משטח משופר ראמאן ספקטרוסקופיה איתור של מולקולות ביולוגיות באמצעות EBL מצעי Nanostructured המפוברק

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לייצר ולאפיין מערכות ננו-ביולוגיות מצומדות המממשקות מצעים ננו-מובנים מוצקים עם ביומולקולות משותקות. זה מושג על ידי שימוש בליתוגרפיה של קרן אלקטרונים ברזולוציה גבוהה במיוחד או EBL כדי להשיג מערכים של ננו-מבנים מתכתיים זעירים על תומכי סיליקה התמזגו. כשלב שני, המצעים מונחים בתמיסה וביו-מולקולות משותקות על פני השטח שלהן, ומייצרות את הממשקים הננו-ביולוגיים.

בשלב הבא נעשה שימוש בספקטרוסקופיה משופרת של ראמן או SIRS על מנת לחקור את המולקולות הביולוגיות בממשקים. ספקטרום ה-Sir המתקבל מציג את האופייני של מצב ראמן למולקולות מסוימות עם עוצמות התלויות מאוד בעיצוב המצע. היתרון העיקרי של הגישה שלנו על פני טכניקות קיימות כמו ספקטרוסקופיה אינפרא אדום הוא שניתן לשפר מאוד את הרגישות עקב פלזמה ותהודה בתוך ננו-מבנים מתכתיים.

הגישה שלנו יוצרת משטחים סלקטיביים ביותר שניתן לשלוט בהם בקלות באמצעות שילוב של פונקציונליזציה מולקולרית וליתוגרפיה של אלומת אלקטרונים. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחומים מרובים, החל ממחקר מחקר בביולוגיה מבנית או שירות המגויס על ידי פולימרים ועד לפיתוח מכשירים שונים הכוללים ממשקים ננו-ביולוגיים. שיטות אלה יכולות לספק במדע את התכונות המבניות של ביומולקולות עם השלכות המשתרעות על אבחון רפואי או זיהוי סביבתי.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יכולים להיאבק מכיוון שהיא כרוכה בהיבטים של ייצור ננו, פונקציונליזציה של פני השטח, ביוכימיה וספקטרוסקופיה, שבאופן מסורתי לא היו קשורים כדי להתחיל בציפוי הסיבוב של הפולימתיל-מתאקרילט או PMMA, להתנגד ולהוליך שכבות על המצעים. כדי להשיג זאת, השתמש בספינר רקיק עם צ'אק ואקום והנח את הדגימות בנפרד במרכז על הצ'אק. הנח טיפה אחת של התנגדות PMMA במרכז הדגימות באמצעות פיפטת זכוכית.

לאחר מכן סובב ב-3, 500 סל"ד למשך 60 שניות עם זמן תאוצה של שתי שניות. לאחר מכן, אופים את המצעים בחום של 180 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש דקות לאחר אפיית המצעים, מצננים את הדגימות לטמפרטורת החדר כשהמצעים מקוררים ומחזירים לצ'אק הספינר. מורחים טיפת פולימר מוליך על המצע.

סובב את המצע למשך 40 שניות ב-3000 סל"ד עם רמפה של שתי שניות לאחר הסיבוב. אופים את הדגימות בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת לאחר ביצוע ליתוגרפיה של קרן אלקטרונים או חשיפה ל-EBL כמתואר בפרוטוקול הטקסט, מכינים עם המים המיוננים להסרת הפולימר המוליך. לאחר מכן הכינו שנייה עם תערובת מפתחים וערבבו במשך חמש דקות, קבעו את טמפרטורת החדר.

לבסוף, הכינו איזופרופנול בכוס שלישית כחומר שטיפה בעזרת פינצטה. מניחים את הדגימות במים למשך שלוש שניות כדי להסיר את סרט הפולימר המוליך. לאחר מכן הכניסו את הדגימה למפתח והזיזו את הפינצטה לאט למעלה ולמטה למשך 20 שניות, העבירו מיד את המצעים לאיזופרופנול ושטפו עוד 10 שניות לפני ייבוש הדגימה בחנקן, טענו את הדגימות הפוכות למערכת מאייד קרן האלקטרונים כדי לאפשר למתכת המאודה להיות מופקדת על הפנים הקדמיות של הדגימות.

הפקידו שכבת זהב בעובי 10 ננומטר על הדגימות לעיצובים 1 ו-3 ושכבת כסף בעובי 10 ננומטר לעיצוב. שניים בקצב של כ-0.1 ננומטר לשנייה. לאחר מכן מלאו מערכת סוניקציה לגובה המומלץ במים ומלאו נפרדת באצטון.

מניחים דגימה עם הפנים כלפי מעלה בתחתית הכוס ומניחים לדגימה להשרות במשך 10 דקות תוך החזקת הכוס. הכניסו אותו לאמבט המים ואפשרו לגובה האצטון להתאים לגובה המים. ואז הפעל את מערכת הסוניקציה.

אפשר לסוניקציה להתרחש עד 60 שניות. כדי להכין תחילה דגימות עיצוב, הכינו תמיסה של מילי-מולרית אחת של MUA ואתנול בטמפרטורת החדר וסוניקט למשך 10 דקות. טבלו את המצע הנכון של ננו מובנה בתמיסה של MUA למשך 48 שעות.

לאחר מכן שוטפים את הדגימה באתנול שלוש פעמים ומייבשים במשך חמש דקות. הגדר את טמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו תמיסה של 75 מילי-מולרית של EDC ומים מזוקקים.

הכינו גם תמיסה של 15 מילי-מולרית של NHS במים מזוקקים באמצעות משקע מיקרו פיפטה, 100 מיקרוליטר של NHS על הזהב שעל המצע, והוסיפו מיד 100 מיקרוליטר של EDC על אותו אזור. דגירה למשך דקה אחת כדי להפעיל את השכבה החד-שכבתית בהרכבה עצמית של MUA. לאחר מכן הניחו טיפת חלבון של 100 מיקרוליטר, תמיסה על אותו אזור של המצע.

הנח את הדגימה בתא אחד של צלחת פטרי עם מיליליטר אחד של מים מזוקקים בתא אחר. אוטמים את צלחת הפטרי במכסה ומאחסנים את הדגימה למשך 24 שעות בחום של חמש מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את הדגימה במים מזוקקים שלוש פעמים על ידי רציפות הדגימות בכוסות נפרדות למשך 20 שניות בכל, אל תתנו לדגימות להתייבש לאחר השטיפה או במהלך השטיפה לעיצוב שתי דגימות.

הכן תמיסה של 0.9 מילי-מולרית של חלבון קושר גלוקוז או GBP במאגר אשלגן פוספט. הכינו גם תמיסה של 100 מילי-מולרית של גלוקוז DG במאגר. לאחר מכן מערבבים 30 מיקרוליטר מתמיסת הגלוקוז D ו-30 מיקרוליטר מתמיסת ה-GBP.

בעזרת מיכל מיקרו צינור פלסטיק של מיליליטר אחד ומיקרו פיפטה דגרו למשך 30 דקות, ולאחר מכן הפקידו 20 מיקרוליטר מתמיסת ה-GBP נטולת הליגנד ו-20 מיקרוליטר מתמיסת ה-GBP הקשורה לליגנד על המצעים המוכנים. בעזרת מיקרו פיפטה אחסנו את הדגימות בחמש מעלות צלזיוס למשך 24 שעות בצלחת פטרי עם מכסה אטום. שוטפים את הדגימות שלוש פעמים בתמיסת חיץ אשלגן פוספט בטמפרטורת החדר להכנה.

תכנן שלוש דגימות לדלל את תמיסת הקושר לדופמין או DBA לריכוז של מיקרו-טוחנת אחת. בעזרת מאגר tris EDTA עם pH סופי של 7.4, הכינו תמיסת דופמין לריכוז של חמישה מיקרומולר על ידי מדידת אבקת הדופמין באיזון אנליטי וערבוב שלה במי מלח עם פוספט או PBS עם חרוז ערבוב למשך חמש דקות. לאחר מכן הפקידו טיפה של 20 מיקרוליטר של תמיסת ה-DBA על פני כל מצע, ותנו לדגימה לשבת במשך שעה בטמפרטורת החדר עם כיסוי מעל צלחת הפטרי.

לאחר שטיפת הדגימות שלוש פעמים במאגר אשלגן פוספט, הנח את הדגימות זקוף על גבי מגבון בדרגת חדר נקי לייבוש הצד האחורי תוך שמירה על סרט בצד הקדמי של המצע. הנח דגימה בצד כפקד. לאחר מכן, הניחו טיפה של חמישה מיקרוליטר מתמיסת הדופמין על פני ה-PBS הקיים.

זרוק על הדוגמאות הנותרות. דגרו את הדגימות למשך 10 דקות לפני שטיפת הדגימות בתמיסת חיץ אשלגן פוספט שלוש פעמים. לבצע ספקטרוסקופיה של ראמן.

הנח כל דגימה בתא עמיד למים כדי למנוע אידוי על ידי חשיפה ללייזר. מלאו מזרק פלסטיק בשומן ואקום גבוה אינרטי כימית. לאחר מכן הניחו את הדגימות על שקופיות זכוכית והוציאו כמה מילימטרים של שומן המקיף את הדגימות מבלי לגעת בדגימות.

הנח החלקה של כיסוי מיקרוסקופ על גבי המצעים. לחץ בעדינות כלפי מטה כדי ליצור אטימה, ויוצר ממשק נוזלי דק בין המצעים להחלקות הכיסוי מבלי לאפשר למאגר לבוא במגע עם שומן הוואקום. באמצעות מערכת מיקרוסקופ ראמאן אופטית, השג מיקוד על פני השטח של אזור דפוס הננו המתכתי שיש לדגום מבלי להפעיל את הלייזר.

בצע דגימת רמאן כמתואר בפרוטוקול הטקסט המוצג. להלן מערכי הנקודות של דפוס הננו של ניקל זהב וכסף על סיליקה התמזגה. השימוש בליתוגרפיה של קרן אלקטרונים או EBL מאפשר מיקום וממד מעולים.

גודל נקודת הבקרה ורוחב הפער נשלטים על ידי חשיפת EBL. מערכי משושה מינון של קצה זהב של ניקל כסף מוצגים כאן. התנהגות גרעין של שכבות מתכת דקות מאוד מביאה למבנים לא רציפים.

הנה הספקטרום הסדרתי של חלבון משותק מצע A בתכנון: עוצמת אות אחת ממערך אחד חזקה בהרבה מאשר ממערך שני. האות מהמערך השלישי היה חלש מאוד. מרווח פערים הוא בבירור פרמטר קריטי לניתוק פלזמה ושיפור פני השטח של פיזור הראמן המוצג.

להלן ספקטרום של חלבון קושר גלוקוז המציג את ההשפעות של עיצובי סובסטרט שונים במצב חופשי ליגנד וקשור ליגנד. לבסוף, ספקטרום s של אפטמר קושר דופמין מוצג עבור מולקולות חופשיות מליגנד וקשורות ליגנד. ספקטרום של אבקת דופמין מוצג לעיון.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב להימנע מזיהום המצעים. מכיוון שטכניקת ספקטרוסקופיה רגישה מאוד ואתה יכול לקבל קריאות שגויות שימוש בהליך זה. ניתן לזהות עיצובים אופטימליים של מצע מקור עבור אנליטים ספציפיים.

לאחר מכן ניתן לבצע שיטות nphy אחרות כמו phy שאינו מודפס כדי לשפר את יכולת ההרחבה של ייצור המצע לאחר פיתוחו. טכניקה זו סייעה לחוקרים בתחום הביוכימיה והחישה הביולוגית לזהות מולקולות ביולוגיות ללא משטחים מסוימים בכמויות קטנות מאוד תוך שמירה על תמיסה. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לשלוט בגודל ננו-מבנה מתכת ובתכונות הסרט באמצעות טכניקות ייצור וכיצד לנצל אסטרטגיות זיהוי ביו-מולקולריות שונות כדי להתמקד באנליטים שונים.