Name: פשוטה מלכודות תאיות נויטרופילים אדם בידוד (רשתות) וטיפול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: למדו שיטה פשוטה לבידוד מלכודות תאיות נויטרופילים (NETs) מדם אנושי שלם. הפרוטוקול משתמש בצנטריפוגה דיפרנציאלית ו-PMA ליצירת NETs, ומדגים את השפעתן על הידבקות תאי סרטן A549 במבחנת הידבקות אינ-ויטרו.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד"ר פול קובס על ההדרכה וההדרכה שלו שהיו מרכזיים בבניית עבודה זו.

הערה: כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות אתיות מוסדיות מקומיות. ציור 1. דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דרך venipucture antecubital, לאסוף 14 צינורות דם ממתנדב בריאה לראש ירוק צינורות (heparinized) ולהפוך כל צינור לפני שהתיישב על קרח. איסוף דם בתוך 10 - 15 דקות של ניסוי כדי להבטיח תשואת נויטרופילים אופטימלית. </li></ol> 2. בידוד נויטרופילים מדם מלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל צינור עליון ירוק של דם עם 5 מיליליטר של PBS ללא Ca וMg כדי לדלל את הדם. בכל אחד מצינורות חרוטי 4 x 50 מיליליטר, להוסיף 15 מיליליטר של מדיה הפרדת ימפוציטים (LSM) בשעה RT. באמצעות מחט 18 G רכובה על מזרק 60 מיליליטר, שכבת הדם המדולל על LSM בזהירות, יצירת ממשק LSM-דם חד. הערה: יש להימנע מערבוב של השכבות ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 800 XG למשך 30 דקות ב 21 ° C, ללא הפסקה. הפסקות פתאומיות יכול: הערהלגרום לערבוב של השכבות השונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב למשקעי אריתרוציטים ונויטרופילים בתחתית. לשאוב ולזרוק 2 שכבות העליונה (פלזמה וLSM) והקפד להיפטר מהממשק בין שכבות אלה המכילות לימפוציטים ותאי mononuclear, עוזב את השכבה האדומה התחתונה בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על צינור אחד, להוסיף 20 מיליליטר של פוספט הצפת מלוח (PBS) ופתרון Dextran 20 מיליליטר של 6%. בעדינות להפוך כל צינור לערבב עם השכבה של אריתרוציטים ונויטרופילים ולאפשר לשבת בRT למשך 30 דקות. הערה: זה יאפשר תאי דם אדומים (RBCs) משקע בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, להעביר את supernatant העשיר נויטרופילים לתוך צינורות טריים וזורקים את כדורי RBC. supernatants צנטריפוגות ב 450 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, להשליך supernatant. גלולה תכיל בעיקר נויטרופילים וכמה RBCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון lysing ידי הוספת 0.5 מיליליטר של חיץ lysing 4.5 מיליליטר של מים סטריליים. Lyse נותר RBC עם tהוא הכין 5 מיליליטר של lysing פתרון, להעביר את כל כדורים המושעים לצינור אחד. לאפשר תמוגה ב RT בחושך במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 450 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בטל supernatant ולשטוף גלולה עם 5 מיליליטר PBS ללא Ca וMg ו צנטריפוגות שוב ב 450 XG ב 4 ° C כדי להיפטר מכל פתרון lysing שנותר. גלולה המתקבלת בשלב זה מכילה נויטרופילים. Resuspend גלולה ב 30 מיליליטר של 3% הקרים RPMI ולשים על קרח. הערה: 3% RPMI נעשית על ידי השלמת תקשורת RPMI עם 3% שור עוברי סרום (FBS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא טוהר המדגם באמצעות מכתים מתילן כחול. &gt; 95% של תאים צריכים להיות גרנולוציטים עם גרעינים רב-אוֹנִי. השתמש בכתמי כחולי Trypan לאמת&gt; כדאיות 95% מתאים ולספור את תשואת נויטרופילים הסופית. לדלל נויטרופילים בקרח קר 3% RPMI להשיג ריכוז סופי של 5 x 10 6 מיליליטר / נויטרופילים. </li></ol> 3. רשתות דור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר נויטרופילים עם 500 nM של PMA (לכל 30 מיליליטר של תמיסת נויטרופילים) ודגירה על צלחת 150 x 25mm רקמה שטוחה תרבות עם רשת 20 מ&quot;מ ל4 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. זה יאפשר NETosis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות של גירוי, לשאוב בעדינות וזורקים את התקשורת, עוזב את השכבה של רשתות ונויטרופילים דבקו בתחתית. לא לשבש שכבה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסכום כולל של 15 מיליליטר של PBS הקר בלי Ca וMg לכל צלחת, לשטוף את התחתית של כל מנה על ידי pipetting 15 מיליליטר של PBS על החלק התחתון של המנה, כדי להרים את כל החומר חסיד מהתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף פתרון המתקבל משטיפה כל מנה (שלב 3.3) בצינור חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 450 XG ב 4 ° C. נויטרופילים וכל תאים הנותרים גלולה בתחתית, עוזבים supernatant NET-עשיר מחוץ לתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant Divide לתוך צינורות 1.5 מיליליטר מיקרו צנטריפוגות וספין במשך 10 דקות ב 18,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. זה יאפשר לכל DNA לגלולה. הערה: צנטריפוגה בtu הגדולBES הוא זמן קל יותר ופחות רב אם מהירויות גבוהות כאלה הן ברי-השגה בצנטריפוגה הרגילה, אחרת יצטרך לחלק supernatants בצינורות קטנים יותר על מנת להשתמש במהירות גבוהה מיקרו צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend כל כדורים שהושגו יחד בקרח הקר PBS לריכוז המתאים 2 x 10 7 נויטרופילים לשל PBS 100 μl. זו תניב מניית NET-התא ללא שיכול לשמש לניסויים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ריכוז ה- DNA במדגם שהושג באמצעות spectrophotometry או כלי כימות DNA חלופי. ריכוז נאות במדגם צריך לנוע בין 140-180 ng / μl. </li></ol> 4. תא NET-סרטן סטטי הידבקות Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של מניית NET שהושג בעבר לכל גם 100 μl בצלחת תחתונה גם שטוחה 96 ולאפשר לבארות מעיל O / N ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין 12 ל 20 שעות מאוחר יותר, לוודא היווצרות monolayer אחיד של תארשתות חופשיות בחלק התחתון של הבארות מתחת למיקרוסקופ (איור 1). בשלב זה, לשאוב בעדינות את כל החומר שאינו חסיד מתוך הבארות, כדי לוודא שלא לשבש את monolayer NET בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של 1% בסרום שור אלבומין פתרון (BSA) חוסם 100 μl היטב כל אחד ולצאת לh 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאי סרטן A549 מבקבוק T-75 של שימוש 2 מיליליטר של 0.25% פתרון טריפסין. ברגע שמנותק, להוסיף 10 מיליליטר של תקשורת A549 לתאים ו צנטריפוגות trypsinized ב 450 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בטל תאי supernatant וגלולים בתקשורת כדי להשיג ריכוז של 2 x10 4 תאי סרטן לכל 100 מדיה μl. הערה: תאי A549 גדלו בנפרד. בקצרה, תאים בתרבית ומתוחזק בתקשורת F12 DMEM המכיל 10% FBS ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין וטופחו על C 5% CO 2 37 מעלות. ברגע 70 - הושג 80% מפגש תא, הם היו מנותקים באמצעות 0.25% טריפסין- EDTA וresuspended באותה התקשורתשתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי סרטן הכתם באמצעות CFSE על ידי הוספת 1 μl של CFSE לכל מיליליטר של תקשורת ולהשאיר כתם על RT במשך 10 דקות. לאחר הצביעה, צנטריפוגות מטה ב 450 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואז להשליך תאי supernatant וגלולים בנפח ראשוני של תקשורת כדי להשיג ריכוז של 2 x10 4 תאי סרטן לכל 100 מדיה μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1 של רשתות חסימה, בעדינות לשאוב פתרון חסימה ולהוסיף 2 x10 4 תאים סרטניים בתקשורת, שהוא שווה ערך ל -100 μl, לכל גם על monolayer NET ולאפשר לדבוק במשך 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לשאוב בעדינות את התאים ולהוסיף של PBS 100 μl היטב כל אחד לשטוף את כל תאים שאינם חסיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלק מהבארות, להוסיף 1000U של DNAse1 לכל גם במשך 10 דקות לפני הכביסה כדי לבזות רשתות. זה ישמש שליטה שלילית. בבארות אחרות, להוסיף מים סטריליים לכל גם 100 μl במשך 10 דקות, שישמשו כשליטה ברכב (VC). הערה: 3 משכפל לcondition מבוצע בדרך כלל כדי להגדיל את גודל מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק את כל הפתרון בבארות ומשאירות רק את רשתות ותאים סרטניים חסיד בתחתית. הוספה של 4% תמיסת פורמלדהיד לכל גם 100 μl לתקן תאי סרטן חסיד לרשתות ולקרוא assay תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1). עלילה ולנתח את התוצאות (איור 3). </li></ol>

<ol><li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+mediate+a+host+defense+response+to+human+immunodeficiency+virus-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).</li>
<li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+extracellular+traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+infected+lung+tissue+is+dependent+on+invading+neutrophils+and+influenced+by+hydrophobin+RodA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6 (4), e1000873(2010).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETs%3A+a+new+strategy+for+using+old+weapons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">NETs: a new strategy for using old weapons.</a> Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).</li>
<li>McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+neutrophil+extracellular+traps+capture+bacteria+from+the+bloodstream+during+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).</li>
<li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Khandpur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETs+are+a+source+of+citrullinated+autoantigens+and+stimulate+inflammatory+responses+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis.</a> Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140(2013).</li>
<li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li>
<li>Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+NETs+in+reproduction%3A+from+infertility+to+preeclampsia+and+the+possibility+of+fetal+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss.</a> Front Immunol. 3, 362(2012).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> J Clin Invest. , (2013).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in cancer progression.</a> Cell Mol Life Sci. , (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li>
<li>Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+laboratory+procedures+for+isolating+human+peripheral+blood+derived+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Med+J+Malaysia%22%5BJournal%5D)">Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils.</a> Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lymphocytes%2C+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages.</a> Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).</li>
<li>Calado, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+hormones%2C+acting+on+the+TERT+gene%2C+increase+telomerase+activity+in+human+primary+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells.</a> Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).</li>
<li>Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+bv8+in+human+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of bv8 in human blood cells.</a> Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).</li>
<li>Wu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+leukocyte+labeling+with+intravenous+ferumoxides%2Fprotamine+sulfate+complex+and+in+vitro+characterization+for+cellular+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).</li>
<li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+directly+induce+epithelial+and+endothelial+cell+death%3A+a+predominant+role+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones.</a> PLoS One. 7 (2), e32366(2012).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף

פרוטוקול בידוד מלכודת נויטרופילים התאי הפגין בסרטון זה משלב טכניקות שונות המשמשות בספרות לבידוד נויטרופילים והיווצרות NET. זה מפשט את תהליך מורכב למדי ומשתנה ומציע דרך אמינה מאוד ושכפול לבודד את רשתות תא ללא מטוהרים עם פחות שלבים מאשר פרוטוקולים אחרים. יתר על כן, חומרים כימיים זמינים מועסקים הוספה לפשטות הפרוטוקולים והפחתת עלותו באופן משמעותי. היישום של רשתות כלפי assay הידבקות סטטית משמש כדי להדגים את הגמישות המוענקת על ידי טכניקת הבידוד הזה, כמו ריכוז NET יכול בקלות לטפל כדי שית...

מלכודות תאי נויטרופילים (רשתות) הם שהתגלו לאחרונה אלמנטים הנגזרים נויטרופילים מורכבים מגדילי הדנ&quot;א תאי מעוצבים על ידי מאות חלבונים וההיסטונים. הם מופרשים על ידי נויטרופילים בהקשר של זיהום ודלקת בעקבות גירויים מסוימים והם הוכרו בתחילה להיות חלק ממנגנוני ההגנה של נויטרופילים מפני זיהומים. הם הוצגו לראשונה לקידום לכידה של פולשים חיידקים שונים, כוללים חיידקים, וירוסים ופטריות 1-3. לכידתו של החיידק היה אז להוביל להרס שלו הן באופן ישיר על ידי החלבונים הקשורים NET 3,4 ובעקיפין באמצעות גיוס המקומי של תאי phagocytic 5,6. התפקיד של רשתות עם זאת נראה שלא יהיה מוגבל לארח הגנה. לאחרונה, הם הוכחו לשחק תפקיד חשוב במחלות אוטואימוניות 7,8, פקקת 9, הפרעות הקשורות להריון 10 ואפילו התקדמות הסרטן11,12. בהתאם לכך, נראה כי רשתות לשחק תפקיד חשוב במספר רב של תהליכים פיסיולוגיים שונים. עם זאת, בהתחשב באופי החדשני של מחקר כזה, הרבה עדיין לא הובהר לגבי המנגנונים שבאמצעותם רשתות להפעיל את השפעתם. במסמך זה, אנו מציגים שיטה פשוטה לבידוד של רשתות בהעדר של נויטרופילים. בסרטון הבא, אנחנו מדגימים טכניקה פשוטה וקלה לבודד את רשתות מכל דם אנושי. רשתות תא ללא לאחר מכן ניתן להשתמש במספר הניסויים במבחנה הכולל צביעה, imuunofluorescence, סופגות, כמו גם מספר מבחני כגון הידבקות, הפצה והגירה. פרוטוקולים אחרים קיימים 13, 19, אולם הם בדרך כלל ארוכים, מורכבים, יקרים, ולעתים קרובות, תשואה נמוכה 13. פרוטוקול זה משתמש בחומרים כימיים פשוט בסיסיים ומפחית את מספר הצעדים הנדרשים כדי לבודד נויטרופילים, ולכן צמצום האורך של proceduמחדש תוך מיקסום תשואה. השיטה הבאה משלבת טכניקות שונות לבידוד נויטרופילים שתוארו קודם לכן בספרות להשיג פרוטוקול פשוט מניב מדגם טהור מאוד של נויטרופילים חיים. כפי שהוצע בספרות, דם ורידים נאסף בצינורות EDTA בשימוש בתוך 10 דקות, כדי למנוע הפעלת נויטרופילים 14. אנו משתמשים בצנטריפוגה מדיה הפרדת השיפוע (LSM) צפיפות ימפוציטים לבודד גרנולוציטים ותאי דם אדומים מהדם כל heparinized, שיטה המותאמת מטכניקת צנטריפוגה צפיפות Ficoll תחילה שתוארה על ידי Boyum et al 15. LSM הוא שינוי של ניסוח Boyum שמחליף diatrizoate נתרן לmetrizoate נתרן ושמש בהצלחה במחקרים רבים לבודד נויטרופילים 16-18. בעקבות צנטריפוגה צפיפות ההפרש, מונוציטים ולימפוציטים מבוטלים; לאחר מכן תאי דם אדומים משקעיםבאמצעות 6% פתרון Dextran 14 וRBCs הנותרים lysed להשיג אוכלוסייה של נויטרופילים הטהורים, אשר מאומת עם Trypan כחול וכתמי כחולים מתילן. סוכנים רבים שנעשו שימוש כדי לגרום NETosis הן במבחנה in vivo, כוללים lipopolysaccharide (LPS), ותצטט myristate phorbol (PMA) וinterleukins (IL-8) 3,5,6. בפרוטוקול הבא, נויטרופילים המבודדים מומרצים עם 500 ננומטר PMA במשך 4 שעות, אשר הוכח להיות ריכוז נאות כדי לאפשר היווצרות NET עקבית ואמינה ללא קידום אפופטוזיס 19,20. לאחר בידוד, אנו מדגימים כיצד רשתות תא ללא שהתקבלו מפרוטוקול זה יכול לשמש בassay הידבקות. DNAse1 משמש לעיכול ולבזות רשתות כפי שתואר לעיל ובכך משמש כשליטה 2,3,11. אפשרויות אחרות כוללות את השימוש במעכבי elastase נויטרופילים (ניי) לעכב formati NETב, אשר מהווה חלופה מקובלת כאשר המטרה היא לעכב את היווצרות NET ולא תשפיע שפלתם 11. למרות שניי יש מספר הפונקציות מגוונות, זה כבר הראה בעבר כי בתצהיר NET יכול להיות מעוכב על ידי ניי באמצעות חסימה של decondensation הכרומטין, degranulation הגרעיני ומות נויטרופילים 12

<table><tbody><tr><td>דולבקו s תמיסת מלח פוספט בופר (PBS), מעובד, ללא סידן כלורי ומגנזיום כלוריד</td><td>Wisent</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הפרדת לימפוציטים (LSM)</td><td>Wisent</td><td>305-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרן הידרוכלוריד (אבקה)</td><td>ספקטרום</td><td>DE130</td><td>תמיסת דקסטרן 6% מיוצרת על ידי תוספת PBS עם Ca ו-Mg עם אבקת דקסטרן 6%</td></tr><tr><td>RPMI-1640 בינוני עם L-גלוטמין</td><td>Wisent</td><td>תמיסת 350-000-CL</td><td>3% RPMI מיוצרת על ידי תוספת RPMI עם 3% סרום בקר עוברי</td></tr><tr><td>BD פארם ליז מאגר ליסינג</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA)</td> <td>סיגמא-אלרדיך</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>DNAse1</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>F12 DMEM</td><td>Wisent</td><td>319-075-CL</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמה אינטגריד עם רשת 20 מ"מ (150 x 25 מ"מ)</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr></tbody></table>

פשוטה מלכודות תאיות נויטרופילים אדם בידוד (רשתות) וטיפול

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

מלכודות נויטרופילים התאיות (רשתות) זוהו לאחרונה כחלק מארסנל מיקרוביאלית של נויטרופילים. מלבד תפקידם במלחמה בזיהומים, מחקר שנעשה לאחרונה הראה כי הם עשויים להיות מעורבים בתהליכים רבים מחלה אחרות, ובכלל זה התקדמות הסרטן. בידוד רשתות מטוהרים הוא אלמנט חיוני כדי לאפשר המחקר של פונקציות אלה. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה של ​​בידוד NET תא מתוך כל דם אנושי באמצעות ריאגנטים זמינים. רשתות מבודדות לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מכתים immunofluorescence, סופג או מבחני תפקודיים שונים. זה מאפשר הערכה של הנכסים הביולוגיים שלהם בהעדר תופעות של בלבול הפוטנציאליות של נויטרופילים עצמם. טכניקת הפרדת שיפוע צפיפות מועסקת לבודד נויטרופילים מכל דם תורם בריא. אז נויטרופילים מבודדים מומרצים ע&quot;י phorbol 12 myr13-אצטט istate (PMA) כדי לגרום לNETosis. אז נויטרופילים הופעל מבוטלים, ומניית NET-תא ללא מתקבלת. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד מבודדים רשתות ניתן להשתמש בassay הידבקות עם תאי סרטן הריאות אנושיים A549. מניית NET משמשת למעייל הבארות של 96 O צלחת תרבית תאים היטב / תאי A549 N, ולאחר הבטחת היווצרות monolayer NET נאותה בחלק התחתון של הבארות, שכותרתו CFSE מתווספות. תאים חסיד הם לכמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי Nikon TE300. בחלק מהבארות, 1000U DNAse1 מתווסף 10 דקות לפני הספירה להשפיל רשתות

הישג מוצלח של assay הידבקות סטטית עם רשתות דורש ציפוי נאות של הבארות עם monolayer של רשתות לפני התוספת של תאים סרטניים (איור 1). כל הצעדים הבאים חייבים להיעשות בזהירות שלא לפגוע בשכבה ש. כאשר שכבה נאותה של רשתות נוצר, הוא צפוי לראות הידבקות תאים סרטניים משמעותית לרשתות כפי שניתן לראות באיור 2 א ו2C. השפעה זו בוטלה על ידי התוספת של DNAse1, אשר מדרדרת רשתות כפי שניתן לראות ב2B דמויות ו2D. לעומת זאת, לא צריך להיות שום ירידה משמעותית ...

בפרוטוקול הבא, אנו מתארים דרך פשוטה מאוד לבודד את מלכודות נויטרופילים תאיות (רשתות) מכל דם אנושי באמצעות ריאגנטים זמינים. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש ברשתות המבודדות בassay הידבקות במבחנה עם תאים סרטניים.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדגים פרוטוקול פשוט לבידוד מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (neutrophil extracellular traps), או NETs, מדם אנושי מלא באמצעות ריאגנטים זמינים. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד נויטרופילים מדם אנושי מלא, תוך שימוש בטכניקת צנטריפוגה דיפרנציאלית כשלב שני. הנויטרופילים המבודדים מעוררים באמצעות PMA כדי להשרות יצירת NETs, תהליך הנקרא גם NETosis.בשלב הבא, מכינים פלטה עם בידוד של רשתות ללא תאים ומוסיפים תאי סרטן כדי להדגים כיצד הרשתות משפיעות על היצמדות התאים. התוצאות מראות כי הוספה של שכבת רשת אחת (monolayer) משפרת את ההיצמדות של תאי סרטן 5 49 וכי היצמדות זו פוחתת כאשר הרשתות עוברות פירוק. שימוש ב-DNAS; הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית.בהינתן החדשנות של טכניקה זו, הטיפול במלכודות תאי Neutrophil (NETs) הוא קשה ביותר בשל השבריריות הרבה של מבנים אלו. לתחילת הפעולה, השג 80 milliliters של דם אנושי רענן ב-14 מבחנות עם פקק ירוק המכילות Heparin, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. פתח כל מבחנה והוסף לכל אחת 5 milliliters של PBS ללא סידן ומגנזיום.בשלב הבא, הוסיפו 15 milliliters של מדיום להפרדת לימפוציטים או LSM לכל אחד מארבעה מבחנות קוניות של 50 milliliter בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמשו במחט במידה 18 המורכבת על מזרק של 60 milliliter כדי להניח בעדינות את הדם המדלל מעל ה-LSM, כך שייווצר ממשק חד בין ה-LSM לדם. סובבו את המבחנות בצנטריפוגה במהירות של 800 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 21 °C ללא בלימה. לאחר עצירת הצנטריפוגה, שאבו בזהירות והשליכו את שתי השכבות הנוזליות העליונות ואת הממשק שביניהן, כך שתישאר רק השכבה האדומה התחתונה. משקע זה מכיל erythrocytes ו-neutrophils.הוסיפו 20 milliliters של PBS ו-20 milliliters של תמיסת dextran בריכוז 6% לכל מבחנה. הפכו כל מבחנה בעדינות והמתינו 30 דקות בטמפרטורת החדר. תאי הדם האדומים ישקעו לתחתית המבחנה.בשלב הבא, העבירו את העל-נוזלים (supernatants) למבחנות נקיות והשליכו את המשקעים. סובבו את העל-נוזלים בצנטריפוגה במהירות של 450 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות, ולאחר מכן השליכו את העל-נוזל, כך שיישאר המשקע העשיר בנויטרופילים. הכינו תמיסת ליזיס המכילה 0.5 milliliters של בופר ליזיס ב-4.5 milliliters של מים סטריליים.הוסיפו סך הכל 5 mL של תמיסת הליזה לכל מבחנה ורכזו את כל המשקעים לבקבוק אחד. הניחו את הבקבוק בחושך למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לליית תאי דם אדומים שנותרו. סבבו את הנויטרופילים בcentrifuge במהירות של 450 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות.שפכו את הנוזל העליון ושטפו את המשקע באמצעות חמישה מיליליטר של PBS ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, סבבו שוב את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 450 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס והסירו את הנוזל העליון המכיל את שאריות תמיסת הליזיס. השעיקו מחדש את משקע הנויטרופילים ב-30 מיליליטר של מצע RPMI קר בתוספת 3% fetal bovine serum, והניחו את המבחנה על קרח כדי לעודד את היווצרותם של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs).הוסיפו 500 nM של PMA ל-30 µL של תרחיף הנויטרופילים בצלחת תרבית רקמות שטוחה של 150 mm על 25 mm. באמצעות רשת של 20 mm, דגרו את התאים למשך ארבע שעות ב-37 °C תחת 5% CO2. לאחר הדגירה, שאבו בעדינות והשליכו את המצע, תוך הקפדה לא להפר את שכבת הרשתות והנויטרופילים הדבוקים לתחתית הצלחת.לאחר מכן, השתמשו בפיפט כדי לשטוף את תחתית כל צלחת עם 15 milliliters של PBS קר ללא סידן ומגנזיום; יש להסיר את כל החומר הדבק מהתחתית. אספו את תגלי השטיפה למבחנה קונית של 15 milliliter ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה ב-450 times G למשך 10 דקות. בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס, הנוטרופילים וכל שאר התאים ישקעו בתחתית.לאחר השארת העליון העשיר ב-net נקי מתאים, העבר את העליון למספר מבחנות של 1.5 milliliter וסבב בצנטריפוגה ב-18,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. כדי להשקיע את ה-DNA, השלך את העליון והמס את המשקע ב-PBS כך שהריכוז יתאים ל-2 × 10⁷ נויטרופילים ל-100 µL של PBS. מלאי ה-net נקי מתאים זה יכול לשמש לניסויים עוקבים.מדוד את ריכוז ה-DNA של הדגימה באמצעות ספקטרופוטומטריה. ריכוז הולם צריך להיות בטווח שבין 140 ל-180 nanograms per microliter בנפח של 100 microliters של מלאי רשתות (net stock) לכל באער בלוח 96 באערים בעל תחתית שטוחה, והדגר את הלוח למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C בחושך כדי לצפות את הבאערים. לאחר 12 עד 20 שעות, השתמש במיקרוסקופ כדי לאמת את היווצרותו של שכבה אחת אחידה (monolayer) של רשתות נטולות תאים בתחתית הבאערים. ברגע שאישור השכבה הועמד, שאב בעדינות את כל החומר שאינו דבק מתוך הבאערים.יש לוודא שלא פוגעים בשכבה החד-שכבתיית (monolayer) שבתחתית. זהו ההיבט המאתגר ביותר של הליך זה. כדי לשמור על שכבה חד-שכבתיית תקינה, יש לטפל בצלחית בזהירות רבה.הוסיפו את כל הריאגנטים והתאים לאט לדפנות הבארות, שאבו בעדינות רבה, והימנעו מנגיעה בתחתית הבאר עם קצה השואב. לאחר הסרת החומר הבלתי-נצמד, הוסיפו בעדינות 100 µL של תמיסת חסימה של 1% bovine serum albumin לכל באר והשאירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. אין לנער או לרעוע את הפלטה, שכן הדבר עלול לפגוע בשכבה המוניו-מולקולרית.בשלב הבא, הכין תאי סרטן 5 49 על ידי קצירתם כאשר הם מגיעים ל-70 עד 80% התלכדות (confluence). באמצעות טכניקות סטנדרטיות, השהה מחדש את התאים במדיום בריכוז של 2×10⁴ תאים ל-100 µL. צבע את התאים על ידי הוספת 1 µL של CFS e לכל מיליליטר של מדיום, והשאר אותם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.בשלב הבא, סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-450 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות. השליכו את הנוזל העליון (supernatant) והשביו את התאים בנפח המקורי של המדיום כדי לשמור על ריכוז של 2 × 10⁴ תאי סרטן ל-100 µL של מדיום. קחו את הצלחת המצופה ב-net ושאבו בעדינות את תמיסת החסימה (blocking solution).לאחר מכן, הוסיפו 100 µL מתלי התאי הסרטניים לכל באער ואפשרו לתאים להיצמד לפלטה במשך 90 דקות ב-37 °C ו-5% carbon dioxide. שאבו את הנוזל לחלוטין והוסיפו 1000 units של DNase I לכמה מהבאערים למשך 10 דקות כדי לפרק את ה-NETs. בבאערים אחרים, הוסיפו 100 µL של מים סטריליים לבאער למשך 10 דקות כביקורת נשאי (vehicle control). לאחר מכן, שאבו בעדינות את הנוזל מכל באער ושטפו עם 100 µL של PBS כדי להסיר תאים שאינם דבקים.שאבו את התמיסה מ-5 49 תאים והשליכו את כל התמיסה מהבארות, כך שיישארו רק הרשתות ותאי הסרטן הדבקים בתחתית. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת formaldehyde בריכוז 4% לכל באר כדי לקבע את התאים; העבירו מיד את הפלטה למיקרוסקופ פלואורסצנציה לקריאת הבדיקה, ולאחר מכן שרטטו ונתחו את התוצאות באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים.רשתות נטולות תאים שימשו במבחני היצמדות סטטיים עם תאי סרטן מסוג 5 49. מיקרוסקופיה של אור הראתה כי תאי הסרטן נצמדים בעוצמה לשכבה הבודדת של הרשת. In vitro.ההיצמדות הזו פחתה לאחר שהשכבה המוניקולרית של הרשת התפרקה על ידי DNAse I; מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאי סרטן a 5 49 מסומנים איששה תוצאות אלו. קישורם של תאי a 5 49 לשכבה המוניקולרית של הרשת נמדד על ידי ספירת מספר התאים בשדה ראייה בהגדלה גבוהה. כפי שמוצג כאן, לא חל שינוי בהיצמדות תאי הסרטן לרשתות בביקורת הנשאי (vehicle control).עם זאת, נרשמה ירידה משמעותית בהיצמדות תאי סרטן לרשתות בנוכחות DNAse I. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הבידוד והטיפול ברשתות מדם אנושי מלא. ניתן להשתמש בבידודים אלו של רשתות נטולות תאים במגוון טכניקות, כולל אימונופלואורסצנציה, מיקרוסקופיה קונפוקלית, מיקרוסקופיה אלקטרונית ו-western blotting.

simplified-human-neutrophil-extracellular-traps-nets-isolation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מלכודות תאי נויטרופילים (NETS) הן מנגנון חשוב החיסון המולדת להילחם חיידקים פתוגניים, פטריות וטפילים. כאן אנו מתארים שיטות לבודד גרנולוציטים נויטרופילים מהדם האנושי כדי להפעיל אותם בצורה הרשתות. אנו מציגים טכניקות הכנה לדמיין הרשתות מיקרוסקופ אור אלקטרונים.

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה ליצירת ובידוד מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs). נויטרופילים מבודדים מדם היקפי ומעוררים באמצעות phorbol myristate acetate (PMA) כדי לייצר NETs. במהלך הדגירה, הנויטרופילים עוברים תהליך של מוות תאי (NETosis) כדי לשחרר NETs המורכבים מכרומטין מעובה מעורבב עם חלבונים ציטופלזמיים גרגיריים.

טכניקת מבחנה ליצירת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות אנושיות

סרטון זה מדגים את ההשראות וההדמיה של מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות או NETs בנויטרופילים מסומנים מראש באמצעות נסיוב מטופלים המכיל נוגדנים ציטופלזמיים אנטי-נויטרופילים. יתר על כן, שימוש בצבע DNA בלתי חדיר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר הדמיה של NETs.

אינדוקציה והדמיה של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים שסומנו מראש

כאן, אנו מציגים שיטה שבה נויטרופילים אנושיים בצפיפות נמוכה (-כעבור שנה-), התאוששה נוזל שטיפת הצפק לאחר הניתוח, לייצר מסיבית מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), השמנה ביעילות תאים סרטניים חינם לאחר מכן לגדול.

נויטרופילים מלכודות חוץ-תאי שנוצר על ידי נויטרופילים בצפיפות נמוכה המתקבל נוזל שטיפת הצפק התחלקות התא הגידול וקובץ מצורף

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת נויטרופילים מלכודות (רשתות) ו-NETQUANT הפעלה, תוכנה אוטומטית לחלוטין לכמת של רשתות בתמונות immunofluorescence.

הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT

פרוטוקול זה מתאר assay מלכודת חוץ-תאית נויטרופילים (נטו) של תפוקה רגיש מאוד, גבוהה עבור כימות חצי אוטומטיות של ex-vivo נטו היווצרות מאת immunofluorescence קונפוקלית תלת מימדי. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי להעריך את היווצרות נטו והשפלה אחרי גירויים שונים והוא יכול לשמש כדי ללמוד טיפולים פוטנציאליים, ממוקדות נטו.

תפוקה גבוהה הנועד להעריך ולכמת את היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית

מלכודות מוכילות (רשתות) הן מבנים תלת-מימדיים שנוצרו על-ידי ממריצים נויטרופילים גרנולוציטים. זה הפך ברור בשנים האחרונות כי רשתות מעורבות במגוון רחב של מחלות. זיהוי רשתות ברקמות עשויות להיות בעלת רלוונטיות אבחונית, ולכן נדרשות פרוטוקולים מתוקננת לתיוג רכיבי NET.

Immunofluorescence התוויות של האדם ומורין נויטרופילים מלכודות ממומנת ב-פרפין רקמה מוטבעת

מוצג כאן פרוטוקול לאינדוקציה וניתוח של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופיליות במבחנה (NETs). כימות של דנ"א, קתליצידין (LL37) ופעילות אנזים הניב נתונים המראים את השונות בהרכב ובמורפולוגיה של NETs המושרים על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים בתנאים מבוקרים דומים.

ניתוח מורפולוגי וקומפוזיציוני של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות המושרות על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים

מחקר זה מתאר שתי טכניקות לבידוד מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) בשפע ממח עצם של חולדה. שיטה אחת משלבת ערכת בידוד נויטרופילים מסחרית עם צנטריפוגת שיפוע צפיפות, ואילו השנייה משתמשת רק בצנטריפוגה שיפוע צפיפות. שתי הגישות מניבות NETs פונקציונליים העולים על אלה של נויטרופילים היקפיים בדם.

גישה ייחודית לבידוד נויטרופילים ממח עצם של חולדה עם קיבולת דומה

אנו מציגים שיטה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לכימות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) באמצעות מערכת ניתוח תאים חיים, יחד עם גישת צבע כפול תלוית חדירות ממברנה.

טכניקת תפוקה גבוהה בזמן אמת לכימות היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים

פרוטוקול מוגדר זה מתאר גישת מיקרוסקופיה בתפוקה גבוהה בזמן אמת כדי להמחיש ולכמת שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית (NET) במבחנה. השיטה הניתנת לשחזור מאפשרת לחקור את המאפיינים והקינטיקה של שחרור NET בעת גירוי עם משפרי NETosis מובהקים ומאפשרת הערכה של הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים של NETosis.

כימות מיקרוסקופי בזמן אמת בתפוקה גבוהה של שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית והערכת הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים

למדו שיטה פשוטה לבידוד מלכודות תאיות נויטרופילים (NETs) מדם אנושי שלם. הפרוטוקול משתמש בצנטריפוגה דיפרנציאלית ו-PMA ליצירת NETs, ומדגים את השפעתן על הידבקות תאי סרטן A549 במבחנת הידבקות אינ-ויטרו.

פשוטה מלכודות תאיות נויטרופילים אדם בידוד (רשתות) וטיפול

גלה סרטונים נוספים