פשוטה מלכודות תאיות נויטרופילים אדם בידוד (רשתות) וטיפול

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים פרוטוקול פשוט לבידוד נויטרופילים, מלכודות חוץ-תאיות או רשתות מדם מלא אנושי באמצעות ריאגנטים זמינים. זה מושג על ידי בידוד ראשון של נויטרופילים מדם מלא אנושי, תוך שימוש בטכניקת צנטריפוגה דיפרנציאלית כשלב שני. נויטרופילים מבודדים מגורים עם PMA כדי לגרום להיווצרות רשת, הנקראת גם NETosis.

לאחר מכן, מכינים צלחת עם רשת מבודדת נטולת תאים ומוסיפים תאים סרטניים כדי להדגים כיצד הרשתות משפיעות על הידבקות התאים. התוצאות מראות כי תוספת של חד-שכבת נטו משפרת את ההידבקות של 5,49 תאים סרטניים וכי הידבקות זו מופחתת כאשר הרשתות מתפרקות. שימוש ב-DNA אחד הדגמה חזותית של שיטה זו הוא קריטי.

בהתחשב בחידוש של טכניקה זו, הטיפול במלכודות תאיות של נויטרופילים xor הוא קשה ביותר בשל מידת השבריריות של מבנים אלה. כדי להתחיל, השג 80 מיליליטר של דם מלא אנושי טרי ב-14 צינורות עליונים ירוקים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. פתח כל צינור והוסף חמישה מיליליטר PBS ללא סידן ומגנזיום לכל צינור.

לאחר מכן, הוסף 15 מיליליטר של אמצעי הפרדת לימפוציטים או LSM לכל אחד מארבעה צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השתמש במחט בגודל 18 המותקנת על מזרק של 60 מיליליטר כדי לשכב בזהירות את הדם המדולל על ה-LSM, וליצור צנטריפוגה חדה של ממשק דם LSM את הצינורות ב-800 פעמים G למשך 30 דקות ב-21 מעלות צלזיוס מבלי להישבר כדי לעצור את הצנטריפוגה, שאפו בזהירות והשליכו את שתי שכבות הנוזל העליונות ואת הממשק ביניהן ולהשאיר רק את השכבה האדומה התחתונה. גלולה זו מכילה אריתרוציטים ונויטרופילים.

הוסף 20 מיליליטר PBS ו -20 מיליליטר של תמיסת דקסטרן 6% לכל צינור. הפוך בעדינות כל צינור והניח לו לשבת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. תאי הדם האדומים ישקעו לתחתית הצינור.

לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנטים לצינורות טריים והשליכו את המשטחים. צנטריפוגה של הסופרנטנטים ב-450 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ואז השליכו את הסופרנטנט והשאירו את הכדור העשיר בנויטרופילים. הכן תמיסת ליזינג עם 0.5 מיליליטר מאגר ליזה ב -4.5 מיליליטר מים סטריליים.

הוסף בסך הכל חמישה מיליליטר מתמיסת הליזינג לכל צינור ואגד את כל הכדורים לבקבוק אחד. הניחו את הבקבוק בחושך למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לכינים את כל כדוריות הדם האדומות שנותרו. צנטריפוגה את הנויטרופילים ב-450 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה עם חמישה מיליליטר PBS ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה שוב ב-450 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס והסר את הסופרנטנט המכיל את תמיסת הליזיס שנותרה. השעו מחדש את גלולת הנויטרופילים ב-30 מיליליטר של מדיום RPMI קר בתוספת סרום בקר עוברי 3%, והניחו את הצינור על קרח כדי לעורר היווצרות מלכודות או רשתות חוץ-תאיות של נויטרופילים.

הוסף 500 ננו טוחנת של PMA ל-30 ליטר של תרחיף הנויטרופילים בצלחת תרבית רקמות שטוחה בגודל 150 מילימטר על 25 מילימטר. עם רשת של 20 מילימטר, דגרו על התאים במשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה יש לשאוב בעדינות ולהשליך את המדיום, תוך הקפדה לא לשבש את שכבת הרשתות והנויטרופילים הנדבקים לתחתית המנה.

לאחר מכן השתמש בפיפטה כדי לשטוף את תחתית כל מנה עם 15 מיליליטר PBS קר ללא סידן ומגנזיום, יש להסיר את כל החומר הדבק מלמטה. אוספים את מתלה הכביסה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר ואז צנטריפוגה ב -450 פעמים G למשך 10 דקות. בארבע מעלות צלזיוס נויטרופילים וכל התאים הנותרים יתגלו בתחתית.

השארת סופרנטנט עשיר נטו נטול תאים לאחר מכן שפוך את הסופרנטנט למספר צינורות של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה בשמונה 18,000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לגלול את הדנ"א, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-PBS כך שהריכוז מתאים לפעמיים 10 לנויטרופילים השביעיים לכל 100 מיקרוליטר של PBS. ניתן להשתמש במלאי נטול תאים זה לניסויים הבאים.

מדוד את ריכוז ה-DNA של הדגימה באמצעות פוטומטריית ספקטרו. ריכוז הולם צריך לנוע בין 140 ל-180 ננוגרם למיקרוליטר ב-100 מיקרוליטר מהמלאי נטו לכל באר של צלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות ולדגור את הצלחת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס בחושך כדי לצפות את הבארות 12 עד 20 שעות לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ כדי לוודא היווצרות חד-שכבה אחידה של רשתות נטולות תאים בתחתית הבארות. לאחר אימות החד-שכבה, שאפו בעדינות את כל החומר שאינו נדבק מהבארות.

הקפידו לא לשבש את השכבה החד-שכבתית בתחתית. זהו ההיבט המאתגר ביותר בהליך זה. על מנת לשמור על חד-שכבת נטו נאותה, עליכם לטפל בצלחת בזהירות רבה.

מוסיפים את כל הריאגנטים והתאים לאט בצד הבארות, שואפים בעדינות רבה והימנעים מלגעת בקרקעית הבאר עם קצה יניקה. לאחר הסרת החומר שאינו נדבק, הוסיפו בעדינות 100 מיקרוליטר של תמיסת חסימת אלבומין בסרום בקר 1% לכל באר והשאירו למשך שעה בטמפרטורת החדר. אין לעורר או לנער את הצלחת מכיוון שהדבר עלול לשבש את שכבת המונו נטו.

לאחר מכן, הכינו 5 49 תאים סרטניים על ידי קצירת אותם כשהם מתכנסים 70 עד 80%. באמצעות טכניקות סטנדרטיות, השעו מחדש את התאים בתווך בריכוז של שניים כפול 10 עד התאים הרביעיים לכל 100 מיקרוליטר. צבעו את התאים על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של CFS e למיליליטר מדיום, והשאירו אותם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 450 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בנפח הראשוני של המדיום כדי לשמור על ריכוז של פי שניים פי 10 לתאי הסרטן הרביעיים לכל 100 מיקרוליטר של מדיום. קח את הצלחת המצופה נטו ושאף בעדינות את תמיסת החסימה.

לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של תרחיף התאים הסרטניים לכל באר ואפשרו לתאים להיצמד לצלחת למשך 90 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני שואבים את הנוזל במלואו ומוסיפים 1000 יחידות DNA, אחת לכמה בארות למשך 10 דקות כדי לפרק את הרשתות בבארות אחרות. הוסף 100 מיקרוליטר מים סטריליים לבאר למשך 10 דקות כבקרת רכב. לאחר מכן, שאפו בעדינות את הנוזל מכל באר ושטפו עם 100 מיקרוליטר PBS כדי להסיר כל שאינו דבק.

5 49 תאים שואפים ומשליכים את כל התמיסה בבארות, ומשאירים רק את הרשתות ותאי הסרטן הדבקים בתחתית. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת פורמלדהיד של 4% לכל באר כדי לתקן את התאים, להעביר מיד את הצלחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקרוא את הבדיקה ולאחר מכן לשרטט ולנתח את התוצאות. שימוש בתוכנת ניתוח הנתונים.

רשתות נטולות תאים שימשו במבחני הידבקות סטטיים עם 5,49 תאים סרטניים. מיקרוסקופ אור הראה שתאי סרטן נצמדים חזק לשכבה החד-שכבתית נטו. במבחנה.

הידבקות זו פחתה לאחר שהחד-שכבה נטו התפרקה על ידי DNA, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אחת של 5 49 תאים סרטניים אישרה את התוצאות הללו. קשירה של 5 49 תאים לשכבת המונו נטו כומתה על ידי ספירת מספר התאים לכל שדה הספק גבוה. כפי שמוצג כאן, לא היה שינוי בהידבקות התאים הסרטניים לרשתות בבקרת הרכב.

עם זאת, חלה ירידה משמעותית בהיצמדות תאי סרטן לרשתות בנוכחות DNA 1. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לבודד ולטפל ברשתות מדם אנושי מלא. לאחר מכן ניתן להשתמש ברשתות נטולות תאים אלה במגוון טכניקות, כולל אימונופלואורסצנטיות, מיקרוסקופיה קונפוקלית, מיקרוסקופ אלקטרונים וכתמים מערביים.