סביבת Microfluidic מבוקרת לדינמית חקירה של צבירת תאי דם האדום

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכמת באופן ישיר אגרגטים של תאי דם אדומים במיקרוסירקולציה, באופן דינמי ותחת קצבי גזירה (shear rates) קבועים ומבוקרים. דבר זה מושג תחילה על ידי הזרקה של תמיסות תאי דם אדומים לתוך מיקרו-תעלה בצורת Y כפול עם תמיסת פוספט בופר סליין (PBS), ובכך נוצר גזירה קבועה בשכבת הדם. השלב השני הוא ויזואליזציה והקלטה של הזרימה באמצעות מצלמה במהירות גבוהה.

לאחר מכן, השתמשו בטכניקות עיבוד תמונה כדי לעבד את ההקלטה ולהשיג גודל ממוצע של הצברים ואת התפלגות גודל הצברים במיקרו-תעלה. השלב הסופי הוא קביעת מהירות הדם על ידי מעקב אחר התזוזה של חלקיקים פלואורסצנטיים שהוזרקו למיקרו-תעלה בין שני פריימים עוקבים. לבסוף, קצב הגזירה במיקרו-תעלה מחושב על סמך מהירות הדם ועובי שכבת הדם, כדי לקשר בין גדלי הצברים לבין קצב הגזירה המקומי התואם.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטת העברת האור, הוא שצבירי תאי הדם האדומים מנותחים באופן דינמי בזרימה מיקרוסקופית של שכבות, בניגוד לניתוח סטטיסטי בטכניקות אחרים. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההמוראולוגיה, כגון הבנת התנאים ליצירת צבירי תאי דם אדומים ובחינת ההתנהגות הראולוגית של הדם במיקרו-סירקולציה. כדי להתחיל, ייצרו מיקרו-ערוצים ברוחב 120 microns, גובה 60 microns ואורך של שבעה מילימטרים, בהתאם לשיטות פוטוליתוגרפיה סטנדרטיות.

בשלב הבא, אספו תאי דם מתורמים בריאים והכינו תרחיפי כדוריות דם אדומות עם רמות המטוקריט של 5%, 10% ו-15% כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף; ערבבו מיליליטר אחד מכל תרחיף של כדוריות דם אדומות עם 60 µL של תמיסה בריכוז 1% המכילה חלקיקי סמן פלואורסצנטיים. נערעו בעדינות את המבחנה כדי לערבב את התמיסה. כמו כן, ערבבו את אותו נפח של חלקיקי סמן עם מיליליטר אחד של PBS ב-pH של 7.4.

מלא מזרק זכוכית של 25 µL בתמיסת הסמן המכילה תאי דם אדומים, ומלא מזרק זכוכית של 100 µL. כאשר תמיסת הסמן ב-PBS, ודא שאין בועות במערכת. לאחר מכן, הנח את המיקרו-תעלה על במה של מיקרוסקופ הפוך המחוברת למצלמה במהירות גבוהה המסוגלת להקליט 18 פריימים לשנייה או יותר, ולמערכת microparticle image velocimetry.

חברו כל מזרק באמצעות צינורית לאחד מפתחי הכניסה של התעלה המיקרופלואידית, ולאחר מכן טענו אותם לתוך התוכן של אותה משאבת מזרקים. תכנתו את משאבת המזרקים להזרים את המזרק של 25 µL בקצב של 2 µL לשעה. פעולה זו תזרים גם את המזרק של 100 µL בקצב הגבוה פי ארבעה, בשל ההבדל בגדלים ביניהם.

שנו את קצב הזרימה בין הניסויים כדי לבחון קצבי גזירה שונים. השתמשו בסרגל כיול כאשר עדשת ה-20x מותקנת כדי לכייל את המצלמה המהירה. לאחר מכן, הפעילו את המשאבה כדי להתחיל בהזרמת שני התמיסות אל תוך המיקרו-תעלה.

קבעו חשיפה אופטימלית של המצלמה וזמן הדשייה להדמיה ברורה של הצברים. חשוב להמתין עד שהזרימה תגיע למצב יציב לפני ביצוע מדידות כלשהן.

כאשר הושג מצב יציב (steady state), בתוך שלוש עד חמש דקות, מלאו מחדש את המזרק כדי להזרים את התערובת ולשמור על תאי הדם האדומים בסספנסיה. ברגע שהושגה זרימה במצב יציב, התחילו להקליט את תנועת תאי הדם האדומים.

הקליטו את הזרימה למשך שבע שניות. באמצעות תוכנה המסוגלת לעיבוד תמונות, שפרו את הניגודיות של כל תמונת גווני האפור שצולמה באמצעות שיטת השוואת היסטוגרמות (histogram equalizer). לאחר מכן, המירו את תמונות גווני האפור לתמונות בינאריות.

קבעו בזהירות את ערך הסף על ידי בדיקת מספר ערכים ובחירת הערך שבו כל הצבירים מזוהים כראוי. במידת הצורך, מלאו את החללים המתאימים לפערים בתוך צביר אחד. לאחר מכן, זהו את התאים על ידי קביעת פיקסלים לבנים שכנים בתמונה הבינארית, כך שתאים סמוכים ייחשבו כצבירים.

סמנו את מקבצי תאי הדם האדומים השונים שזוהו, ולאחר מכן המירו את התמונה הבינארית לתמונת RGB (אדום, ירוק, כחול) לצורך ויזואליזציה משופרת. לבסוף, הניחו את תמונת ה-RGB על גבי התמונה המקורית. כדי לאמת את יעילות עיבוד התמונה, חשבו את השטח של כל מקבץ שזוהה בפריים על סמך מספר הפיקסלים שזוהו.

עבדו את כל הפריימים באופן דומה. לאחר מכן, חשבו את ממוצע גדלי הצברים שזוהו בכל פריים, ואחר כך את הממוצע של כל הפריימים. כדי לקבל את גודל הצבר הממוצע עבור כל הקלטה של תרחיפי כדוריות הדם האדומות, המירו את התוצאות למיקרומטרים רבועים באמצעות תמונת סרגל המדידה.

לאחר מכן, חשבו את השטח של תא דם אדום אחד כדי לקבוע נציג. העריכו את מספר תאי הדם האדומים בתוך כל צביר שזוהה לאחר רכישת הנתונים. בעזרת המצלמה המהירה, עברו למצלמה בעלת הפולסים הכפולים המשמשת את מערכת ה-microparticle image velocimetry.

השתמשו בתוכנת דימות כזו המוצגת כאן לצורך רכישת תמונות של הזרימה ועיבוד התמונות לקביעת שדה המהירות. הקפידו להרכיב משקפי מגן ולאחר מכן הדליקו את מערכת הלייזר ואת המצלמה. הניחו מיקרומטר מתחת למיקרוסקופ והשתמשו בתמונה שהתקבלה כדי לכייל את המערכת.

לאחר מכן, התחילו את זרימת הנוזל והדמינו את החלקיקים בשני הנוזלים. אתרו את המישור המרכזי של המיקרו-תעלה על ידי התמקדות בחלקיקים המהירים והבהירים ביותר בזרימה. לאחר מכן, הגדירו את מרווח הזמן בין הפריימים לכ-2 מילישניות, כך שהחלקיקים המהירים ביותר יזוזו בין 5 ל-10 פיקסלים בין שתי התמונות, והתחילו להקליט את הזרימה. הגדירו את התוכנה לרכישת 100 זוגות תמונות עבור כל סוגי תרחיפי כדוריות הדם האדומות ועבור שיעורי גזירה שונים.

לאחר עיבוד מקדים של התמונות, בחרו את הגודל והצורה של חלון המתאם (correlation window), וכן את אחוז החפיפה בין התמונות. הציגו את התוצאות כשדה מהירות ממוצע שחושב מ-100 זוגות תמונות, וכן את שגיאת השורש הממוצעת של הריבועים (root mean square error) במהירות.

כבה את המצלמה הלייזרית ואת המחשב. לאחר ביצוע כל המדידות ועיבוד התמונה, חשב את קצב הגזירה (sheer rate) על ידי זיהוי והערכה ראשונית של עובי הדם בערוץ המיקרו על בסיס ההקלטה של המצלמה המהירה. לצורך כך, בצע ממוצע של כל הפריימים בהקלטה הספציפית כדי לקבל תמונת רקע של הווידאו.

לבסוף, הגדירו את שכבת הדם על ידי בדיקה חזותית של התמונה הממוצעת של כל הפריימים וזיהוי ידני של קצה שכבת הדם. לאחר מכן, השגיאו ידנית את ערך המהירות עבור עובי שכבת הדם המתאימה מתוך פרופיל המהירות שהופק, וחשבו את קצב הגזירה על ידי חלוקת ערך המהירות בעובי שכבת הדם. העב이는 המוצג כאן מייצג את התנועות נטו של ארבעה מקבצי תאי דם אדומים שזוהו בשלושה פריימים רצופים.

צבירים גדולים של יותר מ-30 תאים מוצגים בצבע אדום. צבירים בינוניים של בין תשעה ל-30 תאים מוצגים בצבע ירוק, וצבירים קטנים של פחות מתשעה תאים מוצגים בצבע כחול. מהירותו של צביר משתנה בהתאם למיקומו במיקרו-תעלה המוצגת.

להלן פרופילי המהירות של תאי דם אדומים התלויים בהמטוקריט של 5%, המטוקריט של 10% והמטוקריט של 15% בקצב זרימה של 10 µL לשעה. ניתן לראות כי המהירות שואפת לאפס בשני הקצוות כמצופה, ונקודת ההשכלה בין שני זרמי הזרימה משתנה מעט בין רמות ההמטוקריט; ככל שקצב הגזירה הכולל עולה, גודל האגרגטים בכל רמת המטוקריט יורד. זאת מכיוון שכוח הגזירה במיקרו-תעלה עולה על כוח האגרגציה, מה שגורם לתאי הדם האדומים להתפרק.

במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להבטיח איכות תמונה טובה של הזרימה בתעלת המיקרו ולהבטיח ניגודיות בין כדוריות הדם האדומות הזורמות לבין רקע התמונה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לנתח באופן איכותי וכמותי אגרגטים של כדוריות דם אדומות תחת תנאי זרימה מבוקרים.