Name: Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: למדו שיטת מיקרו-פלטה תלת-ממדית למחקר פלישת תאי סרטן באמצעות מטריקס דמוי ממברנת בסיס. שיטה זו מאפשרת ניטור התנהגות תאים בסביבה פיזיולוגית ריאליסטית יותר לסקרינג תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי המרכז הלאומי להחלפה, עידון והפחתה של בעלי חיים במחקר (G1000121 ID no.94513) ו-Oracle Cancer Trust. SE נתמך על ידי המכון לחקר הסרטן וחקר הסרטן בבריטניה (מספר מענק C309/A8274). אנו מכירים במימון NHS למרכז המחקר הביו-רפואי של NIHR.

1. דור של Spheroids גידול בגודל reproducibly <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> monolayers לשטוף תאים סרטניים עם מי מלח שנאגרו פוספט (PBS; 5 מיליליטר ל25 סנטימטר 2 או 8 - 10 מיליליטר לבקבוק 2 75 סנטימטרים), להוסיף אנזים תא דיסוציאציה (1 מיליליטר ל25 סנטימטר 2 או 2 מיליליטר ל75 סנטימטר 2 בקבוק) ותאי דגירה בC ° 37 2 - 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו ניתוק תא תחת מיקרוסקופ ולנטרל אנזים ניתוק תא עם מדיום גידול שלם (5 מיליליטר לסנטימטר 25 2 או 8 מיליליטר לבקבוק 2 75 סנטימטרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה תא צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant, לחץ על הצינור מחדש להשעות תא גלולה ב 1 מיליליטר של מדיום גידול להשלים בעזרת פיפטה P1000. זה אמור להניב השעיה תא בודדת ללא צבירי תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולדלל את ההשעיה התא להשיג 0.5-2 x 10 4 תאים / מיליליטר (צפיפות תאים אופטימלית צריכה להיקבע לשורה תאים כל אחד בoבצו להשיג spheroids גידול של 300-500 קוטר מיקרומטר 4 ימים לאחר זריעת תאי 12,13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא למאגר סטרילי ו, בעזרת פיפטה רבה, לוותר 200 μl / גם לתוך קובץ מצורף נמוך במיוחד (אולא) 96-גם צלחות תחתית עגולות 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הצלחות לאינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 95%). ארבעה ימים לאחר מכן, באופן חזותי לאשר היווצרות אליפטית גידול ולהמשיך עם assay פלישת 3D. </li></ol> 2. גידול 3D Assay ספרואיד הפלישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר BMM על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על ערכה של טיפים סינון סטרילי לP10, P200 וטפטפות P1000 וצינורות סטרילי (1.5 מיליליטר נפח גדול יותר או בהתאם לנפח כולל הנדרשים) ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את צלחות 96-היטב אולא מכילות ישן spheroids 4 ימים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רבה, להסיר בעדינות 100 μl / טוב של מדיום גידול מהצלחות אליפטית. לזווית שלב זה הטיפים לקראתיקיר nside של בארות U-התחתונה, הימנעות ממגע עם תחתית הבאר ואת המיקום של spheroids; למזער הפרעה של spheroids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת טיפים קרים כקרח, להעביר BMM לצינורות קר כקרח. לפלישה מושרה ציטוקינים או למחקרי הערכת תרופה, להוסיף חומרים כימיים (ב2x הריכוז הסופי) לBMM באמצעות טיפים קרים כקרח. לדוגמא, השתמש גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) כדי לעורר את הפלישה של קרצינומה של תאי קשקש CAL S וCAL R. מערבבים היטב על ידי מתערבל בעדינות, הימנעות היווצרותן של בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לוותר על BMM 100 μl לתוך הבאר U-התחתונה, מכוון את הקצה לכיוון הקיר הפנימי של הבאר. צעד זה הוא קריטי ביותר כ, לניתוח תמונה אופטימלי, spheroids חייב להישאר במרכז גם 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.6 עבור כל הבארות הנדרשות, המאפשרות 5-6 חזרות / מצב. במידת צורך, לשנות לקצה טרי מצונן. הערה: כאשר מנוסה יותר, dispense BMM בעזרת פיפטה רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט סטרילית, להסיר בועות, אם קיימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ, מבחינה ויזואלית לבדוק שspheroids נמצא במיקום מרכזי. אם לא, צנטריפוגות הצלחת ב XG 300 דקות 3 על 4 מעלות צלזיוס. זה יבטיח כי spheroids נמצאים במיקום מרכזי בכל טוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצלחת לחממה על 37 מעלות צלזיוס ולאפשר BMM כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 שעה מאוחר יותר, בעזרת פיפטה רבה, בעדינות להוסיף 100 μl / טוב של מדיום גידול שלם. ללימודי פלישה או הערכת תרופה מושרה ציטוקינים, כוללים ציטוקינים או מעכבים במדיום (1X ריכוז סופי). לחלופין, אם ריאגנטים לא התווספו לBMM בשלב 2.5, להוסיף אותם למדיום בשלב זה (3x הריכוז הסופי הרצוי). </li></ol> תמונה אוטומטית 3. רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות סריקה בcytometer (למפרטים ראו טבלה של ציוד וחומרים) בSTA מרווחיםrting מהזמן אפס (t0 = יום של assay הפלישה הקים, מייד לאחר שלב 2.10 עד 72 שעות, או 96 שעות לשורות תאי גידול פולשים איטיות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את היישום &#39;Confluence&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק שאליפטית היא בפוקוס ו, במידת הצורך, להתאים באופן ידני ולתקן את &quot;הפוקוס יצא-&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &#39;הגדרות דגימה&#39;, בחרו לסרוק שדה מרכזי אחד של תצוגה (FOV). בעקבות בנוסף BMM, spheroids גידול צריך נותר בעמדה מרכזית, ובכך אין צורך לסרוק את כולו גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה, להגדיר את הבארות לסריקה על ידי הדגשה אותם על מפת הצלחת. לחץ על &quot;התחל סריקה&quot;. הערה: הסריקה תישמר באופן אוטומטי וניתן לסקור מאוחר יותר off-line. </li></ol> 4. ניתוח תמונה אוטומטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר יישום &#39;Confluence&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &#39;ניתוח&#39;, להתאים ישימיםהגדרות ני (למשל, &quot;דיוק&quot;: נמוך, רגיל, גבוה; &quot;סף עוצמה&quot;: 1 - 15) כדי לייצר פילוח מדויק סביב אליפטית, כוללים תהליכים בתא וinvadopodia הארכה לBMM (ראה איור 1). התאם את ההגדרות עבור כל שורת תאים סרטניים ו / או בנקודות זמן שונות. אמצעי &#39;Confluence&#39; יישום% מהשטח גם מכוסה על ידי התאים הפולשים, בFOV נבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהגדרות הניתוח מתאימות (כלומר, הפילוח מדויק) לspheroids האחר בצלחת על ידי לחיצה על כמה בארות שונות. אם הפילוח לא מדויק להתוות אליפטית, להתאים את הגדרות יישום נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;התחל ניתוח&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &#39;התוצאות&#39;, לבדוק בארות מרובות כדי לוודא את איכות ניתוח. &quot;הנתונים ובכן רמה &#39;יצוא לתוכנת גיליונות אלקטרוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Repeaניתוח לא לכל נקודות הזמן. חשב את מפגש% הממוצע לבארות לשכפל ופלישת עלילה (מפגש%) נגד זמן בתרשים בר, באמצעות גרפים מדעיים ותוכנות סטטיסטיות של בחירה. </li></ol> 5. תמונה ידנית רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט תמונה לכל אליפטית גידול במרווחים החל מt = 0 עד 72-96 שעות, בהתאם למהירות של פלישה של הקו הסלולרי בשאלה, באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (לצלחת 96-היטב זה לוקח בערך 20 - 30 דק &#39;). השתמש אובייקטיבי 10X. השתמש אובייקטיבי 4X כאשר האזור פלש גדול מדי כדי לנפול בפח לחלוטין בתחום 10X מבט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציל את כל תמונה בנפרד רכשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכיול, לקחת תמונות של רשת הגאוגרפית שלב (1 מ&quot;מ) בשתי מטרות 10X ו4X (ולשמור את התמונות). </li></ol> 6. ניתוח תמונה ידני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תמונות רשת הגאוגרפית שלב לתוך תוכנת ניתוח תמונה של בחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את gratמדידות icule, היחידות (מיקרומטר), מטרות שימוש (10X או 4X) ולבצע את הכיול. צעד זה נדרש רק פעם אחת. לניתוח תמונה שלאחר מכן, פשוט לטעון מחדש את הגדרות כיול הנדרשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תמונות assay פלישה ובחר את הגדרות הכיול בהתאם למטרת מיקרוסקופ (10X או 4X) משמש כדי לקבל את התמונות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לייבא תמונות שהתקבלו בהדמית cytometer (שלב 3) ולנתח באופן ידני, כפי שתוארו עבור תמונות המתקבלות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (ראה תוצאות מוצגות באיור 3 ואיור 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את השטח המכוסה על ידי spheroids. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה המשמשת כאן לנציגי התוצאות (למפרטים ראו טבלה של ציוד וחומרים), ללכת ל&#39;מדוד &#39;ובחר&#39; רוזן / גודל &quot;. בחרת &#39;קובץ&#39; ולאחר מכן &#39;הגדרות טען&#39; ובחר אסא-שנקבע מראשהגדרות y. לאחר מכן בחר &#39;רוזן&#39;. אליפטית אמורה להיות מפולח בצורה מדויקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין ללכת ל&#39;ערוך &#39;ולאחר מכן&#39; צייר / מיזוג אובייקטים &quot;לפתוח חלון&quot; שרביט קסמים / עקבות &#39;. השתמש בסמן השרביט ללחץ על תמונת אליפטית ולקבל פילוח. בחירה &#39;עקבות&#39; (בחלון &#39;שרביט הקסמים&#39;) מתאר באופן ידני אליפטית באמצעות עכבר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידות יצוא של פרמטרים שונים (אזור, קוטר, היקף וכו &#39;) לגיליון אלקטרוני. שיא בגיליון האלקטרוני המידע על תמונה הרלוונטית (למשל, גם מספר, נקודת זמן היחסית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה האזור הממוצע של spheroids לשכפל (פלישה) לעומת זמן באמצעות גרפים מדעיים ותוכנה סטטיסטית. לחלופין, לחשב את השינוי בשטח אליפטית בכל נקודת זמן, יחסית לאזור בזמן t = 0. ואז פלישת עלילה (t0%) לעומת זמן כמו הגר&quot;א ליניאריph. </li></ol>

<ol><li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+therapeutics%22%5BJournal%5D)">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology & therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li>
<li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Dimensional+vs.+Three-Dimensional+In+Vitro+Tumor+Migration+and+Invasion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays.</a> Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).</li>
<li>Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia+formation+in+oral+squamous+cell+carcinoma%3A+the+role+of+epidermal+growth+factor+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral.+Biol%22%5BJournal%5D)">Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling.</a> Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+invadopodia+formation+for+lung+carcinoma+invasion+with+a+microfluidic+3D+culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device.</a> PLoS One. 8 (2), e56448(2013).</li>
<li>Friedl, P., Alexander, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+invasion+and+the+microenvironment%3A+plasticity+and+reciprocity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity.</a> Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).</li>
<li>Brekhman, V., Neufeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+asymmetric+3D+in-vitro+assay+for+the+study+of+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion.</a> BMC Cancer. 9, 415(2009).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).</li>
<li>Deisboeck, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+self-organization+in+tumour+systems%3A+complex+growth+dynamics+in+a+novel+brain+tumour+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model.</a> Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).</li>
<li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth%2C+invasion+and+drug+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), e10431(2010).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29(2012).</li>
<li>Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods and Protocols. , 253-266 (2013).</li>
<li>Box, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+serum+protein+signature+associated+with+resistance+to+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).</li>
<li>Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+growth+factors+on+invasion+and+proliferation+of+endocrine+resistant+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (7), e41847(2012).</li>
<li>Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascin-C+is+expressed+by+human+glioma+in+vivo+and+shows+a+strong+association+with+tumor+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+tissue+research%22%5BJournal%5D)">Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels.</a> Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).</li>
<li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li>
<li>Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+glioblastoma+cells+acquire+stemness+and+increased+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation.</a> Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).</li>
</ol>

כל המחברים מצהירים שום ניגוד מתחרה של עניין.

שני דגמי הגידול מתוארים כאן (גליובלסטומה וSCCHN) נבחרו במיוחד כדי להדגים assay 3D שלנו כפי שהם קליניים סרטן פולשני המקומי רלוונטי עם צורך מסופק לטיפולים יעילים 12. בעקבות טיפול תרופתי, הערכה במבחנה שינויי pharmacodynamic סמן ביולוגי (PD) יכול להתבצע בקלות על ידי כתם או immunoassays של lysates המערביים בעקבות השימוש בחומרים כימי זמינים מסחרי ספציפיים כדי לאפשר התאוששות תא מBMM ו / או ניתוח immunofluorescent של פלישת spheroids גידול על ידי כל צביעת הר. assay הפלישה זוהי טכניקה שימושית להערכה מהירה ושחזור של פלישת תאים סרטניים למדיום מוצק למחצה, ולכן מתאימה במיוחד לעתיד בהקרנת סמים מבחנה. תאים סרטניים לפלוש המטריצה ​​באופן 3D כפי שהם פרושים מ&quot; מיקרו-גידול &quot;, מיוצג על ידי אליפטית הגידול, ולהרחיב לextracellulסביבה כמו מטריקס-AR. תלת-ממדית האמיתית של assay ניכר במורפולוגיה התא, שהוא שונה מהמורפולוגיה השטוחה, תאים חסיד להניח בעת מעבר על מצע מוצק. התואר של פלישה הוא לכמת בקלות תוך שימוש בהדמיה cytometer, המאפשר אוטומטי לקריאה החוצה, או על ידי שימוש במיקרוסקופ רגיל בשילוב עם תוכנת הדמיה. יתר על כן, שיטה זו מתאימה להדמיה ניאון 13 (לדוגמא עם שורות תאים לבטא חלבונים או ניאון מראש שכותרתו עם צבעי ניאון). השיטה היא פשוטה לביצוע עם השלב הקריטי רק מיוצג על ידי התוספת של BMM, כאשר קיים סיכון של הפרעה לעמדה של אליפטית במרכז בצורה U-היטב. זה יכול לגרום לניתוח תמונה הכי מוצלח, עם spheroids במטוסי מוקד שונים. לכן זה קריטי כדי להוסיף BMM בזהירות ולאט לאט זה טוב. לאחר תוספת BMM רצוי כדי לבדוק את הצלחתתחת מיקרוסקופ ואם הלוקליזציה נחשבת מקובלת, זה ניתן לתיקון על ידי צנטריפוגה העדינה. עם ניסיון, זה רק לעתים נדירות יש צורך. בעוד ששיטה זו היא חזקה ומאוד לשחזור, וריאציה בין-ניסיונית עלולה להתרחש עם קבוצות שונות של BMM. כדי להימנע מכך, מומלץ לרכוש BMM מספיק מתצווה אחת כדי להשלים סדרה של מחקרים. מגבלה של השיטה (כמו לכל מבחני כאלה) היא הקושי בהבחנה בין הפלישה והתפשטות, שתאי הגידול צפויים לעבור במהלך מסגרת זמן assay. למרות זמן ההכפלה של תאים יכול להילקח בחשבון, או מעכבי מחזור התא כגון cytochalasin D הציגו, זה לא קל לשלוט או בבירור להבחין בין שני היבטים שונים אלה של התקדמות גידול, במיוחד לתאי גידול גדלו במהירות ועבור אלה ש יש דפוס יותר &quot;רחב&quot;, ולא הסתנן, פלישה. מהסיבה הזוהוא הציע שassay צמיחת 3D מקביל מתבצע כדי לבדוק את ההשפעות ספציפיות של כל סוכנים מעכבים או גירוי. אם מחקרי תגובת מינון זהיר מבוצעים, זה עשוי להיות אפשרי כדי לבחור ריכוזים שלמזער את ההשפעות על התפשטות. לדוגמא שהראינו כי Hsp90 מעכב 17-AAG מעכב U-87 פלישת אליפטית גידול MG 3D כבר בשעה 24 ובריכוזים נמוכים ריכוז עיכוב צמיחת 3D ב -50% (GI 50) 12. מצד השני, את המשמעות של assay זה בהשוואה למבחני פלישה סטנדרטית אחרים (למשל, מבחני סינון מבוסס או פלישה של תאים בודדים למטריצות 1 3D), הוא שתאים סרטניים לפלוש לתוך המטריצה ​​מקיפה מאליפטית, שדומה &quot; מיקרו-גידול &quot;או&quot; מיקרו-גרורות &quot;, ולכן לוקח בחשבון היבטים חשובים של הפתופיזיולוגיה של מסת גידול. אנו מציגים השיטה מספקת מידע עלהתנהגות קולקטיבית של תאים סרטניים, כאשר בתחילה לעזוב את spheroids, וגם באופן אישי, כאשר תאים בודדים להגיע אזורים מרוחקים יותר בBMM. בנוסף, תאים בתוך הגידול spheroids עלולים לחוות מחסור היפוקסיה ומזין אשר, דרך שינויים בביטוי גנים, יכול לקדם את ההגירה ופלישה; תכונות כגון נעדרות במבחני 2D. יתר על כן, כל זה הוא זמין בפורמט תפוקה גבוהה באמצעות השימוש בלוחות 96-גם ספציפיים וטכנולוגיית ההדמיה האחרונה, מאפשר assay 3D מורכב יותר לשמש בקלות ביעד אימות וגילוי תרופות. אנו מציגים שיטה יכולה להכיל יישומים נוספים כדי לטפל בהיבטים נוספים של פלישת תאים סרטניים. בפרט, מורכבות נוספת ניתן בחזון על ידי התוספת של תאי מארח, כגון fibroblasts ו / או בתאי האנדותל, לעצמו או אליפטית המטריצה ​​שמסביב. זה גם יכול להיות שונה, לא רק במונחים של נוקשות (על ידי השימוש בשיתוף שונהncentrations של BMM), אלא גם במונחים של הרכב (על ידי התוספת של רכיבים אחרים תלויים ברקמה / איבר המסוים של המודל שאומץ על הגידול: למשל, tenascin לסרטן המוח 16 וקולגן לסרטן השד 17). הגדרה דומה (דור של spheroids והדמיה) יכולה גם להיות מותאם כדי להעריך פלישת רקמה ב3D, שבו spheroids גידול הוא שיתוף תרבותי עם גופי embryoid הדומים רקמה מורכבת 12 או עם organoids תא ספציפי אחר (למשל, האסטרוציטים ל תרבויות גליומה 18 או קריפטה לסרטן במערכת העיכול), אבל עבודה נוספת נדרשת על מנת לאפשר ניתוח תמונה אוטומטי.

פיתוח תרופות נגד הסרטן קלאסי הוא ממוקד במידה רבה על השימוש במבחני חוץ גופייה מבוסס תאים למסך לחומרים ציטוטוקסיים המעכבים התפשטות תאים סרטנית ו / או לקדם מוות מתוכנת של תאים (אפופטוזיס). לאחרונה, מאמצים עברו לטיפולים ממוקדים בפיתוח מעכבי הגורמים המולקולריים שבבסיס של התפשטות תאים ממארת. למרות כמה תוצאות מרהיבות, סוכנים כאלה הקשורים לעתים קרובות עם ההתפתחות המהירה של עמידות לתרופות. בהתחשב בכך שזה הפוטנציאל פולשני וגרורתי של תאים סרטניים שאחראית למרבית מקרי מוות מסרטן, וכי מחלת הישנות לעתים קרובות מציגה פנוטיפ אגרסיווי יותר, זה הגיוני גם לשקול משלים במודלים ניסיוניים מבחנה 1,2 לזהות רומן סוכנים שימנעו &quot;סימני ההיכר&quot; אלה נוספים מפתח של הסרטן. במהלך התקדמות ממארת, תאי גידול לרכושהיכולת לפלוש לרקמות שמסביב ו / או להפיץ לאיברים מרוחקים (גרורות). תאים סרטניים לחדור את הקרום במרתף על ידי ההיווצרות של invadopodia 3,4. מבנים אלה מועשרים בסיבים אקטין, חלבוני הדבקה ספציפיים וproteinases וקולקטיביים אחראים לתנועתיות של תאי גידול והשפלה של מטריקס (ECM) 5. Invadopodia להאריך לתוך ECM והם האמינו להיות חשובים לפלישת תאים סרטניים וגם extravasation לערוצי כלי דם, להקל hematogenous הפצה (או הלימפה) וגרורות. שיטות מקובלות כיום להעריך פלישת תאים סרטניים במבחנה כוללת את הבאים. מבוסס transwell או מבחני קאמריים בוידן 2,6 בי השעיות תא בודדות הם זורעים על גבי מסנן מצופה בשכבה עבה של חלבונים המופק מECM. תאים אז לפלוש ולעבור לתא התחתון בתגובה לכימותרפיה-attractant. ECM הנפוץחלבונים הם סוג אני קולגן, או מטריצת מרתף כמו קרום (BMM, למשל, Matrigel, הנגזרת מהגידול EHS 7) המחקה את ההרכב הטבעי של ממברנות מרתף. כחלופה למבחני סוג תא וידן מבוססת מסנן 8, יכולים להיות שנזרעו תאים על גבי ג&#39;ל ECM (שניתן להוסיף fibroblasts) שבו הם יוצרים monolayer ולאחר מכן בנפרד או ביחד לפלוש לתוך הג&#39;ל. פלישה ניתן למדוד במונחים של מספר התאים פולשים ו / או מרחק שעובר ממשטח ג&#39;ל 9. תאים סרטניים יכולים גם להיות מוטבעים לחלוטין לתוך מטריצה ​​או כהשעית תא בודדת או כspheroids - בדרך כלל ממוקם בין שתי שכבות של ג&#39;ל ECM מאפשרות לתאים לפלוש מחוץ למסת הגידול לתוך המטריצה ​​מקיפה 2,6,10,11. Assay תלת ממדי (3D) אליפטית גידול הפלישה המתוארת כאן מספק מערכת מהירה, automatable פלישה באמצעות highlשיטת y לשחזור, סטנדרטית 12 בפורמט צלחת 96-היטב עם אליפטית אחד בכל טוב. BMM מתווסף כל גם ישירות לספק מטריצת חצי מוצקה שאליו תאים סרטניים לפלוש מהגוף אליפטית. של פלישת תאים סרטני המידה מנוטרת במרווחים על פני תקופה של 72-96 שעות. שיטה זו מספקת את היתרונות הבאים על מבחני פלישה הנוכחיים במבחנה שהוזכרו לעיל: גידול תאים מאורגנים במבנה 3D מחקה מייקר אזור גידול או מיקרו-גרורות; spheroids הגידול הוא מאוד לשחזור בגודל; assay הפלישה מתבצע באתר באותה הצלחת כמו פיתוח אליפטית גידול, ללא הצורך להעביר אותם לצלחות המשניות; השיטה, בשילוב עם הטכנולוגיות החדישות ביותר של ניתוח תמונה אוטומטי, מאפשרת הן תכולה גבוהה ותפוקה גבוהה מנתח של פלישת תאים סרטניים. ניתוח התמונה מתבצע באמצעות הדמיה cytometer, אשר סורק 96-היטבצלחת בתוך 10 דקות. על ידי שימוש ביישום המפגש, השיעור של פלישת המידה ולהשיג גם על ידי תאים בודדים או על ידי צבירי תאים מתפשטים החוצה מspheroids הגידול ופולש לתוך המטריצה ​​ניתן למדוד באופן דינמי. לתפוקה נמוכה יותר, שיטה חלופית לניתוח תמונה מוצגת, המבוססת על השימוש במיקרוסקופ הפוכה ותוכנת הדמיה סטנדרטית.

<table><tbody><tr><td>מטריקס ממברנת בסיס Corning Matrigel</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>354234</td><td>שמור ב- 4 &amp;deg;C כדי למנוע התגבשות, יש להעביר באמצעות טיפי פיפטה מקוררים</td></tr><tr><td>תמצית קרומי בסיס Cultrex, PathClear</td><td><a href="http://www.trevigen.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Trevigen</a></td><td>3432-005-01</td><td>שמור ב- 4 &amp;deg;C כדי למנוע התמצקות, יש להעביר באמצעות טיפים של פיפטה מקוררים</td></tr><tr><td>פלטת 96 בארות בעלת היצמדות נמוכה במיוחד (Ultra-low attachment)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td><a href="http://www.miltenyibiotec.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Miltenyi Biotec</a></td><td>130-093-825</td><td>הוסף 100 &amp;mu;l 1% BSA (w/v) במים ל- 100 &amp;mu;g EGF. אל 25 &amp;mu;l מזה, הוסף 4,975 &amp;mu;l מצע RHB-A כדי לתת 5 &amp;mu;g/ml מלאי עבודה. יש לחלק לאליקוטים ולאחסן ב-20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>מצע RHB-A</td><td><a href="http://www.stemcellsinc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Stem Cells Inc.</a></td><td>SCS-SF-NB-01</td><td>לדילול EGF</td></tr><tr><td>DMEM</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>31966-021</td><td>חמם ב- 37 &amp;deg;C אמבט מים לפני השימוש</td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td><a href="http://www.biosera.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Biosera</a></td><td>1001/500</td><td>חמם ב- 56 &amp;deg;C להשבתת המשלים לפני השימוש</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>12605</td><td>תמיסות לפירוק תאים</td></tr><tr><td>סייטומטר Celigo</td><td><a href="http://www.nexcelom.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Nexcelom Bioscience</a></td><td>לא רלוונטי</td><td>ציוד ייעודי ללכידת תמונות וניתוחן. לכידה ידנית של תמונות באמצעות מיקרוסקופיה ותוכנה עצמאית לניתוח תמונות מהוות חלופה.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך IX70</td><td><a href="http://www.olympus.co.uk/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Olympus</a></td><td>לא רלוונטי</td><td>בשימוש עם מצלמה לצילום תמונות ידני</td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית Retiga Exi Fast 1394</td><td><a href="http://www.qimaging.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Qimaging</a></td><td>לא רלוונטי</td><td>מחובר למיקרוסקופ לצילום תמונות ידני</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> סייברנטיקה של מדיה</a></td><td>לא רלוונטי</td><td>תוכנה המשמשת לשליטה במצלמה ובמיקרוסקופ לצורך לכידה ידנית של תמונות</td></tr><tr><td>Image-Pro Analyzer 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> מדעי הסייברניקה של המדיה</a></td><td>לא רלוונטי</td><td>תוכנה עצמאית לניתוח תמונות למדידה ידנית של גודל ספרואידים</td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td><a href="http://www.microsoft.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Microsoft</a></td><td>לא רלוונטי</td><td>תוכנה לגרפים מדעיים וניתוח סטטיסטי</td></tr><tr><td>Prism 6.0</td><td><a href="http://www.graphpad.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GraphPad</a></td><td>לא רלוונטי</td><td>תוכנות לגרפים מדעיים ולניתוח סטטיסטי</td></tr></tbody></table>

assay (3d) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

פלישה של רקמות הסובבות נורמליות נחשבת בדרך כלל להיות סימן היכר מרכזי של ממאיר (בניגוד לשפיר) גידולים. לסוגים מסוימים של סרטן בפרט (לדוגמא, גידולים במוח כגון multiforme גליובלסטומה וקרצינומה של תאי קשקש של הראש וצוואר -. SCCHN) הוא סיבה לתחלואה קשה ויכולים להיות גם בהיעדרו של גרורות מרוחקות סכנת חיים. בנוסף, סרטן שההישנות לאחר טיפול למרבה הצער לעתים קרובות נוכחי עם פנוטיפ אגרסיווי יותר. לכן, יש הזדמנות למקד את התהליך של פלישה לספק טיפולים חדשניים שיכול להיות משלימים לסוכנים אנטי-שגשוג סטנדרטיים. עד עכשיו, אסטרטגיה זו כבר הקשתה על ידי חוסר מבחני חזקים, שחזור מתאימים לניתוח מפורט של פלישה ולהקרנת סמים. כאן אנו מספקים שיטת מיקרו-צלחת פשוטה (המבוסס על מדים, spheroids גידול 3D להרכבה עצמית) שיש לו פוטנציאל גדול לסטו כגוןמת. אנחנו מדגימים את פלטפורמת assay באמצעות קו אנושי תא גליובלסטומה וגם מודל SCCHN בי הפיתוח של התנגדות נגד הקולטן לגורם צמיחת אפידרמיס ממוקד מעכבים (EGFR) קשור עם פוטנציאל מטריצה ​​פולשנית משופר. כמו כן אנו מספקים שתי שיטות חלופיות של כימות חצי אוטומטי: אחת באמצעות הדמיה cytometer ושני שפשוט דורש ללכוד מיקרוסקופיה ותמונה רגילה עם ניתוח תמונה דיגיטלי.

פלישת אליפטית גידול 3D נבחנת באמצעות שיטה פשוטה, לשחזור, אוטומטית מאוירת באופן סכמטי באיור 1: spheroids גידול reproducibly בגודל מתקבל על ידי תאי ציפוי לאולא 96-גם צלחות תחתית עגולות. spheroids הודעה הייזום-4 ימים מוטמע בBMM. זה מספק מבנה מוצק למחצה לתוכו תאים סרטניים לפלוש ופרושים של אליפטית. Spheroids נמצא במיקום מרכזי בבסיס של כל טוב והפלישה לBMM מנוטר בקלות במרווחים החל מt = 0 עד 72-96 שעות באמצעות הדמיה cytometer. זה יכול לספק ניתוח תמונה אוטומטי לחלוטין. דוגמאות לסוגים שונים של פלישת תאים הסרטניים של מומחשות באיורים 2 -. 4 multiforme גליובלסטומה אדם הקו הממאיר ביותר (GBM) התא U-87 MG, יוצר מבנה 3D הדוק, כדורי ומשמש כאן כדי להדגים גידולים במוח שבו מקומי פלישה היא סכנת חיים מפתחתכונה. משובץ ברגע בBMM, ​​תאים מspheroids U-87 MG התפשט עם דפוס פלישה טיפוסי &quot;מספרים&quot; 12. תאי גידול להאריך רדיאלית לתוך המטריצה ​​שבה הם שומרים על צורה 3 ממדים. התהליך אחרי על פני תקופה של 72 שעות, כפי שמוצג באיור 2 לU-87 spheroids MG, כאשר היקף פלישת תאים סרטניים, עם פרטים של התהליכים התאיים וinvadopodia הארכה לBMM הוא ברור מאליו. באופן מלא אוטומטי ניתוח תמונה באמצעות תמונה cytometer מאפשר כימות מדויק של פלישת התאים הסרטניים לאורך זמן. הכימות באיור 2 מתקבל כפי שמודגם באיור 1, שבו הניתוח האוטומטי מייצר פילוח סביב בליטות תא הארכה לBMM מ- 87 U MG גוף אליפטית. שים לב שעבור קו תא זה, גוף אליפטית הגידול נכלל במדידה של האזור פלש. דפוס של invas שונההיון הוצג על ידי שורות תאי הסרטן אנושיות קשקש של ראש וצוואר. CAL S וCAL R הוא isogenic אבל CAL S הוא רגיש ל, וCAL R עמיד למעכבי טירוזין קינאז EGFR 14. בהעדר EGF, שורת תאים לא פלשה לBMM (איור 3) עם זאת, כריכוז של EGF הוגדל (2.5 ng / ml), spheroids נראה &#39;ניצן&#39;. בריכוזים גבוהים יותר של EGF (מיליליטר / 40 ו- 80 ng) את מידת הפלישה הופחת. זה עולה בקנה אחד עם התגובה הקלסית דמוי פעמון המינון לEGF במונחים של פלישה שכבר דווחה בעבר 15. ב 20 ng / ml EGF, בליטות כמו אצבע-נמתחים מהגוף העיקרי של spheroids CAL R תוך תאי CAL S היו פחות פולשני לאחר 72 שעות (איור 3). פלישת ההפרש הזה הייתה ברורה 48 שעות לאחר spheroids הונח לBMM (המכיל 20 ng / ml EGF להבחנה המרבית בין שורות תאים) והגדול ביותר אחרי 72 שעות (איור 4). תמונות אלה נרכשו במהירות באמצעות הדמיה cytometer, כלU-87 MG. עם זאת, במקרה זה, כדי להדגים שיטה חלופית, את מידת הפלישה הייתה לכמת באופן ידני באמצעות תוכנת ניתוח תמונה עצמאית ומוצגת באופן גרפי (איורים 3 ו -4). תוצאות אלו ממחישות את הבדל בין תאי פנוטיפי תרופה רגישים ו-resistant שיכול להיות מנוצל כדי להקרין לתרכובות שדווקא שנאה מצד פנוטיפ עמיד, פולשני הסמים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> איור 1. סקירה סכמטי של assay פלישת אליפטית גידול 3D. העבודה מציגה את שלבי השיטה כרוכה כולל תמונות נציג של spheroids U-87 MG גליובלסטומה רק לאחר ההטבעה לתוך BMM (פנל עליון; t = 0) ולאחר פלישה<html> לBMM (פנל תחתון; t = 72 שעות) עם ובלי הפילוח המודד את האזור המכוסה על ידי התאים הפולשים. בר = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> כימות איור 2. זמן-במהלך פלישת U-87 MG אליפטית גליובלסטומה לBMM. U-87 MG אליפטית פלישת 3D לBMM הייתה פיקוח ולכמת עד 72 שעות באמצעות הדמיה cytometer. () תמונות ונציג (ב) פלישת תאים סרטניים מוצגת. בר = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> מחדש 3 &quot;src =&quot; / קבצים / ftp_upload / 52,686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. CAL R (עמיד) וCAL S פלישה (רגישה) אליפטית גידול. (א) נציג תמונות וכימות ידני של R EGF תלוי מינון CAL ופלישת אליפטית גידול CAL S (B) מוצגים. בר = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> איור 4. תאים מCAL R spheroids (עמיד) הם יותר חודרני מאשר S spheroids גידול CAL (רגיש) כאשר הניחו BMM. עם spheroids גידול גירוי EGF CAL R להראות פלישה בולטת יותר מאשר כאל S. (א) נציג תמונות וכימות ידני של פלישה (B) מוצג. בר = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

פלישה לרקמות נורמליות שמסביב היא מאפיין מגדיר של גידולים ממאירים. אנו מספקים כאן מבחן מיקרו-צלחת פשוט ואוטומטי למחצה של פלישה לביומטריצה תלת מימדית טבעית שהודגמה במספר מודלים של סרטן אנושי מתקדם.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לספק בדיקת מיקרופלטה תלת-ממדית, חצי-אוטומטית, למדידת פלישת תאי גידול in vitro. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירה של ספרואידים של תאי גידול בגודל הניתן לשחזור, בתליה בתוך פלטות 96 בארות בעלות תחתית עגולה עם הידבקות נמוכה במיוחד (ultralow attachment), כאשר ספרואיד אחד נמצא בכל בארה. השלב השני הוא הסרת חלקים מהתווך והוספת מטריקס דמוי ממבס (basement membrane like matrix או BMM) ישירות לכל בארה, כדי לספק מטריקס חצי-מוצק שאליו פולשים תאי הגידול מגוף הספרואיד.בשלב הבא, פלישת הסטרואיד הגידולי מנוטרת במרווחי זמן לאורך תקופה של 72 עד 96 שעות, במהלכן מתבצעת רכישת תמונות באופן אוטומטי בציטומטר או באופן ידני במיקרוסקופ. השלב הסופי הוא ניתוח פלישת תאי הגידול באמצעות ציטומטר אוטומטי או תוכנה לניתוח תמונות. בסופו של דבר, מבחן פלישת הסטרואיד הגידולי בתלת-ממד משמש למידול פלישת סרטן in vitro בפורמט בעל רלוונטיות פיזיולוגית גבוהה יותר, המאפשר תיקוף של מטרות ומחקרי סריקת תרופות.אנו מאמינים כי טכניקה זו משלימה את בדיקות התרבויות התאיות הדו-ממדיות הפשוטות המשמשות בדרך כלל לתיקוף מטרות ולסריקת תרופות במחקר הסרטן, מכיוון שהיא מאפשרת לנו לחקור גם פלישה (invasion), שהיא היבט מרכזי בהתקדמות הסרטן, בפורמט תלת-ממדי רלוונטי פיזיולוגית. הרעיון לשיטה זו עלה בראשי לראשונה כאשר ביצעתי אופטימיזציה ל-3D tumor phe, הצמיחה על פלטת מיקרו. חשבתי שיהיה נכון להשתמש באותה מערך ולבדוק גם את הפלישה, והתוצאה הייתה פשוטה: הסרה של חלק מהתווך מכל באר והחלפתו במטריצה הדומה לקרומי הבסיס.הדגמה חזותית של שיטה זו היא חיונית, שכן שמירה על הסטרואידים במיקום מרכזי בכל באר לאחר העברת ה-BMM עשויה להיות קשה בשלבים הראשונים. דבר זה עלול להוביל לניתוח תמונות שאינו אופטימלי עקב היות הסטרואידים במישורי מיקוד שונים. עם ניסיון.דבר זה קורה לעיתים רחוקות, אך במידת הצורך, ניתן להקל על התהליך באמצעות סבב צנטריפוגה עדין של הפלטה. כדי להתחיל את כל תהליך ה-BMM על קרח למשך הלילה, יש לשמור סט של טיפים סטריליים עם מסנן עבור פיפטות P 10 E 200 ו-P 1000 ומבחנות סטריליות בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius. כמו כן, יש להניח על קרח את פלטות ה-96 בארות בעלות ההיחבקות הנמוכה במיוחד (ultra low attachment) המכילות סטרואידים בני ארבעה ימים.באמצעות פיפט רב-ערוצי, הסר בעדינות 100 µL של מצע גידול מכל באער בלוחות ה-sparrow. בשלב זה, הטה את הקצה לעבר הדופן הפנימית של תחתית ה-U. הימנע כליל ממגע עם תחתית הבאר ועם מיקום ה-sphe.על מנת למזער את הפרעת הסטרואידים, העבירו את ה-BMM לשפרויות קרות באמצעות טיפים קרים. עבור מחקרים של פלישה המושראת על ידי ציטוקינים או עבור מחקרים להערכת תרופות, הוסיפו את הריאגנטים ל-BMM באמצעות טיפים קרים. לדוגמה, השתמשו בגורם גדילה אפידרמלי או ב-EGF כדי לעורר פלישה של תאי קרצינומה סקוואמוזית מסוג Cal S ו-cal r.לאחר מכן, העבר בעדינות 100 µL של ה-BMM אל תוך הבאר, כאשר קצה הפיפטה מכוון לעבר הדופן הפנימית של הבאר. שלב זה הוא הקריטי ביותר.בכל הנוגע לניתוח תמונות אופטי, הסטרואידים חייבים להישאר במרכז הבאר. חזרו על שלב זה עבור כל הבארים הנדרשות, תוך השארת חמישה עד שישה חזרות לכל תנאי. במידת הצורך, החליפו לקצה טיפ מקורר וטרי באמצעות מחט סטרילית.הסיר בועות במידה וקיימות. השתמש במיקרוסקופ כדי לוודא ויזואלית שהסטרואידים נמצאים במיקום מרכזי; אם אינם כך, סבב את הפלטה בצנטריפוגה במהירות של 300 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 4 °C. פעולה זו תבטיח שהסטרואידים ממוקמים במרכז כל באר.בשלב הבא, העבירו את הפלטה לאנקובטור בטמפרטורה של 37 °C והמתינו שעה עד להתגבש ה-BMM. השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להוסיף בעדינות 100 µL לכל באר של מצע גידול מלא, לצורך מחקרי פלישה בהשראת ציטוקינים או מחקרי הערכת תרופות.הוסיפו ציטוקינים או מעכבים למצע לצורך רכישת תמונות אוטומטית. סרקו את הפלטות בציטומטר במרווחי זמן. החל מזמן אפס, בחרו באפליקציית ה-confluence.לאחר מכן, בדקו שהסטרואיד נמצא במיקוד. במידת הצורך,כווננו את המיקוד ידנית וקבעו את היסט המיקוד (focus offset). תחת הגדרות הדגימה.סרוק שדה ראייה מרכזי אחד באמצעות הבורר. לאחר הוספת ה-BMM, הסטרואידים של הגידול אמורים להישאר במיקום מרכזי. לפיכך, אין צורך לסרוק את כל הבאר בתוכנה.הגדירו את הבארות שייסרקו על ידי סימונן במפת הפלטה. לאחר מכן לחצו על start scan. לצורך ניתוח תמונות אוטומטי, בחרו באפליקציית confluence.בלשונית הניתוח (analysis), התאימו את הגדרות האפליקציה כדי להפיק סגמנטציה מדויקת סביב הסטרואיד, כולל תהליכי תא (cell processes) ופודיה של הפולשים (invader podia) הנמתחים לתוך ה-BMM. התאימו את ההגדרות עבור כל קו תאי גידול ו/או בנקודות זמן שונות. בדקו שהגדרות הניתוח מתאימות לסטרואידים אחרים בלוחית על ידי לחיצה על מספר בארות שונות.אם הסגמנטציה אינה מתווה את הסטרואיד באופן מדויק, יש להתאים את הגדרות היישום באופן נוסף. לחצו על start analysis בלשונית התוצאות. בדקו מספר בארות כדי לאמת את איכות האנליזה לפני ייצוא נתוני הבארות לתוכנת גיליון אלקטרוני.חזור על הניתוח עבור כל נקודות הזמן, ולאחר מכן חשב את אחוז ההיתוכות (confluence) הממוצע עבור בארות השחזור ואת הפלישה ביחס לזמן בתרשים עמודות. באמצעות תוכנה סטטיסטית ותוכנה לגרפים מדעיים לבחירתך עבור רכישת תמונות ידנית, השתמש במיקרוסקופ הפוך המצויד בעדשה פי 10 כדי להקליט תמונה עבור כל ספרואיד גידולי במרווחי זמן. התחל מ-T שווה ל-0 ועד T שבין 72 ל-96 שעות.בהתאם למהירות הפלישה של רירית התא המדוברת, השתמש בעדשת Forex כאשר שטח הפלישה גדול מדי מכדי להיתפס במלואו בשדה ראייה של 10x. שמור כל תמונה בודדת שנרכשה לצורך ניתוח תמונה ידני. פתח את תמונות ה-stage graphe בתוכנת ניתוח התמונה.התוכנה המועדפת לכיול היא תמונות של גרף שלב שנלקחו. השתמש בעדשות 10x ו-4x. הזן את המדידות הגרפיות, את היחידות ואת העדשות שבהן נעשה שימוש, ובצע את הכיול.שלב זה נדרש פעם אחת בלבד עבור ניתוח תמונות עוקב. פשוט טענו מחדש את הגדרות הכיול הנדרשות. לאחר מכן, פתחו את תמונות בדיקת הפלישה ובחרו את הגדרות הכיול בהתאם לעדשת המיקרוסקופ ששימשה לקבלת התמונות.מדדו את השטח המכוסה על ידי הסטרואידים באמצעות התוכנה המשמשת כאן. עברו ללשונית measure ובחרו ב-count size. בחרו ב-while, לאחר מכן טענו את ההגדרות (load settings) ובחרו בהגדרות בדיקה שנקבעו מראש (predetermined assay settings).לאחר מכן בחרו ב-count. הסטרואיד אמור להיות כעת מסומן (segmented) באופן מדויק. ייצאו את המדידות, שהן פרמטרים שונים, אל גיליון אלקטרוני ורשמו בגיליון את המידע הרלוונטי על התמונה.לבסוף, שרטט את השטח הממוצע של הסטרואידים החוזרים או של הפלישה אל מול הזמן באמצעות תוכנה סטטיסטית ותוכנה לגרפים מדעיים. מוצג כאן דוגמה לפלישת תאי סרטן שנצפתה בשורת תאי הגליובלסטומה U 87 MG, שניתן להשתמש בה כדי להדגים פלישה של גידול מוחי. לאחר השקעתם, תאי ה-BMM מתפשטים בתבנית פלישה טיפוסית דמוית התפרצות כוכבים, והתהליך נמעקב במשך תקופה של 72 שעות.ניתוח תמונה אוטומטי מלא. שימוש בציטומטר תמונה יוצר סגמנטציה מסביב לבליטות התאים ומאפשר כימות מדויק של פלישת תאי הגידול. שימו לב כי עבור קו תאים זה, גוף הסטרואידים מוחרג ממדידת שטח הפלישה.ניתן לבצע ניתוח תמונות אוטומטי מלא בקלות, המספק כימות של פלישת תאי גידול לאורך זמן. דפוס שונה של פלישת תאים מוצג על ידי קווי תאים איזוגניים של סרטן קשקשי של בני אדם מהראש והצוואר; קו התאים Cal S רגיש למעכבי טירוזין קינאז של EGFR, בעוד ש-CAL R עמיד להם.בהיעדר EGF, אף אחד מקווי התאים לא פלש אל ה-BMM; בנוכביות של EGF, נצפו בליטות דמויות אצבעות שהוצאו מגוף התא הראשי של Cal ars steroids. בעוד שתאי Cal s היו פחות פולשים לאחר 72 שעות, תמונות במקרה זה נרכשו במהירות באמצעות ציטומטר של תמונות (image cytometer) וכדי להדגים שיטה חלופית, מידת הפלישה כומתה ידנית באמצעות תוכנה עצמאית לניתוח תמונות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שכל קו תאים דורש אופטימיזציה של יכולתו להוות סטרואידים, צפיפות זריעת התאים, הרכב המטריקס והגדרות הדמיון והניתוח. בעקבות הליך זה, ניתן להתאים את אותה שיטה להערכת פלישה לרקמה בתלת-ממד תוך שימוש, למשל, בגידולים בתרבית משותפת (co-culture) עם גופי עוברים כדי לדמות רקמה מורכבת או אורגנואידים אחרים כמו אסטרוציטים עבור גליומה או תרביות קריפט עבור סרטני מערכת העיכול, או כבד עבור קרצינומה הפטוסלולרית וגרורות של סרטן המעי הגס.

three-dimensional-3d-tumor-spheroid-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

Assay כדי למדוד כמותית הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β-Induced הפלישה ב 3 מימדי ג'ל קולגן מתואר. Assay זו מנצלת את הסדרה MCF10A של שורות תאים, המייצגים שלבים שונים של התפתחות סרטן השד. שיטה זו יכולה להיות מאומץ לשימוש עם שורות תאים אחרים עשוי לשמש כדי לחקור activators פוטנציאליים אחרים או מעכבי הפלישה.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

סרטון זה מדגים שיטה לביסוס ספרואיד גידול תלת ממדי ותרבית משותפת של תאי T. אגרוז יצוק עם microwells המכילים spheroids הגידול מוכן, ואחריו תוספת של תאי T. לאחר הדגירה, מערך זה מאפשר לחקור את האינטראקציה של תאי T עם ספרואידים סרטניים בסביבה תלת ממדית מבוקרת.

מודל תלת מימדי של תרבית משותפת של חדירת תאי T לספרואידים סרטניים

מקור: Guyon, J., et al. מודל ספרואיד תלת מימדי לגליובלסטומה. J. Vis. Exp. (2020)הסרטון מדגים את היצירה של מודל ספרואיד תלת מימדי של פלישת תאי גידול. ספרואידים נוצרים מתאי גידול מוח אנושיים ומוטמעים במטריצת קולגן. תאי הגידול בפריפריה הספרואידית מאמצים פנוטיפ פולשני, מפרישים פרוטאזות כדי לפרק את הקולגן ומתקדמים לפלוש למטריצה שמסביב.

יצירת מודל ספרואיד תלת מימדי של פלישת תאי גידול

שיטה זו מעריכה פלישת תאי סרטן מספרואידים למטריצה תלת מימדית מסביב.  ספרואידים נוצרים בשיטת תרבית טיפה תלויה ולאחר מכן מוטמעים במטריצה המורכבת מחומרי ממברנת הבסיס וקולגן מסוג I.  פלישת הספרואידים מנוטרת לאחר מכן.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

התהליכים השולטים הפלישה סרטן שלפוחית השתן מייצגים הזדמנויות סמן ופיתוח טיפולית. כאן אנו מציגים מודל הפלישה סרטן שלפוחית השתן אשר משלבת תרבות תלת-ממדי של גידול spheroids, הדמיה בצילום מואץ, מיקרוסקופיה קונפוקלית. טכניקה זו שימושית עבור הגדרת התכונות של תהליך פולשני, הקרנת סוכני טיפולית.

תא תלת-ממדי מערכת תרבות עבור הלומדים הפלישה והערכת הרפוי בסרטן שלפוחית השתן

מיקרוסביבה הגידול הוא חלק חיוני של גידול בסרטן ופלישה. כדי לחקות התקדמות קרצינומה, צריך מטריצה אנושית רלוונטית ביולוגית. פרוטוקול זה מציג שיפור לגבי שיטת החדירה החיצונית התלת-ממדית של שלושה מימדים על-ידי החלת מטריצה אנושית המבוססת על מייומה. הפרוטוקול גם מציג ניתוח הפלישה לתא מבוסס-מחשב.

מטריקס מבוסס על גידול אדם במלואו באופן שלוש מימדי הפלישה ספרואיד שיטת

המטרה של פרוטוקול זה היא להקים מודל 3D בתחום החוץ כדי ללמוד את הבידול של סרטן הקשורות בגידולים סרטניים (CAFs) בסביבה בצובר כמו גידול, אשר ניתן לטפל במערכות ניתוח שונות, כגון immunofluorescence ההמרה ניתוח והדמיה של תאי החיים.

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

כאן, אנו מתארים שיטת פלישה קלה לשימוש עבור גלינובלסטומה. שיטת הפעולה הזאת מתאימה לתאים גלנובלסטומה כמו גזע. מאקרו של פיג'י לכימות קל של פלישה, הגירה והתפשטות מתואר גם כן.

מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה

הגישה המוצגת בו זמנית מעריך פלישה לתאים סרטניים באסה 3D spheroid ו cytotoxicity T-cell. ספרואידים נוצרים בהצללת אגרוז מרובת מיקרווול ללא פיגומים. תרבות וטביעה בסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך אותו מכשיר המאפשר לפקח על פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity בתיווך T-cell.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

מוצג כאן הוא פרוטוקול לייצור של מכשיר הדמיה ספרואידי. מכשיר זה מאפשר הדמיה פלואורסצנטית דינמית או אורך של ספירואידים תאים סרטניים. הפרוטוקול מציע גם הליך עיבוד תמונה פשוט לניתוח פלישת תאים סרטן.

הדמיית פלואורסצנטיות שנפתרה בזמן וניתוח של פלישת תאים סרטן במודל ספרואיד 3D

פלישה היא תופעה ביולוגית מרכזית בהתפתחות והתקדמות סרטן. תהליך זה מושפע מתאים שאינם ניאופלסטיים ומרכיבי המיקרו-סביבה של הגידול. מטרת מחקר זה היא לתאר שיטה חלופית לניתוח פלישת תאי גידול במבחנה באמצעות תרביות תלת ממדיות (3D).

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

למדו שיטת מיקרו-פלטה תלת-ממדית למחקר פלישת תאי סרטן באמצעות מטריקס דמוי ממברנת בסיס. שיטה זו מאפשרת ניטור התנהגות תאים בסביבה פיזיולוגית ריאליסטית יותר לסקרינג תרופות.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

גלה סרטונים נוספים