Name: חמצן גלוקוז קיפוח וReoxygenation כ במבחנה איסכמיה reperfusion פציעת דגם לחוסר תפקוד מחסום דם-המוח לומד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: למדו את מודל OGD-R לחקר פציעת איסכמיה-ריפרפוזיה במעטפת הדם-מוח. השיטה משתמשת בתרביות תאי אנדותל מוחיים של עכברושים וצביעה אימונופלואורסצנטית לניתוח מבני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים סקוט ולבן בית החולים תכנית מענקי מחקר לתמיכה כספית וטקסס A &amp; M למדעי בריאות מרכז מכללה למעבדת הדמיה רפואה משולבת לשימוש במיקרוסקופ לייזר confocal. אנו מכירים מר גלן קרייר לעזרה עם עריכת כתב יד.

1. זריעה של תאי האנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג תרבויות עיקריות של RBMEC של חולדות ספראג Dawley מבוגרות (או לקבל אותם באופן מסחרי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח RBMECs בפיברונקטין 100 סנטימטר (50 מיקרוגרם / מיליליטר) צלחות פטרי מצופים באמצעות מדיום צמיחת תאי אנדותל במוח החולדה. לשנות את המדיום כל יומיים, עד שהוא הגיע confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשהגיע confluency 80-90%, לשטוף בעדינות את התאים שבנאגרו מלוח 5 מיליליטר פוספט (PBS) על ידי מתערבל. לאחר מכן התאים מנותקים על ידי חשיפתם ל1 מיליליטר של תמיסת 0.25% חמים trypsin- חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), equilibrated עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2-5 דקות, עד שהתאים מנותקים ומפוזר. הערה: לחץ על צלחת התרבות לנתק את התאים. צפה בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר ניתוק של תאים מלאים מפני שטח של הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה 5 מיליליטר מלא לצלחת פטרי כדי לנטרל טריפסין.פיפטה את המדיום המכיל תאים מנותקים ולאסוף אותו לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדיה המכילה תאי אנדותל ב 220 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ולשמר את גלולה המכילה cells.Suspend גלולה ל3-5 בינוני צמיחת תאי אנדותל מוח החולדה מיליליטר טרי בעדינות על ידי ערבוב אותו ואת עם תאי פיפטה יהיה אז ייספר באמצעות דלפק תא אוטומטי או hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא לפיברונקטין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) precoated 8 מערכת קאמרי שקופיות גם סטרילי, 0.7 סנטימטר 2 / היטב עם צפיפות זריעה הנעה בין 10,000-15,000 תאים בכל טוב. לגדול התאים ב 37 מעלות צלזיוס עד המפגש מושגת הערה: לביצוע כתמים מערביים או ניסויים אחרים, ניתן לגדל תאים בצלחות תרבית תאי 10 סנטימטרים או מנות מיוחדות כנדרש בניסוי. </li></ol> 2. חמצן וגלוקוז קיפוח Reoxygenation במבחנהדגם הערה: הפרוטוקול הבא הותאם מאל Zulueta et. 1997; ג&#39;ו H et al. 2,012 8,9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במערכת תרבות תא היפוקסיה כדי לחקור את ההשפעות של של OGD-R על RBMECs ב( ראה איור 1). התקנה ולכייל את מערכת תרבית תאי היפוקסיה לפני תחילת הניסוי, על פי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות קאמריות ומחוברות (שלב 1.8) מחממת 37 ° C. החלף את המדיום השלם בשקופית הקאמרית עם deoxygenated, אין גלוקוז, בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) והניח בתא היפוקסיה עם 95%, N 2, 5% CO 2 עבור 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס, כדי לייצג מצב OGD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את התאים בחזרה לחממה עם 95% O 2, 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס ומסופק עם מדיום תא האנדותל טרי מוח חולדה מלא ודגירה עבור שעה 1 אחרת על 37 מעלות צלזיוס. הערה: שלב זה מייצג מצב reoxygenation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשקופיות קאמריות ללוקליזציה immunofluorescence ותיוג phalloidin rhodamine (ראה סעיף 3). </li></ol> 3. Immunofluorescence לוקליזציה של תיוג -actin ZO-1 ו- F שימוש Rhodamine Phalloidin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את השקופיות קאמריות המכילות monolayers RBMEC לתקשורת של Opti-ממ / סרום מופחת / 100 μl גם עבור שעה 1. שטוף את השקופיות קאמריות 3 פעמים בשל פוספט שנאגרו מלוח (PBS, pH 7.0-7.2) 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים באמצעות של paraformaldehyde 4% 100 μl בPBS (pH 7.0-7.2) במשך 15 דקות ולשטוף את השקופיות קאמריות לפי 3 יותר בPBS (pH 7.0-7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize התאים באמצעות של 0.5% Triton X-100 ב PBS 100 μl, (pH 7.0-7.2) לעוד 15 דקות. לחסום עם של 2% אלבומין בסרום שור (BSA) בPBS 100 μl לשעה. לאחר שלב זה או תאי כתם / תווית או לתקטין ZO-1 או זיונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לSTA immunofluorescenceining דגירה התאים עם נוגדן נגד ארנב עיקרי נגד ההסתדרות ציונית-1 ב 1: 150, שהוכן ב 2% BSA-PBS לO / N ב 4 מעלות צלזיוס. שוטפים את התאים 3 פעמים PBS, (pH 7.0-7.2). דגירה עם של isothiocyanate והעמסת (FITC) 100 μl -tagged נוגדנים משני נגד ארנב עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתיוג Rhodamine Phalloidin, הבאים חסימה, לחשוף את התאים לשל phalloidin rhodamine 100 μl ב01:50 דילול, שהוכן ב 2% BSA-PBS, במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים ממכתים immunofluorescence ותיוג rhodamine phalloidin ב PBS, (pH 7.0-7.2). הר התאים באמצעות תקשורת הרכבה המכילה מגיב אנטי לדעוך עם DAPI. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את התאים באמצעות עדשת טבילה במי 60 X ותאים נסרקים במטוס אופטי בודד תחת מיקרוסקופ confocal. </li></ol>

<ol><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycium+barbarum+polysaccharides+reduce+intestinal+ischemia%2Freperfusion+injuries+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats.</a> Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).</li>
<li>Kaur, C., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+in+hypoxic-ischemic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions.</a> Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).</li>
<li>Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%2C+reperfusion+injury%2C+and+hemorrhagic+transformation+in+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke.</a> Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).</li>
<li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+the+investigation+of+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental models for the investigation of brain ischemia.</a> Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).</li>
<li>Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+modulates+the+barrier+and+coagulant+function+of+cultured+bovineendothelium.+Increased+monolayer+permeability+and+induction+of+procoagulant+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties.</a> J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).</li>
<li>Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+generation+of+reactive+oxygen+species+in+endothelial+cellsexposed+to+anoxia-reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation.</a> Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baicalin+reduces+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+during+hypoxia+in+vitro+by+increasing+the+expression+of+tight+junction+proteins+in+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells.</a> J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).</li>
<li>Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+mechanisms+generate+oxygen+free+radicals+in+neurons+and+contribute+to+cell+death+during+anoxia+and+reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation.</a> J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).</li>
<li>Gundimeda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+polyphenols+precondition+against+cell+death+induced+by+oxygen-glucose+deprivation+via+stimulation+of+laminin+receptor%2C+generation+of+reactive+oxygen+species%2C+and+activation+of+protein+kinase+Cepsilon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon.</a> J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).</li>
<li>Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+in+cerebral+ischemia+for+developing+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics.</a> Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).</li>
<li>Alluri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species-Caspase-3+Relationship+in+Mediating+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cell+Hyperpermeability+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation.</a> Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).</li>
<li>Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+and+ROCK+signaling+in+VEGF-induced+microvascular+endothelial+hyperpermeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability.</a> Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP+actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin.</a> J Vis Exp. (57), (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

OGD-R כמודל במבחנה לפגיעה איסכמיה reperfusion כבר מבוסס היטב ללימוד נוירונים 10,11. ישנם גם מחקרים המראים את ההשפעה של OGD על תאי האנדותל מוח ושינויים בחדירות וTJ יושרה 9. עם זאת, המחקר שלנו מראה את ההשפעה של OGD כמו גם reoxygenation, אשר היא ייצוג קרוב של פגיעת reperfusion איסכמי בתנאי in vivo המתרחשים שבץ איסכמי הבא. תנאי חוסר חמצן-איסכמי ידועים לגרום לדלקת במערכת העצבים ...

איסכמיה reperfusion פציעה (IR) נמצאת להיות הסיבה השכיחה לסיבוכים שונים מתישים ומקרי מוות הקשורים לאירוע מוחי, אוטם שריר לב, טראומה, מחלת כלי דם היקפית ופגיעה מוחית טראומטית 1,2. פציעת IR בכלי מוח היא פגיעה משנית מוקדמת וגורמת לדלקת ובצקת 3. אחד הסיבוכים החמורים המתרחשים כתוצאה מחמצון ולחץ מטבולים הבאים דלקת הוא אובדן שיווי משקל homeostatic המוביל להיווצרות של רדיקלים חופשיים, שינויים במחסום דם-המוח (BBB) ​​צמתים הדוקים (TJS) וחדירות כלי דם 4,5. נכון לעכשיו, במודלי vivo משמשים כדי לחקור את ההשפעות של פגיעת IR על BBB כוללים עורקים התיכון ספיגה מוחין (MCAO), microembolism, ובעלי חיים מהונדסים או נוק אאוט. עם זאת, לכל אחד יש חסרונות ומגבלות שלה כפי שפורט על ידי Hossmann 6. מודל MCAO משמש ללמוד effecTS של מתח חיזור, שינויים בתקשורת junctional של BBB ויחסי הגומלין בין המוח ותאי חיסון. עם זאת, הם מציגים אתגרים טכניים שונים כגון צורך בנהלים מדויקים מייקר והקשיים בהם. Microembolism שובר באופן מיידי את BBB תוך שימוש בבעלי החיים מהונדסים או נוק אאוט ללמוד איסכמיה מוחית עשוי להיות אתגרים כמו השפעות גן תלוי מולקולריות על היווצרות אוטם, שינויים באנטומיה של כלי דם ומשקל גוף שונה 6. מכאן, במבחנה מודלים של איסכמיה שמצאו עניין גובר בתקופה האחרונה בעיקר בבגלל תחולתם בביצוע מחקרים מכניסטית לסמים. עם זאת, התוצאות של מחקרים במבחנה לא יכולות לייצג באופן מלא מחקר in vivo ויש לפרש בזהירות 6. פעולה נוגדת של ריכוזי חמצן נמוכים בmonolayers תא אנדותל וחדירות כלי דם הייתהלמד על ידי 7 Ogawa. תאי כלי דם במוח חולדה אנדותל (RBMECs) שמשו לפיתוח במבחנה BBB. טכניקת המחסור בחמצן גלוקוז וreoxygenation (OGD-R) הוצגה בפרוטוקול זה הותאמה ממחקרים על ידי אל Zulueta et וג&#39;ו ואח &#39;8,9. אנו נחשפים לתאי אנדותל מוח לOGD-R על ידי הצבת אותם בתא היפוקסיה / אנוקסיה המכיל 0% O 2, 5% CO 2 ו -95% N 2. תאים מאוחר יותר נבדקו לשינויים במבנה סיבי יושרה ולחץ TJ באמצעות לוקליזציה immunofluorescence ותיוג phalloidin rhodamine בהתאמה. מכתים immunofluorescence לoccludens-1 zonula (ZO-1) מבוצע כדי לקבוע שלמות TJ, כZO-1 הוא קרום פיגומים חשוב מחויב חלבון TJ. תיוג Rhodamine Phalloidin קובע אקטין פילמנטיות (-actin ו) בשלד תא התא והוא אינדיקציה ברורה של היווצרות מתח סיב אקטין בתאי אנדותל. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; מטרתה של שיטה זו היא לספק תובנה פיתוח OGD-R כבמבחנת מודל IR ללימוד שלמות BBB תא האנדותל TJ והיווצרות מתח סיב F- אקטין. התוצאות תספק מידע על גורלו של חלבון TJ, ZO-1 והיווצרות מתח סיב הבא OGD-R. הבנת יחסים אלה מספקת הזדמנות כדי לקבוע את המנגנונים מולקולריים שבבסיס שמופעלים הבאים OGD-R ולפתח אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות כדי לשפר את ההפרעה BBB לאחר טיפול OGD-R.

<table><tbody><tr><td>Proox דגם 110</td><td>Biospherix</td><td>דגם 110</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, ללא גלוקוז</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>רודמין פלואידין</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 ארנב נוגדן פוליקלונלי</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>617300</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab Tek II-CC 8&nbsp; סטרילי היטב, זכוכית&nbsp; שקופיות&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד ארנב מתויג FITC&nbsp;</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-2090</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>תרמו מדעי</td><td>SH 30028.03</td><td>ניתן להשתמש בכל PBS אחר זמין</td></tr></tbody></table>

חמצן גלוקוז קיפוח וreoxygenation כ<em&gt; במבחנה</em&gt; איסכמיה reperfusion פציעת דגם לחוסר תפקוד מחסום דם-המוח לומד

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

איסכמיה reperfusion פציעה (IR) ידועה לתרום באופן משמעותי לתחלואה ותמותה הקשורים בשבץ איסכמי. תאונות כלי דם במוח איסכמי מהוות 80% מכל מקרי השבץ. סיבה שכיחה לפגיעה IR היא הזרימה המהירה של נוזלים הבאים חסימה אקוטית / כרונית של דם, חומרים מזינים, חמצן לרקמה מפעילה ההיווצרות של רדיקלים חופשיים. שבץ איסכמי ואחריו מחסום דם-מוח בתפקוד (BBB) ​​ובצקת מוחית vasogenic. מבחינה מבנית, צמתים הדוקים (TJS) בין תאי האנדותל ממלאים תפקיד חשוב בשמירה על שלמות מחסום דם-המוח (BBB). פציעת IR היא פגיעה משנית מוקדמת שהובילה לתגובה הלא ספציפית, דלקתית. חמצוני ולחץ מטבולים הבאים דלקת גורם לניזק מוחי המשני כוללים חדירות BBB ושיבוש צומת הדוקה יושר (TJ). הפרוטוקול שלנו מציג במבחנה &lt;/ Em&gt; דוגמא למחסור בחמצן גלוקוז וreoxygenation (OGD-R) בתא האנדותל מוח החולדה שלמות TJ והיווצרות מתח סיב. נכון לעכשיו, כמה ניסויים במודלי vivo משמשים כדי לחקור את ההשפעות של פגיעת IR; עם זאת יש להם כמה מגבלות, כגון אתגרים הטכניים בביצוע ניתוחים, השפעות מולקולריות תלויות גן וקושי בלימוד יחסים מכניסטית. עם זאת, במבחנה מודלים עשויים לסייע בהתגברות על מגבלות רבות של אלה. הפרוטוקול שהוצג יכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים מולקולריים השונים ומערכות יחסים מכניסטית לספק אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות. עם זאת, התוצאות של מחקרים במבחנה עשויות להיות שונות מרגילות במחקרי vivo ויש לפרש בזהירות.

תאים בתרבית בשקופיות Precoated פיברונקטין Nunc השני קאמריות היו נתונים לOGD-R על ידי הנחת בתא 110 מודל Biospherix ProOx. לאחר חשיפת תאים לOGD-R, הם עובדו לצביעת junctional ZO-1 באמצעות טכניקת immunofluorescence כפי שמוצג באיור 2 והרכבת cytoskeletal מצביע היווצרות מתח סיב F- אקטין באמצעות תווית כתם phalloidin rhodamine כפי שמוצגים באיור 3. תאי בקרה שהיו לא נתון לOGD-R הראה שלמות junctional מתמשכת תוך תאי האנדותל נתון OGD-R הראו צמתים רציפים, המצביע...

פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IR) קשורה לשיעור גבוה של תחלואה ותמותה. מטרת המודל במבחנה של מחסור בחמצן-גלוקוז וחמצון מחדש (OGD-R) המתואר כאן היא להעריך את ההשפעות של פגיעה באיסכמיה על מגוון תאים, במיוחד בתאי אנדותל של מחסום דם-מוח (BBB).

חמצן גלוקוז קיפוח וReoxygenation כ<em&gt; במבחנה</em&gt; איסכמיה reperfusion פציעת דגם לחוסר תפקוד מחסום דם-המוח לומד

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים את תפקידו של מחסור בחמצן ובגלוקוז כמודל in vitro לפגיעת איסכמיה-רפרפוזיה (ischemia reperfusion injury) לצורך חקר תפקוד לקוי של מחסום הדם-מוח. זאת מושג על ידי חשיפת תאי אנדותל של המוח הגדלים בשקופיות תאים (chamber slides) למחסור בחמצן ובגלוקוז, באמצעות החלפת המצע במצע נטול חמצן וגלוקוז וחשיפתם לסביבת תא היפוקסיה למשך שעתיים; לאחר מכן, התאים מוחזרים לתנאים רגילים למשך שעה כדי להשיג רה-חמצון (reoxygenation). לאחר עיבוד התאים, מבוצע צביעה אימונופלואורסצנטית של Zola Occludin one וסימון ב-Rod Domine Phin של filamentous actin.לאחר מכן מדמיינים את התאים באמצעות עדשת טבילה במים 60 x במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לקבל חתכים אופטיים בודדים לצורך ניתוח. את הפרוצדורה תדגים hem nega, סטודנטית לתואר שני במעבדתי. כדי להתחיל בפרוצדורה, הכינו תרביות ראשוניות של RBM eecs שהופקו מחולדות spra dolly בוגרות. ניתן להשתמש גם בשורות תאים הזמינות מסחרית.טפחו את ה-R BM EECS בצלחות של 100 סנטימטר מצופות בפיברונקטין, גדלו אותם במצע גידול לתאי אנדותל של מוח חולדה, והחליפו את המצע מדי יומיים. גדלו את התאים עד שיגיעו ל-80 עד 90% התלכדות (confluency). לאחר מכן, שטפו בעדינות את התאים עם חמישה מיליליטר של PBS.בשלב הבא, נתק את התאים מהפלטה על ידי הוספה ראשונית של 1 mL של תמיסת 0.25% trypsin EDTA חמה וסיבוב של הפלטה. לאחר מכן, דגרא את התאים למשך שתיים עד חמש דקות. התק תוך כדי להגביר את ניתוק התאים, ובדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהם נתקו.כדי להפסיק את תהליך הטריפסינציה, הוסיפו חמישה מיליליטר של מצע גידול מלא, לאחר מכן שאבו את המצע עם התאים שהסתרו ואספו אותו לשפופרת צנטריפוגה של 15 מיליליטר. צנטריפגו את המצע עם התאים ב-220 G למשך חמש דקות, שאבו והשליכו את עלווה. לאחר מכן, השביו את משקע התאים בשלושה עד חמישה מיליליטר של מצע גידול טרי על ידי העברה עדינה של התאים דרך פיפטה של חמישה מיליליטר.כעת ספרו את התאים והעבירו 20,000 עד 30,000 תאים לכל באער של למינורת שמונה באערים מצופה בפיברין ואקטין. כמובן, ניתן לגדלם באופן שונה עבור יישומים אחרים. לאחר מכן, דגרו את למינורת הבאערים עד שהתאים יהיו קונפלואנטים (צפופים) כהכנה.הקימו וכיילו את מערכת תרביות התאים להיפוקסיה. בהתאם להוראות היצרן, סביבת התא צריכה להיות 95% חנקן, 5% פחמן דו-חמצני, ובטמפרטורה של 37 °C. כעת, בצעו דה-אוקסיגנציה ל-DMEM נטול גלוקוז על ידי הצבתו בתא ההיפוקסיה למשך ארבע עד שש שעות.התחילו להעביד את התאים על ידי החלפת המצע שלהם ב-DMEM נטול גלוקוז ונטול חמצן, ולאחר מכן העבירו את התאים לתא היפוקסיה למשך שעתיים. לאחר שעתיים, החזירו את התאים למצע מלא עבור תאי אנדותל של מוח חולדה. לאחר מכן, חמצנו מחדש את התאים על ידי החזרתם לתנאים רגילים למשך שעה.התחילו בחשיפת כל באער של שכבות מונושכבה של R-B-M-E-C ל-100 עד 200 µL של מצע סרום מופחת אופטימלי והמשיכו בדגירה למשך שעה. לאחר מכן, שטפו את שקופיות התא (chamber slides) שלוש פעמים באמצעות 100 עד 200 µL של PBS לכל באער בכל שטיפה. קבעו את התאים עם 4% paraldehyde ב-PBS ודגרו את השקופיות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS כפי שבוצע קודם לכן.כעת בצעו פרמיליזציה של התאים על ידי הוספת 100 עד 200 µL של 0.5% Triton X 100 ב-PBS לכל באער, והדגירו את הפלטה למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. לאחר פרמיליזציית התאים, הוסיפו את תמיסת החסימה והניחו לה להשפיע על התאים במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצעו אימונופלואורסצנציה לחלבון ZO one או סמנו F actin.כדי לבצע אימונופלורסצנציה של התאים עבור ZO one, דגרו אותם עם הנוגדן הראשוני למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, שטפו את התאים שלוש פעמים ב-PBS, בדומה לשלב הסרת המקבע. לאחר מכן, דגרו את התאים ב-100 עד 200 µL של נוגדן משני אנטי-ארנב המסומן ב-fitzy למשך שעה בטמפרטורת החדר, כדי לסמן את התאים ב-r Domine Phin.לאחר יישום תמיסת החסימה למשך שעה, חשוף את התאים ל-100 עד 200 µL של R domine Phin בדילול של 1:50 ב-2% B-S-A-P-B-S למשך 20 דקות. לאחר הדגירה עם הנוגדן המשני או עם R domine Phin, שטוף את התאים עם PBS 3 פעמים נוספות כפי שבוצע קודם לכן. לאחר מכן, הסר את התאים מהתאים על ידי קילוף הגומי.המשך בהכנת התכריכים באמצעות מדיום המכיל חומר למניעת דהייה (anti fade) וביצוע דגימה בתמונת DPI. דמיין את התאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי במישור בודד עם עדשה פי 60. התאים גודלו בתאית מצופה בפיברונקטין.השקפים הוכפפו ל-OGDR באמצעות הנחתם בתא היפוקסיה. כפי שתואר. לאחר מכן, התאים עובדו לבדיקת ZO one junctional.צביעה של תאי ביקורת הראתה שלמות מתמשכת של הצמדים, בעוד שבתאים שנשללו מהם חמצן וגלוקוז הצמדים היו מקוטעים. בנוסף, נצפו שינויים בשלד התא באמצעות צביעה של F actin. תאי ביקורת לא הראו או הראו מינימום של F ACT ביצירת סיבי מאמץ, בעוד שבתאים שהוכפפו ל-OGDR נצפתה עלייה ביצירת סיבי מאמץ.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע הפרעה באספקת חמצן וגלוקוז (Oxygen-Glucose Deprivation) וחמצון מחדש (Reoxygenation). ניתן להשתמש בשיטה זו כמודל לפגיעת איסכמיה-רפרפוזיה (Ischemia Reperfusion Injury) לצורך חקר מחסום הדם-מוח, שלמות הצומת המהודקת (Tight Junction) ויצירת סיבים כתוצאה מסטרס.

oxygen-glucose-deprivation-reoxygenation-as-an-vitro-ischemia

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מקור: Alluri, H., et.al. מחסור בחמצן-גלוקוז וחמצון מחדש כמודל  במבחנה פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה לחקר תפקוד לקוי של מחסום דם-מוח. J. Vis. Exp. (2015). הסרטון מדגים את ההשפעה של מחסור בחמצן-גלוקוז וחמצון מחדש לאחר מכן על תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח של חולדות (RBMECs) על ידי הדמיית מצבים היפוקסיים וחסרי חומרים מזינים. תנאים אלה גורמים לדלדול ATP, עלייה בסידן תוך תאי ויצירת מיני חמצן תגובתיים (ROS), אשר מפרקים חלבוני צומת תאים וגורמים להיווצרות סיבי עקה, ובכך מחלישים אינטראקציות תא-תא.

השפעת מחסור בחמצן-גלוקוז וחמצון מחדש על אינטראקציות תא-תא

חסימת עורק תרדמה דו צדדית בשילוב עם ירידה בלחץ דם מערכתי מייצרת איסכמיה המוחית העולמית בחולדה, וכתוצאה מכך לנזק ליפוקמפוס בחומרה לשחזור. נושאי בעלי החיים הם לקויים עם דפוסים צפויים של נזק מוחי, הם להתאושש expediently, ושיעורי תמותה הם נמוכים יחסית.

ספיגה של 2 כלי השיט / תת לחץ דם: מודל עכברוש של איסכמיה המוח הגלובלית

במבחנה מודלים פגיעה מוחית טראומתיים מפותחים להתרבות בעיוות מוח vivo. פגיעה הנגרמת על מתיחה כבר מועסק להאסטרוציטים, נוירונים, תאי גלייה, אבי העורקים, ותאי האנדותל במוח. עם זאת, המערכת שלנו משתמשת במחסום דם מוח (BBB) ​​דגם בעל תכונות שמהוות מודל לגיטימי של BBB להקים במודל TBI מבחנה.

למתוח בתאי אנדותל כלי הדם במוח (cEND) כ<em&gt; במבחנה</em&gt; פגיעה מוחי טראומטי דגם של מחסום דם המוח

פרוטוקול לתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס, המאפשר לשחזר היבטים רבים של פגיעה המוחית איסכמי, מוצג. על ידי לימוד לשינויים בתאי עצב שינויים של neurovasculature בנוסף, פרוטוקול זה הוא כלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה.

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

פרוטוקול זה מתאר התניה מוקדמת היפוקסית חוזרת ונשנית, או חשיפות קצרות להיפוקסיה מערכתית המפחיתות את נפחי האוטם והפרעה במחסום הדם-מוח בעקבות חסימה חולפת של עורק המוח האמצעי בעכברים. הוא גם מפרט כימות כפול של נפח האוטם והפרעה במחסום הדם-מוח לאחר שבץ מוחי כדי להעריך את היעילות של הגנה נוירו-וסקולרית.

כימות של הגנת עצבים וכלי דם בעקבות חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד וחלוף התיכון מוחין של עכברים

שבץ איסכמי הוא אירוע מורכב שבו התרומה ספציפי של האסטרוציטים לאזור במוח המושפעים נחשפים גלוקוז חוסר חמצן (OGD) הוא קשה ללמוד. מאמר זה מציג מתודולוגיה להשיג האסטרוציטים מבודד וללמוד שלהם תגובתיות והתפשטות בתנאים OGD.

ניטור אסטרוציט תגובתיות התפשטות במבחנה בתנאים כמו איסכמי

המטרה של הפרוטוקול היא להציג את הליך בלתי אופטימליים להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי הראשי (pBECs). המודל מראה הפארמצבטית גבוהה, אטימות גבוהה, מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת גילוי סמים.

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

המטרה הכוללת של נוהל זה היא לספק טכניקה מאוד לשחזור להערכת ויוו של ערעור מחסום הדם - מוח במודלים עכברוש של שבץ איסכמי.

הערכה In Vivo של מחסום הדם - מוח שיבוש במודל של עכברים של שבץ איסכמי

כאן, אנו מציגים גישה פשוטה באמצעות מדיה תרבותית ספציפית המאפשרת הקמת תרבויות מועשרות בנוירון ואסטרוקייט, או תרבויות נוירון-גליה מקליפת המוח העוברית, עם תשואה גבוהה ושחזור.

מודל תרבות תא לחקר התפקיד של אינטראקציות נוירון-גליה באיסכמיה

במאמר זה נתאר את השיטה לביסוס מודל של תרבית תאים משולשת של מחסום הדם-מוח המבוסס על תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח האנושי, אסטרוציטים ופריציטים. מודל רב-תאי זה מתאים למחקרים על תפקוד לקוי של יחידות נוירו-וסקולריות במהלך שבץ איסכמי במבחנה או לסינון מועמדים לתרופות.

מודל תלת-תאי ראשוני של מחסום הדם-מוח האנושי לחקר שבץ איסכמי במבחנה

למחסום הדם-מוח (BBB) יש תפקיד מכריע בשמירה על סביבת מוח יציבה ובריאה. תפקוד לקוי של BBB קשור למחלות נוירולוגיות רבות. פיתחנו מודל תלת-ממדי, הנגזר מתאי גזע של BBB כדי לחקור פתולוגיה של כלי דם במוח, שלמות BBB, וכיצד BBB משתנה על ידי גנטיקה ומחלות.

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

למדו את מודל OGD-R לחקר פציעת איסכמיה-ריפרפוזיה במעטפת הדם-מוח. השיטה משתמשת בתרביות תאי אנדותל מוחיים של עכברושים וצביעה אימונופלואורסצנטית לניתוח מבני.

חמצן גלוקוז קיפוח וReoxygenation כ

גלה סרטונים נוספים