Name: שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: למד שיטה אנזימטית לשחרור תאי גזע מזנכימליים מדוגמאות קרשו של מח עצם באמצעות אורוקינאז. פרוטוקול זה מאפשר הרחבת תאים לשימוש ברפואה רגנרטיבית במהירות ובעלות נמוכה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק הקרן הלאומית השוויצרית CR3I3_140717/1 והקרן השוויצרית לשיתוק.

הערה: aspirates מח עצם אנושי מפסגת הכסל נאסף ממתורמים באישור ועדת האתיקה של לוצרן. aspirates מח עצם לכלבים מפסגת הכסל נאסף עם consent.Human של בעל כלב (כ. 20 מיליליטר) וכלבים (כ. 10 מיליליטר) aspirates מח עצם היו אנטי-קרוש על ידי תוספת של 15 מיליליטר של 3.8% נתרן ציטרט מייד לאחר נסיגה בחדר הניתוח. הדגימות הועברו לסביבת המעבדה לעיבוד באותו היום כמו נסוג. 1. הכנת האוריקינאז (לפני 1 st שימוש) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש האוריקינאז באמצעות תמיסת מלח סטרילית פוספט (PBS) על פי הוראות היצרן: הוסף 10 מיליליטר PBS לבקבוק המחיצה-כניסה באמצעות מזרק 10 מיליליטר. להמס את החומר היבש על ידי מתערבל להשיג 50,000 יחידות הזרקה (U) לכל מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 aliquots μl (25,000 U כל אחת) ליםצינורות terile. חנות aliquots -20 ° C ולהשתמש בו בעת צורך במשך לפחות 6 חודשים. </li></ol> 2. שלבי הכנה של (לפני כל מח עצם טיפול) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של האוריקינאז אחד (25,000 U) ללשאוב מח עצם קורש (כרכים לשאוב עד 25 מיליליטר טופלו בהצלחה באמצעות aliquot יחיד של 25,000 U). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים מים באמבטיה או רועד חממה עד 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. אנזימתי Digest של קריש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל העבודה בממשלת זרימה למינרית בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום חיידקים של דגימות מח העצם במהלך עיבוד. כאשר עובדים עם חומר אנושי שעלולים להיות מדבק, השימוש בכפפות מגן, כמו גם טיפול זהיר מומלצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מסננת 100 מיקרומטר תא על גבי שפופרת 50 מיליליטר סטרילי. יוצקים בזהירות את לשאוב מח עצם דרך מסננת התא, הטיה המסננת או מסתובב חומר הקריש. השתמש טיפ pipet סטרילי לזרימה טובה יותר באמצעות רשת המסנן. הערה: הימנע מכל דילול של הקריש, למשל, על ידי שטיפת הקריש עם PBS. האוריקינאז פועל באופן עקיף ודורש מרכיבי הסרום (כלומר., פלסמינוגן) מהביופסיה לתקציר יעיל. תוך המשך התהליך עם חומר הקריש, התסנין יכול להיות כל הזמן בRT עד לשימוש נוסף בשלב 3.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את חומר קריש מח עצם לתוך צלחת תרבית תאים ריקה באמצעות מלקחיים סטרילית. חותך את הפסולת לחתיכות קטנות של כ 2 מ&quot;מ 3 באמצעות אזמל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החתיכות הקטנות של הקריש לתוך צינור תגובה 50 מיליליטר באמצעות המלקחיים סטרילית. ודא שיש לו את הקריש הטחון מראה רטוב. אם זה נראה יבש, להשתמש בחלק מהתסנין מהצעד 3.1 כדי ללחלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate הקריש על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים באמצעות pipet microtiter 5 מיליליטר. להוסיף aliquot 1 של האוריקינאז למדגם. דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס או באמבט מים או בחממה רועדת (בעדינות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate ידי pipetting מעלה ומטה במשך 5 פעמים באמצעות pipet 5 מיליליטר. לבצע שלב זה בקבינט בטיחות ביולוגי. דגירה של 30 דקות נוספות על 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, triturate שוב 5 פעמים באמצעות pipet 5 מיליליטר. לעבור על מסננת תא 100 מיקרומטר טרי לברכה עם התסנין משלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא בטמפרטורת הסביבה של 10 דקות ב 500 x גרם. בטל supernatant. להשעות מחדש את התא גלולה בתקשורת כמפורט להלן או בהתאם לנוהל הסטנדרטי של המעבדה שלך לתרבות הרחבת MSC. </li></ol> 4. מתזמן תרבות תאי הרחבה וצלחות CFU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים (בהיקף של אריתרוציטים ותאי mononuclear) ב 50 מיליליטר של מדיום בסיסי: Alpha-ממ בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS), 100 U / ml פניצילין, 100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין ו -2.5 מ&quot;ג / מיליליטר amphotericin B . ספירת התאים 01:10 מדוללים בפתרון Trypan הכחול באמצעות chambe נויבאוארr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת התאים בצלוחיות תרבית תאים בצפיפות של 5 x 10 7 תאים / 2 סנטימטר ודגירה בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס. אם זמין, להשתמש חוסר חמצן תנאים (5% חמצן). לשליטה assay CFU, צלחת 10 9 תאים בצלחת תרבית תאים של 10 סנטימטרים קוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 ימים של תרבות, תאי גזע mesenchymal מחוברים לצלחת תרבית תאים בזמן שתאים אחרים יישארו בהשעיה. לשנות את התקשורת עם מדיום בסיסי בתוספת 5 ng / ml גורם בסיסי צמיחת פיברובלסטים (bFGF). לשליטה assay CFU, טיפול בצלחת תרבית התאים באופן דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך תרבית תאים עבור הסכום כולל של 2 שבועות, החלפת מדיה שלוש פעמים בשבוע. אם תאים יעלו על 80% confluency, לפצל על ידי trypsinization. לשליטה assay CFU, להחליף את התקשורת באופן דומה, אך לא לפצל את התאים לקורס של השבועות. </li></ol> 5. Giemsa כתם לAssay CFU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מיליליטר של Giemsa-פתרון לכל צלחת: דילאוטה פתרון המניות (7.6 גר &#39;/ ליטר Giemsa בגליצרול: מתנול) 1:10 ב מים סטריליים (תמיד להכין דילול עבודה טרי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מצלחת תרבית תאים ולשטוף את התאים עם PBS. להיות מאוד precautious בעת החלת נוזל לצלחת פטרי ולהימנע משטיפה מהתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים במתנול הטהור במשך 5 דקות בRT. מחק את מתנול. הוסף את Giemsa-הפתרון ודגירה של 60 דקות בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים עם PBS. אוויר יבש ראש הצלחת ראשון על מגבת נייר. ספירת המושבות באופן ידני. זו מושגת הטובה ביותר באמצעות עט סימון על גביו של הצלחת. </li></ol> 6. בידול MSC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידול MSCs כלבים הערה: MSCs כלבים הובדל לchondrogenic, osteogenic ושושלות adipogenic על ידי גירוי עם המדיה המתאימה לארבעה שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל בידול Adipogenic, MSCs התרבות בmonolayer ב 4 x 10 5 ceLLS / 2 סנטימטר לסירוגין שני תנאי תרבות שונים כדלקמן; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות בתקשורת תחזוקת adipogenesis מכילה DMEM + Glutamax, FBS 3%, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B ו -170 מ&quot;מ אינסולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות בתקשורת גרימת adipogenesis עם מדיום תחזוקה בתוספת FBS 3%, 5% בסרום ארנבת, dexamethasone 1 מיקרומטר, 500 מיקרומטר 3-isobutyl-1-methylxanthine, 33 מיקרומטר ביוטין, 5 מיקרומטר rosiglitazone ו -17 מיקרומטר pantothenate 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתענג טיפות שומנים על ידי צביעה עם השמן האדום-O. בקצרה, לתקן תאים עם פורמלדהיד 10%, לשטוף עם PBS ואת הכתם עם O האדום נפט 0.35% בisopropanol. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרבות בידול osteogenic MSCs בmonolayer בשעה 7 x 10 3 תאים / 2 סנטימטר ולעורר בפעולות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתקדם DMEM (GIBCO) + Glutamax, FBS 5%, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B, 501; חומצה אסקורבית L-M 2-פוספט, 10 SS-glycerophosphate מ&quot;מ ו -100 ננומטר dexamethasone. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את פיקדונות מינרליזציה על ידי כתם פון Kossa (5% אגנו 3). בקצרה, לתקן את התאים עם פורמלדהיד 10%, לשטוף עם PBS ואת כתם עם 5% אגנו 3 במים מזוקקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידול Chondrogenic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוביות Cut (3 מ&quot;מ לכל צד) מהתקן רפואי ספוג בצורה, היוו מאני lyophilized סוג קולגן, ומשמשות כחומר פיגום לתמוך תאים 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MSCs זרע בחלק העליון של הקוביות בריכוז של 4 x 10 6 תאים / מיליליטר (~ 70,000 תאים / קובייה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני התוספת של תקשורת, לאפשר לתאים לדבוק בקוביות למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על מבני MSC-קולגן בתקשורת chondrogenic בהיקף של DMEM / F12 + Glutamax, FBS 2.5%, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B, 40 ng / ml dexamethasone, 50 מיקרוגרם / מיליליטר אסקורבית החומצה 2-פוספט,50 מיקרוגרם L-פרולין / מיליליטר, 1x אינסולין-transferrin-סלניום X, ו- 10 ng / ml הפיכת גורם-β1 צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכתמי כחולי alcian לדמיין הצטברות של proteoglycans בסעיפי מבנים. בקצרה, להכתים את החלקים O / N עם 0.4% הכחולים alcian מומסים בH 0.01% 2 SO 4 ו0.5m hydrochloride guanidine. בשלב הבא, לשטוף את החלקים נשטפו למשך 30 דקות ב -40% DMSO ו0.05M MgCl 2. תאים היו counterstained עם אדום מהיר גרעיני. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).</li>
<li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).</li>
<li>Bartholomew, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+suppress+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+prolong+skin+graft+survival+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo.</a> Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).</li>
<li>Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of mesenchymal stem cells.</a> J Hematol Oncol. 5, 19(2012).</li>
<li>Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mesenchymal+stem+cells%3A+characterization%2C+differentiation%2C+and+application+in+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).</li>
<li>Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Videos+in+clinical+medicine.+Bone+marrow+aspiration+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy.</a> N Engl J Med. 361 (15), e28(2009).</li>
<li>Cuthbert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-platform+quality+control+assay+to+quantify+multipotential+stromal+cells+in+bone+marrow+aspirates+prior+to+bulk+manufacture+or+direct+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use.</a> Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).</li>
<li>Veyrat-Masson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+content+of+fresh+bone+marrow%3A+a+proposed+quality+control+method+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy.</a> Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).</li>
<li>Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+and+subsequent+infusion+of+human+bone+marrow-derived+stromal+progenitor+cells+%28mesenchymal+progenitor+cells%29%3A+implications+for+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use.</a> Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).</li>
<li>Bertolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+expansion+score+for+tissue-engineering+applications+with+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li>
<li>Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stromal+cell+therapy+and+risk+of+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies.</a> Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).</li>
<li>Bonab, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+mesenchymal+stem+cell+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aging of mesenchymal stem cell in vitro.</a> BMC Cell Biol. 7, 14(2006).</li>
<li>Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lymphocytes+from+clotted+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of lymphocytes from clotted blood.</a> J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).</li>
<li>De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+immunophenotyping+of+leukemia+cells+in+clotted+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow.</a> J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).</li>
<li>St Antoine, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+thrombolytic+drugs+on+clotted+blood+and+bone+marrow+specimens+to+generate+usable+cells+for+cytogenetic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses.</a> Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).</li>
<li>Kisiel, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+in+vitro+proliferation+of+canine+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow%2C+adipose+tissue%2C+muscle%2C+and+periosteum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum.</a> Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).</li>
<li>Bertolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+different+commercial+scaffolds+on+the+in+vitro+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+to+nucleus+pulposus-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Spine+J%22%5BJournal%5D)">Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells.</a> Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).</li>
<li>Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+insights+into+the+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Stem cells: insights into the secretome.</a> Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).</li>
<li>Benvenuti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosiglitazone+stimulates+adipogenesis+and+decreases+osteoblastogenesis+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol+Invest%22%5BJournal%5D)">Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells.</a> J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).</li>
<li>Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+purified%2C+culture-expanded+human+mesenchymal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro.</a> J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).</li>
<li>Patel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+banking+for+research--bench+to+bedside+and+back--myth%2C+reality+or+fast+fading+reality+at+the+dawn+of+a+personalised+healthcare+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era.</a> Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).</li>
<li>Smith, H. W., Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+signalling+by+uPAR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell signalling by uPAR.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

באופן שגרתי אנו דוגמים מח עצם בזמן שהמטופל עובר ניתוח (במקרה שלנו בעיקר ניתוח בעמוד השדרה), עם היתרון שיש לו רק קצת עבודה נוספת שבוצעה על ידי אנשים בחדר הניתוח. למרות שהדגימות מעורבבות עם נתרן ציטרט מייד לאחר נסיגה, דגימות רבות היו קרשו באופן חלקי, כאשר הם הגיעו למעבדה לעיבוד. בשלב זה, דגימה מחדש להחליף דגימות קרושנה תהיה התערבות נוספת נפרדת שחייב שוב הרדמה מקומית או כללית 6. זה מחייב את נכונותם של שני אנשי צוות הקליניים והתורם לתרום וצורכת הרבה משאבים 21. </...

תאי גזע mesenchymal (MSCs) לשחק תפקיד מרכזי ברפואת רגנרטיבית והנדסת רקמות. הם יכולים להגר, להתמיין לסוגי תאים שונים 1 ונקלט, אשר הופך אותם למועמדים אידיאליים עבור טיפולי אוטולוגי 2,3. בזמן האחרון, ניסויים קליניים באמצעות MSCs לתיקון עצם וסחוס, שתל לעומת מחלה מארח או מחלת לב הושקו 4. ניתן לקצור MSCs אלה מרקמת חוט או שומן הטבור אבל תוצאות המבטיחות ביותר התקבלו מתאי גזע שמקורם במח עצם 5. רכס הכסל מאפשר לאסוף כמות ניכרת של מח עצם ולכן משמש כאתר עיקרי של שאיפה 6. עם זאת, איכות לשאוב יורדת עם עלייה בנפח של מח עצם נסוג. בעוד 5 מיליליטר הראשון של לשאוב מח עצם מכיל תאי גזע באיכות גבוהה, נסיגה של נפחים גדולים יותר מובילה לדילול של לשאוב עם f דם ההיקפיROM עצם כלי הדם מאוד 7. בגלל megakaryocytes וטסיות הדם הנוכחיים, aspirates מח עצם נוטה קרישה, תרופות נגד קרישת דם, אלא אם כן נמצאים בשימוש. אבל אפילו עם תרופות נגד קרישת דם, קרישים עלולים להתרחש. במח עצם, תאי גזע מייצגים רק חלק קטן מבריכת התא הכוללת 8 וצריכים להיות מורחב בתרבות עבור רוב הנדסת רקמות או יישומים טיפוליים 4. האיכות של תרבות כזו תלויה במידה רבה בברכת התא הראשונית, כלומר., גיוון ומוצא גבוה מספר 9. מספרים נמוכים של תאי גזע מנסיגות יכולים להיות מוסברים בחלקו על ידי השתנות תורם. מצד השני, MSCs מדגימות באיכות נמוכות דורש זמן רב יותר בתרבות ובpassaging הוארך להגיע למספר הרצוי של תאים. בכל מקרה, passaging המורחב הוא מקור להזדקנות תא ויכול להוביל לאובדן של בידול פוטנציאל 10. לכן, מותאם פרוטוקולים שיכולים למקסם y תאIELD ולמנוע מהשפעות מזיקות צריכה להיות מפותחות 11,12. כשהתחלנו לעבוד עם MSCs כלבים, שהיינו נדהמתי לראות שעל שלושה בארבע דגימות מח עצם כלבי קרישים, ואילו דגימות קורשים למרבה המזל אדם (אחד מכל עשר) היו שכיחות פחות. מצד השני זה לא היה מפתיע, שנצפינו תשואות נמוכות בהרבה של תאי גזע מדגימות שנקרשו. כדי לפתור את הבעיה החוזרת של דגימות קורשים, שפיתחנו הפרוטוקול באמצעות האוריקינאז תרופת thrombolytic במקום דגימה מחדש. טיפולים הטרומבוליטיות יכולים לנטרל מצבי מסכני חיים כגון חסימה של כלי דם גורמים התקף לב, שבץ או תסחיפים בגלל קרישה לא רצויה. הם עובדים על ידי פירוק של קרישים דרך מחשוף האנזימטית של הפיברין על ידי מפעילי פלסמין ופלסמינוגן האנזימטית. למרות השימוש הרחב לטיפול בחולים, רק מעט מאוד פרסומים קיימים שפעילות thrombolytic מנוצלתעבור יישומי מעבדה כדי להציל דגימות קורשות, בעיקר מתמקד לימפוציטים. בשינה 1987, Niku et al. תיארתי את השימוש בstreptokinase להמסת קרישי דם וכתוצאה מכך לימפוציטים תפקודיים 13 וארבע שנים מאוחר יותר, De Vis et al. הרחיב את השימוש בstreptokinase לבודד תאי סרטן דם מהדם ומח עצם עבור יישומי הזרימה cytometric 14. פרסום האחרון יותר מצביע על השימוש בAlteplase לאבחון הסרטן 15. תוך שימוש באותה הגישה האנזימטית, הפרוטוקול שלנו מתמקד בבידוד של מח עצם צורת multipotent MSCs לספק כלי לחוקרים בתחום תאי גזע.

<table><tbody><tr><td>רכיבים בינוניים</td><td></td><td></td><td></td>בסיסיים</tr><tr><td>PenStrep 100X</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>אנושי FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>MEM אלפא עם נוקלאוזיד, עם גלוטמין יציב</td><td>Amimed</td><td>1-23S50-I</td><td></td></tr><tr><td>FBS מומת</td><td>חום Amimed</td><td>2-01F36-I</td><td></td></tr><tr><td>אמפוטריצין B</td><td>Applichem</td><td>A1907</td><td></td></tr><tr><td>רכיבים בינוניים</td><td></td><td></td><td></td>אדיפוגניים</tr><tr><td>DMEM-HAM F12 + GlutaMAX</td><td>Amimed</td><td>1-26F09-I</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין&nbsp;</td><td>סרום סיגמא</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>ארנב&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16120099</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Applichem</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>רוזיגליטזון&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>פנטותנט&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>שמן אדום-O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr>רכיבים <td></td><td></td><td></td><td>בינוניים אוסטאוגניים</td></tr><tr><td>חומצה L-אסקורבית 2-פוספט</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-גליצרופוספט</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>כסף חנקתי (AgNO3)</td><td>Sigma</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>רכיבים</td><td></td><td></td><td></td> בינוניים כונדרוגניים</tr><tr><td>Biopad - מכשיר רפואי בצורת ספוג&nbsp;</td><td>Euroresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-פרולין&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין-טרנספרין-סלניום X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה טרנספורמטיבי אנושי-ובטא; 1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A3157</td><td></td></tr><tr><td>גרעיני מהיר אדום</td><td>Sigma</td><td>N8002</td><td></td></tr><tr><td>גנרי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tri-נתרן ציטראט דיהידראט</td><td>Applichem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Applichem</td><td>964.9100</td><td></td></tr><tr><td>Urokinase</td><td>Medac</td><td>1976826</td><td></td></tr><tr><td>0.5% טריפסין-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>כתם Giemsa</td><td>Applichem</td><td>A0885</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>Applichem</td><td>A0877</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גופרתית (H2SO4)</td> <td>Applichem</td><td>A0655</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td> <td>Applichem</td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2)</td> <td>Applichem</td><td>A3618</td><td></td></tr><tr><td>גואנידין הידרוכלוריד</td><td>Applichem</td><td>A1499</td><td></td></tr><tr><td>חומרים</td><td></td><td></td><td></td>מתכלים</tr><tr><td>50 מ"ל צינור תגובה</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק</td><td>בראון</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>מחט סטריקנית (22 גרם)</td><td>בראון</td><td>4657624</td><td></td></tr><tr><td>1.7 מ"ל מיקרו-צינורות</td><td>Brunschwig</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; מסננת תאים</td><td>m Falcon</td><td>6.05935</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים סטריליים</td><td>Bastos Viegas, SA</td><td>489-001</td><td></td></tr><tr><td>אזמל סטרילי</td><td></td><td>צלחת</td> חיתוך תאים בראון 5518059 <td></td></tr><tr><td>פרימריה</td><td>Falcon</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>C-Chip Neubauer בקבוק</td> תרבית תאים משופר <td>Bioswisstech</td><td>505050</td><td></td></tr><tr><td>- בקבוק T300</td><td>TPP</td><td>90301</td><td></td></tr><tr><td>ציוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית מיקרוביולוגית Class II</td> אמבט מים <td>82011500</td><td></td><td>סקאן</td></tr><tr><td></td><td>Memmert</td><td>1305.0377</td><td></td></tr><tr><td>Stripettes פיפטה סרולוגית 5 מ"ל</td><td>מיקרוסקופ קורנינג</td><td>4487-200ea</td><td></td></tr><tr><td></td><td>אולימפוס</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>חממה לחה Heracells 240</td><td>Thermo 51026331</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדעי Heraeus Multifuge 1S-R</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004331</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) - המתקבלים בדרך כלל ממח עצם - דורשים לעתים קרובות תרבית הרחבה. הפרוטוקול שלנו משתמש באורוקינאז בדרגה קלינית כדי לפרק קרישים במח העצם ולשחרר MSCs לשימוש נוסף. פרוטוקול זה מספק חלופה מהירה וזולה לדגימה מחדש של מח עצם. מח עצם הוא מקור עיקרי ל-MSCs, המעניינים להנדסת רקמות וטיפולים בתאי גזע אוטולוגיים. עם הגמילה מח העצם עלול להיקרש, מכיוון שהוא כולל את כל המערכת ההמטופויאטית. הקרישים המתקבלים מכילים גם MSCs שאבדו לצורך תרבית הרחבה או טיפול ישיר בתאי גזע. חווינו ש-74% מדגימות מח העצם של הכלבים הכילו קרישי דם והניבו פחות ממחצית ממספר תאי הגזע הצפוי מדגימות לא קרושות. לפיכך, פיתחנו פרוטוקול לעיכול אנזימטי של הקרישים האלה כדי למנוע דגימה מחדש של מח עצם אינטנסיבי ויקר. אורוקינאז - תרופה טרומבוליטית מאושרת קלינית וזמינה - מנקה את קרישי מח העצם כמעט לחלוטין. כתוצאה מכך, שאיבות מח עצם מטופלות מניבות מספרים דומים של MSCs כמו דגימות לא קרושות. כמו כן, לאחר הטיפול באורוקינאז התאים שמרו על פעילותם המטבולית ועל יכולתם להתמיין לשושלות כונדרוגניות, אוסטאוגניות ואדיפוגניות. הפרוטוקול שלנו מציל דגימות דם ומח עצם קרושות מבלי להשפיע על איכות התאים. זה מיישן דגימה מחדש, מפחית במידה ניכרת את עלויות הדגימה ומאפשר שימוש בדגימות קרושות למחקר או לטיפול.

העובדות כי 74% מהדגימות מח עצם כלבים (n = 54) הכילו קרישים כאשר הם הגיעו למעבדה (איור 1 א) זה יחד עם ירידה בתשואות MSC מדגימות אלה, גרמו לנו להאמין שמספר לא מבוטל של MSCs היה לכוד בתוך קרישים . ואכן, DAPI כתם פשוט של חומר קריש מחולק מאשר את הנוכחות של תאי בעלי גרעין בצפיפות גבוהה (איור 1). זה סופו של דבר מוביל למספרים נמוכים של תאי גזע זמינים לתרבות התרחבות, אשר מופעלים עלינו לפתח את הפרוטוקול באמצעות האוריקינאז. בדרך כלל קרישים נעלמים כמעט לחלוטי...

תאי גזע מזנכימליים מתקבלים בדרך כלל ממח עצם ודורשים תרבית הרחבה. כאשר דגימות נקרשות לפני העיבוד, ניתן ליישם פרוטוקול המשתמש בתרופה הטרומבוליטית (האנזימטית) אורוקינאז כדי לפרק את הקריש. לפיכך, תאים משתחררים וזמינים לתרבית הרחבה. פרוטוקול זה מספק אלטרנטיבה מהירה וזולה לדגימה מחדש.

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לנצל דגימות של מח עצם שקרישו על ידי עיכול הקרישים באמצעות urokinase. פעולה זו מבוצעת תחילה על ידי סינון דגימת מח העצם דרך מסננת תאים. לאחר מכן, קריש מח העצם נחתך לחתיכות קטנות.לאחר מכן מעבירים את הקריש לשפופרת Falcon ומעכלים אותו באמצעות urokinase. לבסוף, זורעים את חומר הקריש שעבר עיכול להרחבה של תאי גזע מזנכימליים או MSCs. בסופו של דבר, משווים את הצלחות לצלחת ביקורת המשתמשת ב-em sustain כדי להעריך את יעילות העיכול.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לעבר טיפול או אבחון באמצעות תאי גזע אוטולוגיים. זאת מכיוון שהשתלה דורשת הרחבה ודיפרנציאציה של מספר רב של תאי גזע. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר הבחנו שדגימות רבות של מח עצם מ-DOC היו קרועות כאשר הגיעו למעבדה שלנו.פשוט לא רצינו להשליך דגימות יקרות כל כך. כדי לשחזר את ה-urokinase, הזרקו 10 milliliters של PBS סטרילי לתוך בקבוק כניסת המחיצה וערבבו במערבל Vortex עד להמסה בריכוז של 50,000 units ל-milliliter. חלקו ל-aliquots של 500 microliters, שכל אחד מהם מכיל 25,000 units, לתוך מבחנות סטריליות ואחסנו בטמפרטורה של negative 20 degrees Celsius למשך עד שישה חודשים. כדי לבצע תגובת עיכול, הפשיתו aliquot אחד של urokinase עבור כל דגימת שאיבת מח עצם עכורה בנפח של עד 25 milliliters.חממו מראש אמבט מים או דגרה רועדת ל-37 °C תחת קבסינת בטיחות עם זרימה למינרית. ובזמן עניית כפפות, הניחו מסנני תאים של 100 µm על גבי מבחנה של 50 mL. שפכו בזהירות את השאיבה ממחית העצם דרך מסנן התאים, תוך הטיית המסנן או הזזת חומר הקריש.שפכו בזהירות את השאיבה של מחית העצם דרך מסננת התאים, ללא הטיית המסננת וללא הזזה של חומר הקריש. השתמשו בפיפטה סטרילית לשיפור הזרימה דרך רשת המסנן ובפינצטה סטרילית. העבירו את חומר קריש מחית העצם לכלי תרבית תאים ריק.לאחר מכן, השתמש בסקאלפל סטרילי כדי לחתוך את השאריות לחתיכות של שני מילימטרים מעוקב. בשלב הבא, באמצעות פיפט מיקרוטיטר של חמישה מיליליטר, בצע טריטורציה לקריש על ידי שאיבה ופליטה של הנוזל חמש פעמים. לאחר מכן, הוסף אליקוט אחד של urokinase לדגימה והדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות במקלחת או באינקובטור עם ניעור.לאחר הדגירה בארון הבטיחות הביולוגית, בצעו שוב טריטורציה כפי שהודגם והדגירו למשך 30 דקות נוספות. לאחר מכן, בצעו טריטורציה חמש פעמים נוספות, העבירו את הדגימה דרך מסנן תאים חדש של 100 micrometer ואגדו יחד עם התסנין הראשוני. צנטריפוגו את תרחיף התאים במהירות של 500 ×g ובטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר השלכת הנוזל העליון, השתמשו ב-50 milliliters של מצע בסיסי כדי לערבב מחדש את המשקע.באמצעות תמיסת Trian blue, דללו דגימה אחת מתוך ארבעה (quad) של תאי ALI שהושעו ביחס של 1:10, והעבירו את התמיה לתא נויבאואר (neubauer chamber) לצורך ספירה. לאחר ספירת התאים, זרעו אותם בבקבוקי תרבית תאים בצפיפות של 5×10⁷ תאים לסמ"ק עבור לוח הבקרה של בדיקת ה-CFU.10⁹ תאים בצלחת תרבית תאים עגולה בקוטר 10 סנטימטר, להדגיר בתא לח או בחדר לחות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר שלושה ימי תרבית, תאי MSC יהיו צמודים לצלחת התרבית בעוד שתאים אחרים יישארו בתגלוש. השתמש במצע בסיסי המכיל 5 ng/mL של basic fibroblast growth factor להחלפת המצע הן בצלחות הניסוי והן בצלחות הביקורת.המשיכו בגידול למשך שבועיים בסך הכל, תוך החלפת המצע שלוש פעמים בשבוע. אם התאים עברו 80% התרחבות (confluency), בצעו trypsinization לתרבית ופצלו אותה לצורך ביצוע בדיקת CFU.הכינו 10 מיליליטר של תמיסת GSA לכל צלחת, באמצעות מים סטריליים לדילול תמיסת המקור ביחס של 1:10. הסירו את המצע מצלחת תרבית התאים והשתמשו ב-PBS כדי לשטוף בזהירות את התאים במתנול טהור.קבעו את התאים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, השליכו את המתנול והוסיפו את תמיסת ה-gemsa. דגרו בתא לחות בטמפרטורה של 37 °C למשך 60 דקות לאחר הדגירה.שטפו את התאים פעמיים באמצעות PBS. לאחר מכן, ייבשו את הצלחת באמצעות ייבוש באוויר. הניחו את הצלחת הפוכה על נייר סופג וסמנו אותה באמצעות טוש בגב הצלחת.ספרו ידנית את המושבות עבור התמיינות אדיפוגנית. גדלו MSCs בשכבה אחת בריכוז של 4×10⁵ תאים לסנטימטר רבוע. החליפו בין שני תנאי תרבית שונים עבור התנאי הראשון.תרבתו תאיים במצע תחזוקה לאדיפוגנזה, ועבור התנאי השני תרבתו תאיים במצע השראת אדיפוגנזה עם מצע תחזוקה בהתאם למתכונים המפורטים בפרוטוקול הטקסט. כדי להדמיא את טיפות הליפידים, השתמשו ב-10% formaldehyde לקיבוע קצר של התאים.לאחר מכן, שטפו את התאים ב-PBS, לפני שימוש ב-0.35% oil red O באיזופרופנול לצביעת התאים לצורך בחינת התמיינות אוסטאוגנית. תרבתו MSCs בשכבה אחת (monolayer) בריכוז של 7×10³ תאים לסמ"ר. לאחר גירוי התאים באמצעות המדיום המתואר בפרוטוקול הטקסט, השתמשו ב-10% formaldehyde לקיבוע קצר של התאים. לאחר שטיפת התאים ב-PBS, השתמשו בצבע Von Kossa לזיהוי משקעים מינרליים. כדי לבצע התמיינות קונגנית ממכשיר רפואי בצורת ספוג העשוי מקולגן סוג I ליופיליזד, חתכו קוביות של 3 mm לכל צד. זרעו MSCs על גבי הקוביות בריכוז של 4×10⁸ תאים למל', לאחר שהמתנתם 30 דקות בטמפרטורת החדר להיצמדות התאים לקוביות.יש לתחזק את מבני הקולגן של ה-MSC במצע קונגני כפי שמופיע בפרוטוקול הטקסטואלי. יש להוסיף תמיסת Ian Blue בריכוז 0.4% לחתכים ולהדגיר למשך לילה בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius. למחרת, יש להשתמש ב-40%DMSO ובמגנזיום כלוריד בריכוז 0.05 molar כדי לשטוף את התאים למשך 30 דקות, לפני השימוש ב-nuclear fast red לצביעת נגד של התאים כפי שמוצג כאן.צביעת DAPI פשוטה של נתח מחומר קריש מאשרת נוכחות של תאים בעלי גרעין בצפיפות גבוהה, מה שמעיד על כך שמספר ניכר של MSCs לכודים בתוך הקרישים. בהתאם לפרוטוקול המתואר בסרטון זה, טיפול ב-urokinase אפשר עיכול של כל הקרישים למעט 15% ממשקלם של קרישי דם של כלבים ו-9% ממשקלם של קרישי דם של בני אדם. כדי לקבוע את יעילות העיכול באמצעות urokinase, תאים ממסנני דגימות קרושות וקרישים שעוכלו הושקעו בנפרד והודגרו למשך שבועיים.בתמיכת התאים נצפו פי 3.8 יותר CFUs מדגימות כלבים שעברו עיכול באמצעות urokinase מאשר מהסינונים הראשוניים המקבילים. דגימות אנושיות שעברו עיכול הראו פי 1.6 יותר CFUs מאשר הסינונים שלא עברו עיכול. בניסוי זה, MSCs מקרישי מח עצם הושוו ל-MSCs שהופקו מדגימות מח עצם קרושות של UNC ביכולתן להבדיל תחת תנאי תרבית מתאימים.לאחר ארבעה שבועות בתרבית, ניתן היה לגזור תאי MSCs מדגימות שעברו עיכול לשורות תאים אדיפוגניות, אוסטאוגניות וכונוגניות. יתרה מכך, צביעות von Casa oil, red O ו-Sian blue העידו על היעדר הבדלים ברמת הגזירה בין הקבוצות. לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצע את ה-Mr.Nick בתוך כשעה וחצי, במידה והוא מבוצע כראוי.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה כיצד לבודד תאי גזע המטופואטיים לתרבית הרחבה, גם אם הדגימות שלכם קרישתיות, במקום להשליך את הדגימה. הפרוטוקול שלנו משתמש באנזים kinase כדי לעכל את הקריש ולבודד תאי גזע ES לתרבית הרחבה.

an-enzymatic-method-to-rescue-mesenchymal-stem-cells-from-clotted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion

שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

לתאי גזע מזנכימליים (MSCs) יש פוטנציאל התמיינות לקראת שושלת אוסטאובלסטית כאשר הם מגורים עם גורמים מסיסים או ביו-חומרים ספציפיים. עבודה זו מציגה אפשרות חדשה להעברת MSCs מקרום מי השפיר האנושי (AM-hMSCs) המעסיק את מטריצת עצם הבקר Nukbone (NKB) כפיגום.

בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

Culturing תאי mesenchymal סטרומה אדם (hMSCs) עם סרום אוטולוגי, מפחית את הסיכונים של דחייה על ידי חומר xenogeneic והשפעות שליליות אחרות. זה גם מאפשר ההתאוששות של תת-קבוצה של אבות mesodermal, אשר יכול לספק hMSCs הטרי. Embedding hMSCs ב קריש הפיברין עצמי מאפשר טיפול קל והשתלת כירורגים יעילה.

תרבות משלוח Cell mesenchymal סטרומה ב עצמי תנאים: גישה חכמה עבור יישומים אורתופדיות

פרוטוקול זה ממחיש הליך בטוחים ויעילים כדי לשנות CD133+ hematopoietic תאי גזע. הציג נגיפי, מגנטי polyplex-הגישה המבוססת על עשוי לספק בסיס אופטימיזציה של תאי גזע טיפולית אפקטים כמו גם לגבי ניטור המוצר תא מנוהל באמצעות תהודה מגנטית.

פרוטוקול להעברת MicroRNA לתוך למבוגרים הנגזרות מח עצם Hematopoietic תאי גזע כדי לאפשר הנדסה תא בשילוב עם מיקוד מגנטי

פרוטוקול זה מספק שיטה נטולת אנזימים לבידוד תאי גזע mesenchymal מ מתיחת בטן ודגימות ליפוף באמצעות שיטת החקור. העדר אנזימים קשים או צעדים צנטריפוגה מספק תאי גזע רלוונטיים קלינית שניתן להשתמש בהם למחקרים בתוך מבחנה או להעביר חזרה למרפאה.

שיטה נטולת אנזימים לבידוד והתרחבות של אדיפוז האנושית-תאי גזע נגזרים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מתודולוגיה משופרת לבידוד ADSC וכתוצאה מכך תפוקה תאית אדירה עם רווח בזמן בהשוואה לספרות. מחקר זה מספק גם שיטה פשוטה להשגת מספר גדול יחסית של תאים בני קיימא לאחר שימור בהקפאה לטווח ארוך.

טכניקה לקבלת תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן ואפיון שבר כלי דם סטרומלי בשימור בהקפאה ארוכת טווח

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות של תאי גזע מזנכימליים אנושיים בשיטת המיון של תא יחיד. באופן ספציפי, השימוש במיון תא בודד יכול להשיג טוהר של 99% של התאים האימונופנוטיפיים מאוכלוסייה הטרוגנית בשילוב עם גישה מבוססת ציטומטריית זרימה מולטי-פרמטרית.

מיון חד-תאי של תאי גזע מזנכימליים אימונופנוטיפיים משיניים נשירות שעברו קילוף אנושי

כאן אנו מציגים פרוטוקולים המאפשרים בידוד של תאי סטרומה מעצם מורין, מח עצם, בלוטת התימוס ורקמה תימית אנושית התואמת למולטיומיקה של תא יחיד.

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חסכונית לטיהור, הרחבה ואפיון תאי גזע מזנכימליים הומוגניים ביותר של מח עצם (BMSCs) מעכברים. גישה זו מאפשרת רכישה של כמויות גדולות של BMSCs עם פוטנציאל התפשטות והתמיינות גבוה, תמיכה במודלים של עכברים וקידום מחקר פרה-קליני.

טיהור, הרחבה ופנוטיפ מבוסס ציטומטריה של תאי גזע מזנכימליים במח עצם שמקורם בעכבר

למד שיטה אנזימטית לשחרור תאי גזע מזנכימליים מדוגמאות קרשו של מח עצם באמצעות אורוקינאז. פרוטוקול זה מאפשר הרחבת תאים לשימוש ברפואה רגנרטיבית במהירות ובעלות נמוכה.

שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם

גלה סרטונים נוספים