה-BMM לתוך האובו. ובכן מכוון את הקצה לכיוון הקיר הפנימי של הבאר. שלב זה הוא הקריטי ביותר.

באשר לניתוח תמונה אופטית, סטרואידים חייבים להישאר במרכז הבאר. חזור על שלב זה עבור כל הבארות הנדרשות, ואפשר חמישה עד שישה שכפולים לכל מצב. במידת הצורך, החלף לקצה צונן טרי בעזרת מחט סטרילית.

הסר בועות אם קיימות. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק ויזואלית שהסטרואידים נמצאים במיקום מרכזי אם הם לא צנטריפוגה את הצלחת ב-300 פעמים G למשך שלוש דקות של ארבע מעלות צלזיוס. זה יבטיח שסטרואידים ממוקמים במרכז כל באר.

לאחר מכן, העבירו את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ואפשרו ל-BMM להתמצק שעה לאחר מכן. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף בעדינות 100 מיקרוליטר לבאר של צמיחה מלאה. פלישה הנגרמת על ידי מדיום או ציטוקינים או מחקרי הערכת תרופות.

כלול ציטוקינים או מעכבים במדיום לרכישת תמונה אוטומטית. סרוק צלחות על הציטומטר במרווחים. החל מזמן אפס, בחר את יישום המפגש.

לאחר מכן בדוק שהסטרואידים ממוקדים. במידת הצורך, כוונן את המיקוד באופן ידני ותקן את היסט המיקוד. תחת הגדרות דגימה.

בורר סרוק שדה ראייה מרכזי אחד. לאחר הוספת BMM, סטרואידים לגידול היו צריכים להישאר במיקום מרכזי. לפיכך, אין צורך לסרוק את כל הבאר בתוכנה.

הגדר את הבארות לסריקה על ידי הדגשתן במפת הלוחות. לאחר מכן לחץ על התחל סריקה. לניתוח תמונה אוטומטי, בחר יישום מפגש.

בלשונית הניתוח, התאם את הגדרות היישום כדי לייצר פילוח מדויק סביב הסטרואידים, כולל תהליכי תאים ופודיה פולשת המשתרעת לתוך ה-BMM. התאם את ההגדרות עבור כל קו תאי גידול ו/או בנקודות זמן שונות. בדוק שהגדרות הניתוח מתאימות לסטרואידים אחרים בצלחת על ידי לחיצה על כמה בארות שונות.

אם הפילוח אינו מתאר במדויק סטרואידים, התאם עוד יותר את הגדרות היישום. לחץ על התחל ניתוח בכרטיסיית התוצאות. בדוק מספר בארות כדי לאמת את איכות הניתוח לפני ייצוא נתונים ברמת הבאר לתוכנית גיליון אלקטרוני.

חזור על הניתוח עבור כל נקודות הזמן, ולאחר מכן חשב את אחוז המפגש הממוצע עבור בארות משוכפלות ובתוספת פלישה נגד הזמן בתרשים עמודות. באמצעות גרפים מדעיים ותוכנות סטטיסטיות לבחירה לרכישת תמונה ידנית, השתמש במיקרוסקופ הפוך המצויד במטרה של 10 x כדי להקליט תמונה עבור כל סטרואיד גידול במרווחים. התחלה מ- T שווה לאפס לאחר ש- T שווה בין 72 ל- 96 שעות.

בהתאם למהירות הפלישה לרירית התא המדוברת, השתמש במטרת מט"ח כאשר שטח שפלשו אליו גדול מכדי להילכד לחלוטין בשדה הראייה של 10x. שמור כל תמונה בודדת שנרכשה לניתוח תמונה ידני. פתח את תמונות גרף הבמה לניתוח ההדמיה.

התוכנה הנבחרת לכיול היא תמונות של לקיחת גרף במה. שימוש במטרות 10 x ו-4 x. הזן את המדידות הגרפיות, היחידות והמטרות המשמשות ובצע את הכיול.

שלב זה נדרש פעם אחת בלבד לניתוח תמונה לאחר מכן. כל שעליך לעשות הוא לטעון מחדש את הגדרות הכיול הנדרשות. לאחר מכן, פתח את תמונות בדיקת הפלישה ובחר את הגדרות הכיול בהתאם למטרת המיקרוסקופ המשמשת להשגת התמונות.

מדוד את האזור המכוסה על ידי הסטרואידים בתוכנה המשמשת כאן. עבור למדידה ובחר גודל ספירה. בחר בזמן ולאחר מכן טען הגדרות ובחר הגדרות בדיקה שנקבעו מראש.

לאחר מכן בחר ספירה. לאחר מכן יש לפלח את הסטרואידים במדויק. מדידות ייצוא הן פרמטרים שונים לגיליון אלקטרוני ומתעדים את פרטי התמונה הרלוונטיים בגיליון האלקטרוני.

לבסוף, שרטט את השטח הממוצע של סטרואידים משוכפלים או פלישה לעומת זמן באמצעות גרפים מדעיים ותוכנות סטטיסטיות. מוצג כאן כדוגמה לפלישת תאים סרטניים שנצפתה בקו תאי גליובלסטומה U 87 MG, שניתן להשתמש בו כדי להדגים פלישת גידול במוח. לאחר הטמעה בתאי BMM המתפשטים עם דפוס פלישת כוכבים טיפוסי, התהליך עוקב אחר תקופה של 72 שעות.

ניתוח תמונות אוטומטי לחלוטין. שימוש בציטומטר תמונה מייצר סגמנטציה סביב בליטות התא ומאפשר כימות מדויק של פלישת תאי הגידול. שימו לב שעבור קו תאים זה, גוף הסטרואידים אינו נכלל במדידת האזור הפולש.

ניתוח תמונה אוטומטי לחלוטין מבוצע בקלות ומספק כימות של פלישת תאי הגידול לאורך זמן. דפוס שונה של פלישת תאים מוצג על ידי קשקשי אנושי, איזוגני ראש וצוואר. קווי תאים סרטניים CalS רגישים למעכבי טירוזין קינאז EG FFR, ו-CAL R עמידים להם.

בהיעדר EGF, אף אחד מקווי התאים לא פלש לתוך ה-BMM בנוכחות בליטות דמויות אצבע EGF, שחולצו מהגוף העיקרי של סטרואידים של Cal ars. בעוד שתאי Cal s היו פחות פולשניים לאחר 72 שעות, תמונות במקרה זה נרכשו במהירות באמצעות ציטומטר תמונה וכדי להדגים שיטה חלופית, מידת הפלישה כומתה באופן ידני באמצעות תוכנת ניתוח תמונה עצמאית בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שכל קו תאים צריך להיות מותאם ליכולתו ליצור סטרואידים, צפיפות זריעת התאים, הרכב המטריצה והגדרות התמונה והניתוח בעקבות הליך זה. אותה שיטה שניתן להתאים גם להערכת פלישת רקמות תלת מימדיות באמצעות, למשל, הגידולים בתרבית משותפת עם גופי עובר כדי להידמות לרקמה מורכבת או אורגנואידים אחרים כמו אסטרוציטים לגליומה או תרביות קריפטה לסרטן מערכת העיכול, או כבד לקרצינומה של הכבד וגרורות של סרטן המעי הגס.