Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לספק בדיקת מיקרופלטה תלת-ממדית, חצי-אוטומטית, למדידת פלישת תאי גידול in vitro. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירה של ספרואידים של תאי גידול בגודל הניתן לשחזור, בתליה בתוך פלטות 96 בארות בעלות תחתית עגולה עם הידבקות נמוכה במיוחד (ultralow attachment), כאשר ספרואיד אחד נמצא בכל בארה. השלב השני הוא הסרת חלקים מהתווך והוספת מטריקס דמוי ממבס (basement membrane like matrix או BMM) ישירות לכל בארה, כדי לספק מטריקס חצי-מוצק שאליו פולשים תאי הגידול מגוף הספרואיד.

בשלב הבא, פלישת הסטרואיד הגידולי מנוטרת במרווחי זמן לאורך תקופה של 72 עד 96 שעות, במהלכן מתבצעת רכישת תמונות באופן אוטומטי בציטומטר או באופן ידני במיקרוסקופ. השלב הסופי הוא ניתוח פלישת תאי הגידול באמצעות ציטומטר אוטומטי או תוכנה לניתוח תמונות. בסופו של דבר, מבחן פלישת הסטרואיד הגידולי בתלת-ממד משמש למידול פלישת סרטן in vitro בפורמט בעל רלוונטיות פיזיולוגית גבוהה יותר, המאפשר תיקוף של מטרות ומחקרי סריקת תרופות.

אנו מאמינים כי טכניקה זו משלימה את בדיקות התרבויות התאיות הדו-ממדיות הפשוטות המשמשות בדרך כלל לתיקוף מטרות ולסריקת תרופות במחקר הסרטן, מכיוון שהיא מאפשרת לנו לחקור גם פלישה (invasion), שהיא היבט מרכזי בהתקדמות הסרטן, בפורמט תלת-ממדי רלוונטי פיזיולוגית. הרעיון לשיטה זו עלה בראשי לראשונה כאשר ביצעתי אופטימיזציה ל-3D tumor phe, הצמיחה על פלטת מיקרו. חשבתי שיהיה נכון להשתמש באותה מערך ולבדוק גם את הפלישה, והתוצאה הייתה פשוטה: הסרה של חלק מהתווך מכל באר והחלפתו במטריצה הדומה לקרומי הבסיס.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא חיונית, שכן שמירה על הסטרואידים במיקום מרכזי בכל באר לאחר העברת ה-BMM עשויה להיות קשה בשלבים הראשונים. דבר זה עלול להוביל לניתוח תמונות שאינו אופטימלי עקב היות הסטרואידים במישורי מיקוד שונים. עם ניסיון.

דבר זה קורה לעיתים רחוקות, אך במידת הצורך, ניתן להקל על התהליך באמצעות סבב צנטריפוגה עדין של הפלטה. כדי להתחיל את כל תהליך ה-BMM על קרח למשך הלילה, יש לשמור סט של טיפים סטריליים עם מסנן עבור פיפטות P 10 E 200 ו-P 1000 ומבחנות סטריליות בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius. כמו כן, יש להניח על קרח את פלטות ה-96 בארות בעלות ההיחבקות הנמוכה במיוחד (ultra low attachment) המכילות סטרואידים בני ארבעה ימים.

באמצעות פיפט רב-ערוצי, הסר בעדינות 100 µL של מצע גידול מכל באער בלוחות ה-sparrow. בשלב זה, הטה את הקצה לעבר הדופן הפנימית של תחתית ה-U. הימנע כליל ממגע עם תחתית הבאר ועם מיקום ה-sphe.

על מנת למזער את הפרעת הסטרואידים, העבירו את ה-BMM לשפרויות קרות באמצעות טיפים קרים. עבור מחקרים של פלישה המושראת על ידי ציטוקינים או עבור מחקרים להערכת תרופות, הוסיפו את הריאגנטים ל-BMM באמצעות טיפים קרים. לדוגמה, השתמשו בגורם גדילה אפידרמלי או ב-EGF כדי לעורר פלישה של תאי קרצינומה סקוואמוזית מסוג Cal S ו-cal r.

לאחר מכן, העבר בעדינות 100 µL של ה-BMM אל תוך הבאר, כאשר קצה הפיפטה מכוון לעבר הדופן הפנימית של הבאר. שלב זה הוא הקריטי ביותר.

בכל הנוגע לניתוח תמונות אופטי, הסטרואידים חייבים להישאר במרכז הבאר. חזרו על שלב זה עבור כל הבארים הנדרשות, תוך השארת חמישה עד שישה חזרות לכל תנאי. במידת הצורך, החליפו לקצה טיפ מקורר וטרי באמצעות מחט סטרילית.

הסיר בועות במידה וקיימות. השתמש במיקרוסקופ כדי לוודא ויזואלית שהסטרואידים נמצאים במיקום מרכזי; אם אינם כך, סבב את הפלטה בצנטריפוגה במהירות של 300 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 4 °C. פעולה זו תבטיח שהסטרואידים ממוקמים במרכז כל באר.

בשלב הבא, העבירו את הפלטה לאנקובטור בטמפרטורה של 37 °C והמתינו שעה עד להתגבש ה-BMM. השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להוסיף בעדינות 100 µL לכל באר של מצע גידול מלא, לצורך מחקרי פלישה בהשראת ציטוקינים או מחקרי הערכת תרופות.

הוסיפו ציטוקינים או מעכבים למצע לצורך רכישת תמונות אוטומטית. סרקו את הפלטות בציטומטר במרווחי זמן. החל מזמן אפס, בחרו באפליקציית ה-confluence.

לאחר מכן, בדקו שהסטרואיד נמצא במיקוד. במידת הצורך,כווננו את המיקוד ידנית וקבעו את היסט המיקוד (focus offset). תחת הגדרות הדגימה.

סרוק שדה ראייה מרכזי אחד באמצעות הבורר. לאחר הוספת ה-BMM, הסטרואידים של הגידול אמורים להישאר במיקום מרכזי. לפיכך, אין צורך לסרוק את כל הבאר בתוכנה.

הגדירו את הבארות שייסרקו על ידי סימונן במפת הפלטה. לאחר מכן לחצו על start scan. לצורך ניתוח תמונות אוטומטי, בחרו באפליקציית confluence.

בלשונית הניתוח (analysis), התאימו את הגדרות האפליקציה כדי להפיק סגמנטציה מדויקת סביב הסטרואיד, כולל תהליכי תא (cell processes) ופודיה של הפולשים (invader podia) הנמתחים לתוך ה-BMM. התאימו את ההגדרות עבור כל קו תאי גידול ו/או בנקודות זמן שונות. בדקו שהגדרות הניתוח מתאימות לסטרואידים אחרים בלוחית על ידי לחיצה על מספר בארות שונות.

אם הסגמנטציה אינה מתווה את הסטרואיד באופן מדויק, יש להתאים את הגדרות היישום באופן נוסף. לחצו על start analysis בלשונית התוצאות. בדקו מספר בארות כדי לאמת את איכות האנליזה לפני ייצוא נתוני הבארות לתוכנת גיליון אלקטרוני.

חזור על הניתוח עבור כל נקודות הזמן, ולאחר מכן חשב את אחוז ההיתוכות (confluence) הממוצע עבור בארות השחזור ואת הפלישה ביחס לזמן בתרשים עמודות. באמצעות תוכנה סטטיסטית ותוכנה לגרפים מדעיים לבחירתך עבור רכישת תמונות ידנית, השתמש במיקרוסקופ הפוך המצויד בעדשה פי 10 כדי להקליט תמונה עבור כל ספרואיד גידולי במרווחי זמן. התחל מ-T שווה ל-0 ועד T שבין 72 ל-96 שעות.

בהתאם למהירות הפלישה של רירית התא המדוברת, השתמש בעדשת Forex כאשר שטח הפלישה גדול מדי מכדי להיתפס במלואו בשדה ראייה של 10x. שמור כל תמונה בודדת שנרכשה לצורך ניתוח תמונה ידני. פתח את תמונות ה-stage graphe בתוכנת ניתוח התמונה.

התוכנה המועדפת לכיול היא תמונות של גרף שלב שנלקחו. השתמש בעדשות 10x ו-4x. הזן את המדידות הגרפיות, את היחידות ואת העדשות שבהן נעשה שימוש, ובצע את הכיול.

שלב זה נדרש פעם אחת בלבד עבור ניתוח תמונות עוקב. פשוט טענו מחדש את הגדרות הכיול הנדרשות. לאחר מכן, פתחו את תמונות בדיקת הפלישה ובחרו את הגדרות הכיול בהתאם לעדשת המיקרוסקופ ששימשה לקבלת התמונות.

מדדו את השטח המכוסה על ידי הסטרואידים באמצעות התוכנה המשמשת כאן. עברו ללשונית measure ובחרו ב-count size. בחרו ב-while, לאחר מכן טענו את ההגדרות (load settings) ובחרו בהגדרות בדיקה שנקבעו מראש (predetermined assay settings).

לאחר מכן בחרו ב-count. הסטרואיד אמור להיות כעת מסומן (segmented) באופן מדויק. ייצאו את המדידות, שהן פרמטרים שונים, אל גיליון אלקטרוני ורשמו בגיליון את המידע הרלוונטי על התמונה.

לבסוף, שרטט את השטח הממוצע של הסטרואידים החוזרים או של הפלישה אל מול הזמן באמצעות תוכנה סטטיסטית ותוכנה לגרפים מדעיים. מוצג כאן דוגמה לפלישת תאי סרטן שנצפתה בשורת תאי הגליובלסטומה U 87 MG, שניתן להשתמש בה כדי להדגים פלישה של גידול מוחי. לאחר השקעתם, תאי ה-BMM מתפשטים בתבנית פלישה טיפוסית דמוית התפרצות כוכבים, והתהליך נמעקב במשך תקופה של 72 שעות.

ניתוח תמונה אוטומטי מלא. שימוש בציטומטר תמונה יוצר סגמנטציה מסביב לבליטות התאים ומאפשר כימות מדויק של פלישת תאי הגידול. שימו לב כי עבור קו תאים זה, גוף הסטרואידים מוחרג ממדידת שטח הפלישה.

ניתן לבצע ניתוח תמונות אוטומטי מלא בקלות, המספק כימות של פלישת תאי גידול לאורך זמן. דפוס שונה של פלישת תאים מוצג על ידי קווי תאים איזוגניים של סרטן קשקשי של בני אדם מהראש והצוואר; קו התאים Cal S רגיש למעכבי טירוזין קינאז של EGFR, בעוד ש-CAL R עמיד להם.

בהיעדר EGF, אף אחד מקווי התאים לא פלש אל ה-BMM; בנוכביות של EGF, נצפו בליטות דמויות אצבעות שהוצאו מגוף התא הראשי של Cal ars steroids. בעוד שתאי Cal s היו פחות פולשים לאחר 72 שעות, תמונות במקרה זה נרכשו במהירות באמצעות ציטומטר של תמונות (image cytometer) וכדי להדגים שיטה חלופית, מידת הפלישה כומתה ידנית באמצעות תוכנה עצמאית לניתוח תמונות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שכל קו תאים דורש אופטימיזציה של יכולתו להוות סטרואידים, צפיפות זריעת התאים, הרכב המטריקס והגדרות הדמיון והניתוח. בעקבות הליך זה, ניתן להתאים את אותה שיטה להערכת פלישה לרקמה בתלת-ממד תוך שימוש, למשל, בגידולים בתרבית משותפת (co-culture) עם גופי עוברים כדי לדמות רקמה מורכבת או אורגנואידים אחרים כמו אסטרוציטים עבור גליומה או תרביות קריפט עבור סרטני מערכת העיכול, או כבד עבור קרצינומה הפטוסלולרית וגרורות של סרטן המעי הגס.