סביבת Microfluidic מבוקרת לדינמית חקירה של צבירת תאי דם האדום

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת ישירות את אגרגטי תאי הדם האדומים במיקרו-סירקולציה, באופן דינמי בשיעורי גזירה מבוקרים וקבועים. זה מושג על ידי אימונים ראשונים, תרחיפי כדוריות דם אדומות, ומיקרו-ערוץ y כפול עם תמיסת מלח מאגר פוספט, מה שיוצר עידוד קבוע בשכבת הדם. השלב השני הוא לדמיין ולהקליט את הזרימה באמצעות מצלמה במהירות גבוהה.

לאחר מכן, השתמש בטכניקות עיבוד תמונה כדי לעבד את ההקלטה ולקבל גודל מצטבר ממוצע ואת התפלגות הגודל המצטבר במיקרו-ערוץ. השלב האחרון הוא קביעת מהירות הדם על ידי מעקב אחר תזוזה של חלקיקים פלואורסצנטיים המוזרקים במיקרו-ערוץ בין שתי מסגרות עוקבות. בסופו של דבר, קצב הגזירה במיקרו-ערוץ מחושב על סמך מהירות הדם ועובי שכבת הדם כדי לקשר את גדלי הצבירה לקצב הגזירה המקומי המתאים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שיטת העברת האור, הוא שאגרגטים של כדוריות הדם האדומות מנותחים באופן דינמי בזרימת השיתוף המיקרוסקופית בניגוד סטטיסטית לטכניקות אחרות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההמו רדיולוגי, כגון הבנת התנאים להיווצרות אגרגטים של כדוריות דם אדומות ומציאת התנהגות רדיולוגית בדם במיקרו סירקולציה. להתחיל לייצר תעלות מיקרו ברוחב 120 מיקרון, בגובה 60 מיקרון ובאורך שבעה מילימטרים על פי שיטות פוטוליתוגרפיות סטנדרטיות.

לאחר מכן, אספו תאי דם מתורמים מתנדבים בריאים והכינו תרחיפי תאי דם אדומים עם רמות המטוקריט של חמש, 10 ו-15% כמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף, שלבו מיליליטר אחד מכל תרחיף תאי דם אדומים עם 60 מיקרוליטר של תמיסה של 1% המכילה חלקיקי מעקב פלואורסצנטיים. נער בעדינות את הצינור כדי לערבב את התמיסה. שלב גם את אותו נפח של חלקיקי מעקב למיליליטר אחד של PBS ב-pH של 7.4.

טען מזרק זכוכית של 25 מיקרוליטר עם תמיסת העוקב המכילה כדוריות דם אדומות ומזרק זכוכית של 100 מיקרוליטר. עם פתרון העוקב ב-PBS, ודא שאין בועות במערכת. לאחר מכן, מקם את המיקרו-ערוץ על במת מיקרוסקופ הפוכה המחוברת למצלמה במהירות גבוהה המסוגלת להקליט 18 פריימים לשנייה ומעלה, ומערכת מהירות תמונה של מיקרו-חלקיקים.

חבר כל מזרק באמצעות צינורות לאחת מיציאות הכניסה של התעלה המיקרופלואידית ולאחר מכן טען אותם למחזיק של אותה משאבת מזרק. תכנת את משאבת המזרק להוציא את המזרק של 25 מיקרוליטר בקצב של שני מיקרוליטר לשעה. זה גם יחלק את המזרק של 100 מיקרוליטר בקצב של פי ארבעה מקצב זה בשל הבדלי הגודל שלהם.

שנה את קצב הזרימה בין ניסויים על מנת לבדוק קצבי גזירה שונים. השתמש בגיחוך כיול עם עדשת ה-20 x במקומה כדי לכייל את המצלמה המהירה. לאחר מכן הפעל את המשאבה כדי להתחיל לחלק את שני הפתרונות למיקרו-ערוץ.

קבע את החשיפה האופטימלית של המצלמה. הגיע הזמן להדמיה ברורה של האגרגטים. חשוב להמתין עד שהזרימה תגיע למצב יציב לפני רכישת מדידות כלשהן.

אם המצב היציב מגיע כעת תוך שלוש עד חמש דקות. מלאו מחדש את המזרק כדי לחנך את התערובת ולשמור על כדוריות דם אדומות בתרחיף. לאחר הגעה לזרימה יציבה, התחל לתעד את תנועת כדוריות הדם האדומות.

הקלט את הזרימה למשך שבע שניות. באמצעות תוכנית המסוגלת לעבד תמונה, שפר את הניגודיות עבור כל תמונה בגווני אפור שצולמה בשיטת אקולייזר ההיסטוגרמה. לאחר מכן, המר את התמונות בקנה מידה אפור לתמונות בינאריות.

הגדר בזהירות את ערך הסף על ידי בדיקת מספר ערכים ובחירת הערך שעבורו כל האגרגטים מזוהים כראוי. במידת הצורך, מלא את החורים המתאימים לפערים בתוך מצטבר אחד. לאחר מכן זהה את התאים על ידי קביעת פיקסלים לבנים שכנים בתמונה הבינארית כך שתאים סמוכים ייחשבו כאגרגטים.

סמן את הצברים השונים של תאי הדם האדומים שזוהו, ולאחר מכן המר את התמונה הבינארית לתמונה כחולה אדומה וירוקה להדמיה טובה יותר. לבסוף, שכב את התמונה האדומה והירוקה הכחולה על התמונה המקורית. על מנת לאמת את יעילות עיבוד התמונה, חשב את השטח של כל אגרגט שזוהה במסגרת על סמך מספר הפיקסלים שזוהו.

עבד את כל המסגרות באותו אופן. לאחר מכן, ממוצע את גדלי הצבירה שזוהו בכל מסגרת, ולאחר מכן את התוצאות של כל המסגרות. כדי להשיג את הגודל המצטבר הממוצע עבור כל הקלטה של מנועי תרחיפי כדוריות הדם האדומות, המר את התוצאות למיקרומטרים רבועים באמצעות תמונת הלעג

לאחר מכן חשב את השטח של תא דם אדום אחד כדי לקבוע נציג. מספר משוער של תאי דם אדומים בתוך כל אגרגט שזוהה לאחר רכישת הנתונים. באמצעות המצלמה המהירה, עבור למצלמה הכפולה המשמשת למערכת מהירות התמונה של מיקרו-חלקיקים.

השתמש בתוכנת הדמיה כמו זו המוצגת כאן לרכישת תמונה של הזרימה ועיבוד התמונה לקביעת שדה מהירות. הקפידו להרכיב משקפי מגן ולאחר מכן הפעילו את מערכת הלייזר והמצלמה. הנח מיקרומטר מתחת למיקרוסקופ והשתמש בתמונה המתקבלת כדי לכייל את המערכת.

לאחר מכן התחל את זרימת הנוזל ודמיין את החלקיקים בשני הנוזלים. מצא את המישור האמצעי של המיקרו-ערוץ על ידי התמקדות בחלקיקים המהירים והבהירים ביותר בזרימה. לאחר מכן, הגדר את מרווח הזמן בין הפריימים לכשתי אלפיות השנייה כך שהחלקיקים המהירים ביותר ינועו בין חמישה עד 10 פיקסלים בין שתי התמונות ויתחילו להקליט את הזרימה O.הגדר את התוכנה לרכוש 100 זוגות תמונות עבור כל תרחיפי כדוריות הדם האדומות השונות ולקצבי גזירה שונים.

לאחר עיבוד מקדים של התמונה. בחר את הגודל והצורה של חלון המתאם, כמו גם את אחוז התמונות החופפות. בטא את התוצאות כשדה מהירות ממוצע המחושב מ-100 זוגות התמונות והשורש הממוצע הריבועי שגיאה במהירות.

כבה את מצלמת הלייזר והמחשב. לאחר ביצוע כל המדידות ועיבוד התמונה, חשב את הקצב העצום על ידי זיהוי והערכה תחילה של עובי הדם בערוץ המיקרו על סמך הקלטת המצלמה המהירה. לשם כך, ממוצע את כל הפריימים בהקלטה הספציפית כדי לקבל תמונת רקע של הסרטון.

לבסוף, יש לחסל את שכבת הדם על ידי בדיקה ויזואלית של התמונה הממוצעת של כל המסגרות ולזהות ידנית את קצה שכבת הדם. לאחר מכן השג את ערך המהירות עבור עובי שכבת הדם המתאים באופן ידני מפרופיל המהירות שחולץ, וחשב את קצב הגזירה על ידי חלוקת ערך המהירות בשכבת הדם. העובי המוצג כאן הוא התנועות נטו של ארבעה אגרגטים של תאי דם אדומים שזוהו בשלוש פריימים רצופים.

הצבירה הגדולה של יותר מ-30 תאים מוצגת באדום. הצברים הבינוניים בין תשעה ל-30 תאים מוצגים בירוק, ואגרגטים קטנים של פחות מתשעה תאים מוצגים בכחול. המהירות של אגרגט משתנה בהתאם למיקומו במיקרו-ערוץ המוצג.

להלן פרופילי המהירות של תאי הדם האדומים המרחפים ב-5% המטוקריט, 10% המטוקריט ו-15% המטוקריט בקצב זרימה של 10 מיקרוליטר לשעה. ניתן לראות את המהירות מתקדמת לכיוון האפס בשני הקצוות כצפוי, ונקודת ההטיה בין שני זרמי הזרימה משתנה מעט בין רמות ההמטוקריט מכיוון שקצב הגזירה הכולל מגדיל את גודל האגרגטים בכל ירידה ברמת ההמטוקריט. זאת בשל הכוח העצום במיקרו-ערוץ העולה על הכוח המצטבר הגורם לתאי הדם האדומים להתפרק.

בעת השתתפות בהליך זה, חשוב לזכור להבטיח איכות תמונה טובה של הזרימה בערוץ המיקרו ולהבטיח ניגודיות בין כדוריות הדם האדומות הזורמות לרקע התמונה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח באופן איכותי וכמותי אגרגטים של תאי דם אדומים בתנאי זרימה מבוקרים.