Name: סביבת Microfluidic מבוקרת לדינמית חקירה של צבירת תאי דם האדום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: למדו לכמת צבירת תאי דם אדום במיקרו-זרימה תחת קצבי גזירה מבוקרים באמצעות עיבוד תמונה. שיטה זו מאפשרת חקירה דינמית של דינמיקת זרימת הדם במיקרו-מחזור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי למדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה. Microfabrication בוצע בתמיכה של מתקן מקגיל Nanotools Microfab באוניברסיטת מקגיל ובמחלקה לאלקטרוניקה באוניברסיטת קרלטון.

דם שנאסף מאנשים בריאים באישור ועדת האתיקה של אוניברסיטת אוטווה (H11-13-06). 1. ייצור microchannel Microchannels מיוצרות על בסיס שיטות photolithography הסטנדרטי 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב הגיאומטריה microchannel באמצעות עיצוב תוכנה בעזרת מחשב (CAD) ולהדפיס את התצורה בתמונה-מסכת שקיפות. מסכות אלה הן קריטיות שכן הם מכתיבים את נתיב האור במהלך תהליך הייצור. במקרה זה, את ממדי microchannel 120 מיקרומטר בעובי, 60 מיקרומטר בעומק 7 מ&quot;מ האורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר נקי, מעיל ספין אפוקסי שלילי מבוסס צילום להתנגד על פרוסות סיליקון ב2,000 סל&quot;ד במשך 30 שניות כדי לקבל את העומק הרצוי microchannel (60 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הרקיק והתמונה-מסכה תחת מנורת UV ב 650 mJ / 2 סנטימטר על 70 שניות. ודא לחשוף את האזורים השקופים רק שלצילום המסכה UV-האור. החשיפה של האזורים השקופים מאפשרת לפילמור של הרשתות וכתוצאה מהתקשות של התמונה-להתנגד. לטבול פיסת סיליקון למפתח כדי להסיר את העודפים של תמונה-להתנגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע העובש הוא מפוברק, לערבב אלסטומר מבוסס סיליקון וסוכן ריפוי ביחס של 10: 1 כדי ליצור פתרון של פולי-דימתיל-siloxane (PDMS). שים את פתרון PDMS בתא ואקום לדגה. לשפוך אותו לתוך התבנית ולחמם אותו על 60 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות כדי ליצור microchannels. אז אג&quot;ח הערוצים הבודדים לשקופיות זכוכית באמצעות מליטה פלזמה חמצן למשך 90 שניות. הערה: תהליך דגה PDMS מתבצע על מנת לחסל את בועות האוויר שנוצרו עקב תהליך הערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שמידות microchannel לאפשר לבדיקה מוצלחת. בפרוטוקול זה, יש לי microchannels חתך מלבני של 120 x 60 מיקרומטר. לשם השוואה, יש RBC ממוצע בקוטר של 8 מיקרומטר ועובי של 2 מיקרומטר.refore, רוחב microchannel מספיק להתבונן צבירה נכונה ולקבוע במדויק את פרופילי מהירות. </li></ol> 2. הכנת דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם מתורמים מתנדבים בריאים, לאחר אישור ועדת אתיקה. פנק את הדם עם חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) הנוכחי בצינורות האיסוף (7.2 EDTA מ&quot;ג ב 4 מיליליטר של דם). הערה: EDTA משמש כדי למנוע קרישת דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות הדם שלוש פעמים במשך 10 דקות ב 1400 XG (3,000 סל&quot;ד) על מנת להפריד את מרכיבי הדם. כתוצאה מצנטריפוגה, להתבונן שלוש שכבות נפרדות. הערה: שלוש השכבות הן שכבת RBC (ממוקמת בחלק התחתון של הצינור), המעיל באפי (בהיקף של תאי דם לבנים וטסיות דם הממוקמים בחלק העליון של שכבת RBC) ושכבת הפלזמה (הממוקם בחלקו העליון של כל האחר בוחרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה הראשונה, לאסוף פלזמה דם בעזרת פיפטה דם. הימנע מכל ג<html> ontact עם המעיל באפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ולהשליך את המעיל באפי במכל עם אקונומיקה מדוללת ב 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3 מיליליטר של pH 7.4 PBS לכל אחד מהצינורות עם שכבת RBC שנותר ולהבטיח האיזון הראוי של צנטריפוגות. לערבב בעדינות את הצינורות וצנטריפוגות שוב ב1,400 XG (3,000 סל&quot;ד) במשך 10 דקות. הערה: ודא שפתרון PBS אינו מכיל מגנזיום או סידן שכן הם יכולים לשנות את הידבקות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך PBS בצינורות לאחר צנטריפוגה השנייה ולהסיר את המעיל באפי שנותר אם קיימים. חזור על שלבים 2.2.3 ו2.2.4 לצנטריפוגה השלישית להניב RBCs הנקי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הסכום הנדרש (0.05, 0.1 ו0.15 מיליליטר) של תאי הדם אדומים הנקי עם פלזמה (0.95, 0.9 ו0.85 מיליליטר) בצינור מיליליטר 1 על מנת לקבל RBC, השעיות עם (5% המתאימים, 10% ו -15% המטוקריט). בדוק hematocrits עם microcentrifuge. </li></ol> 3. נוזלי הכנה = &quot;Jove_content&quot; ילדה&gt; להציג שני נוזלים בY-microchannel הכפול: RBC, ההשעיות וPBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקיקים להוסיף 60 μl של פתרון החלקיקים נותב ניאון (1% מוצקים, ד = 0. 86 מיקרומטר, שרירי בטן λ = 542 ננומטר ופליטת λ = 612 ננומטר) לצינורות RBC-ההשעיה 1 מיליליטר. הערה: החלקיקים נותב הניאון (צבועים פנימי חלקיקי פוליסטירן) משמשות למדידת המהירות של הזרימה בתוך microchannel. חלקיקים אלה לזרוח כאשר הם נחשפים לגל המקביל של קרן הלייזר (ננומטר = λ 542). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון PBS pH 7.4 ולהוסיף 60 μl של אותו פתרון חלקיקים נותב הניאון ב 1 מיליליטר של פתרון PBS. </li></ol> 4. מדידות גודל מצרפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכניס את הנוזלים (RBC, השעיות וPBS) בmicrochannel, להשתמש בשני מזרקים זכוכית של 25 μl 100 μl. רצון זהכדי לעזור להפחית את התאימות של המערכת. חבר את microchannel למזרקים דרך צינורות והמחברים מתאימים חורי הכניסה. מלא את המזרקים הזכוכית באמצעות הבדל הלחץ הקיים בין מיכל הנוזל והמזרק. להבטיח בועות לא קיימים במערכת. כשיטת חלופית, להשתמש במערכת לחץ מבוקר לנהוג שני הנוזלים בmicrochannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את microchannel על הבמה מיקרוסקופ הפוכה המחוברת למצלמה במהירות גבוהה ומערכת μPIV. תכנית משאבת המזרק לספיקות הרצויות (למשל, ש = 2 μl / שעה לדם מולידה flowrate של Q = μl 8 / שעה לPBS). הערה: רק אחד משאבת מזרק משמש. שימוש בשני מזרקים זכוכית שונים, עם שני קטרים ​​פנימיים שונים, אפשר להשתנות לflowrate נכנסת כל סניף של Y-microchannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס שני הנוזלים בY-microchannel הכפול כל מסניף כניסה שונה ובflowrates שונה כפי שמוצג ב <stronז&gt; איור 1. על מנת לבחון שיעורי גזירה שונים, לשנות את flowrate המשאבה. זה שומר על אותו היחס המתאים (4 במקרה זה) בין שני הסניפים 19 (איורים 2 ו -3). חכה לזרימה להגיע למצב יציב לפני רכישת המדידות: חזותי לבדוק את תמונות מצלמה במהירות הגבוהה לזרימה חלקה. הערה: היחס הוא קריטי בהשגת פרופיל מהירות ליניארי בתוך שכבת הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין את RBCs שימוש במצלמה במהירות הגבוהה. חבר את המצלמה למחשב כדי לשלוט, להקליט ולשמור את התמונות של זרימת הנוזל. ברגע ששני זורם הנוזל להגיע למצב יציב, להתחיל בהקלטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש כמה תמונות לתוצאות עיבוד טובות יותר. לקבוע זמן חשיפת מצלמה אופטימלי לתמונה ברורה של המצרפים. הערה: חשיפת המצלמה הזמן למקרה זה היה 0.5 msec. הבחירה של מרווח זמן בין כל מסגרת מבוססת על קצב פריימי מצלמה ואת קצב הזרימה בtהוא microchannel. הזמן בין כל מסגרת מעובד בהליך זה היה 60 אלפיות שני. לכן מצלמה מסוגלת להקליט 18 מסגרות לשניות מספיקה. הערה: הימנע מיישוב דם בצינור והמזרק, מה שעלול להוביל למדידות שגויות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שימוש בטכניקות עיבוד תמונה (תכנית MATLAB במקרה זה) לשיפור איכות התמונה, לזהות את אגרגטים בכל אחת מהתמונות המבוססות על עוצמות פיקסל (באיור 4) כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שפר את התמונות בניגוד תוך שימוש בשיטת אקולייזר היסטוגרמה להשיג איכות תמונה טובה יותר לכל מסגרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת התמונות בגווני אפור לתמונות בינארי. לשם כך, נקבע ערך סף, החל 0-1, שמכתיב את ההמרה של כל פיקסל. כל פיקסל בתמונה מתחת לערך הסף יזוהה כפיקסל שחור, ואילו פיקסלים עם ערכים גדולים יותר מהסף יזוהו כפיקסלים לבנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאחורים (אם קיימים והכרחי) המתאימים לפערים בתוך כולל אחד לתוצאות טובות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי התאים על ידי קביעת פיקסלים לבנים שכנים בתמונה בינארי, כך שתאים סמוכים קשורים כאגרגטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית המצרפים השונים זוהו ולהמיר את התמונה בינארי לתמונה כחולה-ירוק-אדום (RGB) להדמיה טובה יותר. צעדים לשלב מסגרות המקוריות עם כל אחת מתמונות מעובד המקבילות כדי לוודא את היעילות של טכניקת עיבוד תמונה ולהבטיח כי כל התאים נלקחים בחשבון, כפי שמוצגים באיור 5. בצע 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 ו4.5.5 לכל המסגרות שנתפסו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את השטח של כל כולל זוהה במסגרת מבוססת על מספר הפיקסלים מזוהים. בהתבסס על הגדלת העדשה משמשת, לחשב את מקדם ההמרה, באמצעות ארנק כיול, ולהמיר את התוצאות למיקרומטר 2. ממוצע הגדלים הכולל זוהו בכלמסגרת ולאחר מכן בממוצע התוצאות עבור כל המסגרות להשיג את הגודל כולל הממוצע לכל הקלטה של ​​RBC, השעיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את השטח של אחד RBC לקבוע מספר משוער נציג RBCs בתוך כל כולל זוהה. שימוש בתוצאות הללו, לחשב את חלוקת אחוזי RBCs בתוך כל המצרפי כפונקציה של הגדלים הכולל (המיוצג על ידי המספר המשוער של תאים בכל כולל), כפי שמוצג באיור 6. הערה: כדי למדוד את אגרגטים RBC, תוכנת ImageJ יכולה לשמש (במקום MATLAB) כדי לבצע את אותן משימות בכל מסגרת. </li></ol></li></ol> 5. מדידות מהירות נוזל ושאר דרג לקבוע את מהירות נוזל ולכן שיעור הגזירה באמצעות מערכת μPIV. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהנתונים שנרכשו באמצעות המצלמה במהירות הגבוהה, לעבור למצלמה פעמו הכפולה המשמשת למערכת μPIV. השתמש בתוכנת הדמיה לAC תמונהquisition של הזרימה ועיבוד התמונה להגדרה שדה מהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את כל אמצעי הזהירות הנדרשת, בהתאם למעמד של הלייזר, לפני הפעלת הלייזר. לאחר מכן הפעל את המערכת, את המצלמה והליזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל את המצלמה מבוססת על הגדלת העדשה בשימוש. לשם כך, השתמש מיקרוסקופי של 10 מיקרומטר דיוק מתחת למיקרוסקופ ולהגדיר את הגודל של 1 פיקסל בתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל הלייזר ולדמיין את החלקיקים בשני הנוזלים. מצא את מטוס אמצע microchannel על ידי התמקדות בחלקיקים המהירים ביותר בזרימה (כלומר, החלקיקים המהירים ביותר צריכים להיות הבהירים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את DT (מרווח זמן בין שתי מסגרות רצופות) כדי להבטיח את העקירה הנכונה של החלקיקים. החלקיקים המהירים ביותר צריכים לעבור על 5 עד 10 פיקסלים בין שני התמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל להקליט את הזרימה. הגדר את התוכנה לרכוש של תמונות 100 זוגות, 5 גזרים msec. בצע את השלבים 5.4, 5.5 ו -5.6 לכל DIFferent RBC, השעיות ולשיעורי גזירה שונות. הערה: פרטים נוספים על מתודולוגיה ניתנים במחקר של פיטס וFenech 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את ההקלטות נרכשו בשיטה חוצה קשר עם תוכנת ההדמיה. הערה: זה מורכב מdiscretizing זוג תמונות לתוך חלונות קטנים בגודל שנקבע מראש (המבוסס על זרימת נוזל ואת מרווח הזמן שנבחר על ידי המשתמש) נקרא Windows מתאם ובעקבות התזוזה של החלקיקים בכל חלון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לקבוע אם התמונות שנרכשו דורשות עיבוד מראש (כולל רקע חיסור, &quot;בסיס-גזיר&quot; 21 או תמונה חופף 22,23) לעיבוד נתונים טוב יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן בחר את גודל חלון מתאם וצורה, כמו גם של אחוז של תמונות חופפות. מחקר מפורט בוצע על ידי פיטס et al. 24 על מנת לקבוע את הפרמטרים אופטימליים וטכניקות עיבוד מראש תמונה לדםלזרום בתצורות ערוץ אחרות. להביע את התוצאות כשדה מהירות ממוצעת מחושב מזוגות התמונה 100 ושגיאת כיכר Mean שורש (RMS) במהירות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ פרופיל מהירות ביציאת הערוץ, מהעיבודים כפי שמוצג באיור 7. לפרופיל טוב יותר, בממוצע שדה המהירות בחלל. הערה: הברים להלחין את פרופיל המהירות מתאים לגודל חלון המתאם נבחר יחסית לרוחב הערוץ. שגיאת RMS במהירות גם מוצגת באיור 7, המייצגת את השגיאה בהערכת המהירות הניסיונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את הלייזר פעם אחת את כל המדידות והעיבוד מבוצעים ,. כבה את כל הרכיבים של המערכת: תוכנה, מצלמות, שלב מרגש, מחשבים והלייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את שיעור הגזירה, הראשון לזהות ולהעריך את עובי הדם בmicrochannel מבוסס על הקלטת המצלמה במהירות הגבוהה. למטרה זו, בממוצע כלהמסגרות בהקלטה הספציפית כדי להשיג תמונת רקע של הווידאו. תוחם את שכבת הדם (כפי שמוצג באיור 8 לRBC, ההשעיות זורמות בμl 10 / hr כאשר הושעו ב 5%, 10% ו -15% ההמטוקריט). לקבל את ערך המהירות לעובי שכבת הדם המתאים ולחשב את שיעור הגזירה על ידי חלוקת שווי מהירות על ידי עובי שכבת דם. </li></ol>

<ol><li>Perkkio, J., Keskinen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematocrit+reduction+in+bifurcations+due+to+plasma+skimming%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Math.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming.</a> Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).</li>
<li>Chien, S., Jan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+basis+of+the+mechanism+of+rouleaux+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation.</a> Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).</li>
<li>Neu, B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion-mediated+red+blood+cell+aggregation+in+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions.</a> Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).</li>
<li>Schmid-Schönbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+shear+rate+dependence+of+red+cell+aggregation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro.</a> J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Hemorheol.+Microcirc%22%5BJournal%5D)">Rheology of the microcirculation.</a> Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).</li>
<li>Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaskurt%2C+OK+%22Red+Blood+Cell+Aggregation%22">Red Blood Cell Aggregation</a>. , Taylor and Francis. Florida. (2011).</li>
<li>Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemorheological+disorders+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Diabetes+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Hemorheological disorders in diabetes mellitus.</a> J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).</li>
<li>Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaskurt%2C+OK+%22Handbook+of+Hemorheology+and+Hemodynamics%22">Handbook of Hemorheology and Hemodynamics</a>. , IOS Press. Netherlands. (2007).</li>
<li>Lindqvist, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viscosity+of+the+blood+in+narrow+capillary+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.-Legacy+Content%22%5BJournal%5D)">The viscosity of the blood in narrow capillary tubes.</a> Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).</li>
<li>Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F%C3%A5hraeus%3A+Evolution+of+his+concepts+in+cardiovascular+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fåhraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology.</a> Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).</li>
<li>Fåhraeus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+suspension+stability+of+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The suspension stability of the blood.</a> Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).</li>
<li>Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+specific+red+blood+cell+aggregation+indices+via+an+automated+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Hemorheol%22%5BJournal%5D)">Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system.</a> Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).</li>
<li>Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laser-assisted+optical+rotational+cell+analyzer+%28lorca%29+as+red+blood+cell+aggregometer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Hemorheol.+Microcirc%22%5BJournal%5D)">The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer.</a> Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).</li>
<li>Rampling, M. W. Red cell aggregation and yield stress. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRampling%2C+MW+%22Clinical+Blood+Rheology%22">Clinical Blood Rheology</a>. , CRC Press. Boca Raton, Florida. (1988).</li>
<li>Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+human+erythrocyte+velocity+field+and+aggregation+measurements+at+physiological+haematocrit+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels.</a> J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).</li>
<li>Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+variation+of+blood+viscosity%3A+modelling+using+shear+fields+measured+by+a+%C2%B5PIV+based+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Eng.+Phys%22%5BJournal%5D)">Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a µPIV based technique.</a> Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).</li>
<li>Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+variation+of+blood+viscosity+and+velocity+distributions+of+aggregating+and+non-aggregating+blood+in+a+bifurcating+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomech.+Model.+Mechan%22%5BJournal%5D)">Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel.</a> Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).</li>
<li>Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+red+blood+cell+aggregability+in+a+flow+chamber+by+computerized+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Hemorhol.+Microcirc%22%5BJournal%5D)">Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis.</a> Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+England%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).</li>
<li>Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+microfluidic+system+for+red+blood+cell+aggregation+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation.</a> J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).</li>
<li>Pitts, K. L., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-particle+image+velocimetry+for+velocity+profile+measurements+of+micro+blood+flows%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows.</a> J. Vis. Exp. (74), e50314(2013).</li>
<li>Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro+particle-image+velocimetry+of+bead+suspensions+and+blood+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Fluids%22%5BJournal%5D)">Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows.</a> Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).</li>
<li>Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+algorithms+for+microscale+particle+image+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22AIAA+J%22%5BJournal%5D)">Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry.</a> AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).</li>
<li>Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+measurement+accuracy+in+micro+PIV+by+image+overlapping%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Fluids%22%5BJournal%5D)">Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping.</a> Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).</li>
<li>Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-particle+image+velocimetry+measurement+of+blood+flow%3A+validation+and+analysis+of+data+pre-processing+and+processing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Meas.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods.</a> Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302(2012).</li>
<li>Bhamare, M. G., Patil, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+blood+cell+analysis+by+using+digital+image+processing%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Eng.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study.</a> Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).</li>
<li>Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+hough+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Comput.+Appl%22%5BJournal%5D)">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform.</a> Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).</li>
<li>Jambhekar, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cells+classification+using+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Res.+Repot%22%5BJournal%5D)">Red blood cells classification using image processing.</a> Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+threshold+selection+method+from+gray-level+histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Syst.+Man.+Cybern%22%5BJournal%5D)">A threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

שימוש במתודולוגיה הנוכחית, ניתן לנתח איכותי וכמותית RBC אגרגטים בתנאי זרימה שונות וhematocrits. לבדיקה מוצלחת וזיהוי כולל, חשוב לקבוע את יחס מהירות הראוי בין שני הנוזלים בכניסת microchannel. יחס זה הוא חשוב מאוד כדי להשיג עובי שכבת דם אופטימלי שבו פרופיל המהירות הוא מעין-ליניארי 19. גורם מרכזי נוסף לבדיקה מוצלחת הוא איכות תמונה טובה. למעשה, מאז השיטה מבוססת על עיבוד תמונה, זה מאוד חשוב שיהיה ניגוד בין ...

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

תאי דם אדומים (RBCs) לשחק תפקיד מכריע בקביעת התנהגות rheological של דם. הם כמעט להפליא אחראים לתכונות מסוימות של דם במבחנת in vivo. בתנאים פיסיולוגיים, RBCs לכבוש 40% ל -45% מנפח הדם. בזרימת דם, תאי הדם אדום לכבוש רק עד 20% מנפח הדם בשל קטרי כלי קטנים והפלזמה ברפרוף השפעת 1. תופעה זו של ירידה בזרימת דם פלזמה ידועה כאפקט Fåhræus. בשיעורי גזירה נמוכים, RBCs מסוגל לגשר יחד וליצור מבנים ממדיים חד ממדי או שלושה בשם &quot;rouleaux&quot; או אגרגטים, ומכאן תורם להתנהגות שאינה הניוטונית של דם. עם זאת, המנגנון של צבירת RBC אינו מובן לחלוטין. שתי תאוריות קיימות מודל הצבירה של RBCs: הגישור של תיאורית התאים עקב המקשר בין-של מקרומולקולות 2 וattrac הכוחתיאורית tion נגרמת על ידי דלדול של המולקולות בשל השיפוע האוסמוטי 3. בדרך כלל, לדם אדם, אגרגטים יוצרים בשיעורי גזירה נמוכים מאוד 4 החל 1-10 שניות -1. מעל לטווח זה, RBCs נוטה להיות משורש ולזרום בנפרד בתוך הכלי. הבנת התנאים של היווצרות אגרגטים היא של חשיבות רבה לשדה hemorheology במונחים של הגדרת התנהגות rheological של הדם. אגרגטים אלה נראים לעתים קרובות ברמת macrocirculation (&gt; 300 מיקרומטר הקוטר) 5. בקנה המידה הזה, דם נחשב כנוזל הניוטונית ותערובת הומוגנית. עם זאת, אגרגטים אלה נתפסים לעתים רחוקות ברמת הנימים (4-10 מיקרומטר קוטר) והם בדרך כלל אינדיקציה למצבים פתולוגיים כגון סוכרת והשמנה 6. מצבים פתולוגיים אחרים שיכולים לשנות צבירת RBC כוללת מצבים דלקתיים או מדבקים,מחלות לב וכלי דם כמו יתר לחץ דם או טרשת עורקים, הפרעות גנטיות ומחלות כרוניות 7. לכן, הבנת מנגנון צבירת RBC וניתוח גורמים אלה (על ידי הגדרת קשר בין הגודל של אגרגטים אלה ותנאי הזרימה) יכולה להוביל להבנה של התנהגות microrheological של דם ולכן מתייחס זה ליישומים קליניים. ניתן לשנות אגרגטים RBC על ידי מספר גורמים כגון המטוקריט (נפח של תאי דם אדומים בדם), שיעור הגזירה, קוטר הכלי, קרום נוקשות RBC והרכב הבינוני השעיית 8-10. לכן, תנאים מבוקרים נדרשים על מנת לנתח ביעילות מצרפי RBC. כמה שיטות יכולות לנתח היווצרות המצרפי על ידי מתן מדידות צבירת סטטי (מדד צבירה) שמציע מידע רלוונטי על דם התנהגות. שיטות אלה כוללות, בין היתר, שקיעת הדם11 שיטה, שיטת העברת אור 12, שיטת השתקפות אור 13 ושיטת צמיגות הגזירה הנמוכה 14. מחקרים מעטים ניסה ללמוד צבירת RBC ולקבוע את מידת הצבירה בזרימת תנאים מבוקרים 15-17. עם זאת, מחקרים אלה בעקיפין לחקור RBC גדלים המצרפי על ידי קביעת היחס של השטח הכבוש במערכת גז שנמדדה על בסיס תמונות דם מיקרוסקופיים מתן מידע על התואר של צבירה כמו גם הצמיגות המקומית. לפיכך, אנו מציגים נוהל חדש לכמת ישירות RBC צובר בזרימת דם, באופן דינמי, תחת שיעורי גזירה מבוקרים וקבועים. RBC, השעיותיהם לרכבת, בY-microchannel כפול (כפי שמודגם באיור 1), עם פתרון בופר פוספט (PBS) ומכאן יצירת זרימת גזירה בשכבת הדם. בתוך הדם הזה שכבת שיאה קבועהניתן להשיג שיעור r. RBC, ההשעיות נבדקות בהמטוקריט שונה (H) רמות (5%, 10% ו -15%) ותחת שיעורים שונים גזירה (2-11 שניות -1). מהירות הדם וקצב גזירה נקבעות באמצעות מערכת velocimetry תמונת החלקיקים מיקרו (μPIV) ואילו הזרימה דמיין באמצעות מצלמה במהירות גבוהה. התוצאות שהתקבלו לאחר מכן מעובד עם קוד MATLAB מבוסס על עוצמות תמונה כדי לזהות את תאי הדם האדומים ולקבוע גדלים כולל.

<table><tbody><tr><td>SU8-50 נגטיב מבוסס אפוקסי עמיד לאור</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מפתחת SU8-50</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פולי (דימתילסילוקסן) (PDMS) Sylgard-184</td><td>Dow-Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 סדרת מערכת פלזמה&nbsp;</td><td>תחריט פלזמה</td><td>PE-50</td><td></td></tr><tr><td>צינורות איסוף דם עם K2-EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית)</td>צנטריפוגה <td>B367861</td><td></td> <td>FisherSci</td></tr><tr><td>, כלומר Thermo Scientific CL2</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>Poshpate buffered מלח (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Tracer פלואורסצנטי תמיסת חלקיקים (15 מ"ל)</td><td>FisherSci</td><td>R800</td><td></td></tr><tr><td>Aggregometer</td><td>RheoMeditech</td><td>Rheo Scan AnD300</td><td></td></tr><tr><td>מזרקי זכוכית (50 ומיקרו; l)</td> צינורות <td>המילטון</td><td>80965</td><td></td></tr><tr><td>(טיגון)</td><td>FisherSci</td><td>AAA00001</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה במהירות גבוהה (באזלר)</td><td>Graftek Imaging Inc.</td><td>basler acA2000-340km</td><td>ניתן להשתמש במצלמה המסוגלת להקליט 18 פריימים לשנייה.</td></tr><tr><td>מצלמה כפולה&nbsp;</td><td>LaVision</td><td>Imager מיקרוסקופ אינטנסיבי</td><td></td></tr><tr><td>MITAS</td><td>LaVision</td><td>MITAS</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG לייזר</td><td>מחקר גל חדש</td><td>Solo-II</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק (Nexus3000 ו-PicoPlus)</td> <td>Chemyx Inc. ו-Harvard Apparatus</td><td>Nexus3000 ותוכנת PicoPlus</td><td></td></tr><tr><td>DaVis</td><td>LaVision</td><td>Davis</td><td></td></tr></tbody></table>

סביבת microfluidic מבוקרת לדינמית חקירה של צבירת תאי דם האדום

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

דם, כBiofluid אינו הניוטונית, מייצג את המוקד של מחקרים רבים בתחום hemorheology. מרכיבי דם כוללים תאי דם אדומים, תאי דם לבנים וטסיות דם שמושעים בפלזמת דם. בשל הריבוי של תאי הדם האדומים (40% עד 45% מנפח הדם), ההתנהגות שלהם מכתיבה את התנהגות rheological דם במיוחד בזרימת הדם. בשיעורי גזירה נמוכים מאוד, RBCs נראה להרכיב וגופי טופס הנקראים אגרגטים, שגורם להתנהגות לא-הניוטונית של דם. חשוב להבין את התנאים של היווצרות אגרגטים להבין rheology הדם בזרימת דם. הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את הליך הניסוי כדי לקבוע כמותית מצרפי RBC בזרימת דם בשיעור גזירה מתמדת, המבוסס על עיבוד תמונה. למטרה זו, RBC, השעיות נבדקות ונותחו ב120 x 60 מיקרומטר פולי-דימתיל-siloxane (PDMS) microchannels. RBC, ההשעיות הן אף אוזן גרוןירד גשם באמצעות נוזל שני על מנת לקבל פרופיל מהירות ליניארי בתוך שכבת הדם ובכך להשיג מגוון רחב של שיעורי גזירה קבועים. שיעור הגזירה נקבע באמצעות שימוש במערכת velocimetry תמונת החלקיקים מיקרו (μPIV), בעוד אגרגטים RBC הם דמיינו באמצעות מצלמה במהירות גבוהה. קטעי הווידאו שנתפס של אגרגטים RBC מנותחים באמצעות טכניקות עיבוד תמונה על מנת לקבוע את הגודל הכולל המבוסס על עוצמות תמונות.

<html> דוגמא של הזרימה דו-הנוזל בY-microchannel הכפול מוצגת באיור 2 לRBCs אדם המושעה ב 5%, 10% ו -15% ההמטוקריט וזורם בμl 10 / hr. איור 3 מציג את ההבדל בגדלים מצטברים כאשר הזרימה בערוץ מצטמצמת מ -10 μl / שעה 5 μl / שעה להמטוקריט של 10%. זה נותן רעיון איכותי של הגדלים של המצרפים כאשר משתנה המטוקריט ושיעור גזירה. איור 5 כדלקמן עקירתם של ארבעה מצרפי RBC אדם, לשלוש מסגרות רצופות, מספק מדד איכותי של קצב המצלמה המסגרת נדרשת ורעיון איכותי...

הפרוטוקול מתואר פרטי הליך ניסיוני לכמת אגרגטים של תאי דם אדומים (RBC) תחת שיעור גזירה מבוקרת וקבוע, המבוסס על טכניקות עיבוד תמונה. המטרה של פרוטוקול זה היא להתייחס גדלים כולל RBC לשיעור הגזירה המקביל בסביבת microfluidic מבוקרת.

סביבת Microfluidic מבוקרת לדינמית חקירה של צבירת תאי דם האדום

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכמת באופן ישיר אגרגטים של תאי דם אדומים במיקרוסירקולציה, באופן דינמי ותחת קצבי גזירה (shear rates) קבועים ומבוקרים. דבר זה מושג תחילה על ידי הזרקה של תמיסות תאי דם אדומים לתוך מיקרו-תעלה בצורת Y כפול עם תמיסת פוספט בופר סליין (PBS), ובכך נוצר גזירה קבועה בשכבת הדם. השלב השני הוא ויזואליזציה והקלטה של הזרימה באמצעות מצלמה במהירות גבוהה.לאחר מכן, השתמשו בטכניקות עיבוד תמונה כדי לעבד את ההקלטה ולהשיג גודל ממוצע של הצברים ואת התפלגות גודל הצברים במיקרו-תעלה. השלב הסופי הוא קביעת מהירות הדם על ידי מעקב אחר התזוזה של חלקיקים פלואורסצנטיים שהוזרקו למיקרו-תעלה בין שני פריימים עוקבים. לבסוף, קצב הגזירה במיקרו-תעלה מחושב על סמך מהירות הדם ועובי שכבת הדם, כדי לקשר בין גדלי הצברים לבין קצב הגזירה המקומי התואם.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטת העברת האור, הוא שצבירי תאי הדם האדומים מנותחים באופן דינמי בזרימה מיקרוסקופית של שכבות, בניגוד לניתוח סטטיסטי בטכניקות אחרים. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההמוראולוגיה, כגון הבנת התנאים ליצירת צבירי תאי דם אדומים ובחינת ההתנהגות הראולוגית של הדם במיקרו-סירקולציה. כדי להתחיל, ייצרו מיקרו-ערוצים ברוחב 120 microns, גובה 60 microns ואורך של שבעה מילימטרים, בהתאם לשיטות פוטוליתוגרפיה סטנדרטיות.בשלב הבא, אספו תאי דם מתורמים בריאים והכינו תרחיפי כדוריות דם אדומות עם רמות המטוקריט של 5%, 10% ו-15% כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף; ערבבו מיליליטר אחד מכל תרחיף של כדוריות דם אדומות עם 60 µL של תמיסה בריכוז 1% המכילה חלקיקי סמן פלואורסצנטיים. נערעו בעדינות את המבחנה כדי לערבב את התמיסה. כמו כן, ערבבו את אותו נפח של חלקיקי סמן עם מיליליטר אחד של PBS ב-pH של 7.4.מלא מזרק זכוכית של 25 µL בתמיסת הסמן המכילה תאי דם אדומים, ומלא מזרק זכוכית של 100 µL. כאשר תמיסת הסמן ב-PBS, ודא שאין בועות במערכת. לאחר מכן, הנח את המיקרו-תעלה על במה של מיקרוסקופ הפוך המחוברת למצלמה במהירות גבוהה המסוגלת להקליט 18 פריימים לשנייה או יותר, ולמערכת microparticle image velocimetry.חברו כל מזרק באמצעות צינורית לאחד מפתחי הכניסה של התעלה המיקרופלואידית, ולאחר מכן טענו אותם לתוך התוכן של אותה משאבת מזרקים. תכנתו את משאבת המזרקים להזרים את המזרק של 25 µL בקצב של 2 µL לשעה. פעולה זו תזרים גם את המזרק של 100 µL בקצב הגבוה פי ארבעה, בשל ההבדל בגדלים ביניהם.שנו את קצב הזרימה בין הניסויים כדי לבחון קצבי גזירה שונים. השתמשו בסרגל כיול כאשר עדשת ה-20x מותקנת כדי לכייל את המצלמה המהירה. לאחר מכן, הפעילו את המשאבה כדי להתחיל בהזרמת שני התמיסות אל תוך המיקרו-תעלה.קבעו חשיפה אופטימלית של המצלמה וזמן הדשייה להדמיה ברורה של הצברים. חשוב להמתין עד שהזרימה תגיע למצב יציב לפני ביצוע מדידות כלשהן.כאשר הושג מצב יציב (steady state), בתוך שלוש עד חמש דקות, מלאו מחדש את המזרק כדי להזרים את התערובת ולשמור על תאי הדם האדומים בסספנסיה. ברגע שהושגה זרימה במצב יציב, התחילו להקליט את תנועת תאי הדם האדומים.הקליטו את הזרימה למשך שבע שניות. באמצעות תוכנה המסוגלת לעיבוד תמונות, שפרו את הניגודיות של כל תמונת גווני האפור שצולמה באמצעות שיטת השוואת היסטוגרמות (histogram equalizer). לאחר מכן, המירו את תמונות גווני האפור לתמונות בינאריות.קבעו בזהירות את ערך הסף על ידי בדיקת מספר ערכים ובחירת הערך שבו כל הצבירים מזוהים כראוי. במידת הצורך, מלאו את החללים המתאימים לפערים בתוך צביר אחד. לאחר מכן, זהו את התאים על ידי קביעת פיקסלים לבנים שכנים בתמונה הבינארית, כך שתאים סמוכים ייחשבו כצבירים.סמנו את מקבצי תאי הדם האדומים השונים שזוהו, ולאחר מכן המירו את התמונה הבינארית לתמונת RGB (אדום, ירוק, כחול) לצורך ויזואליזציה משופרת. לבסוף, הניחו את תמונת ה-RGB על גבי התמונה המקורית. כדי לאמת את יעילות עיבוד התמונה, חשבו את השטח של כל מקבץ שזוהה בפריים על סמך מספר הפיקסלים שזוהו.עבדו את כל הפריימים באופן דומה. לאחר מכן, חשבו את ממוצע גדלי הצברים שזוהו בכל פריים, ואחר כך את הממוצע של כל הפריימים. כדי לקבל את גודל הצבר הממוצע עבור כל הקלטה של תרחיפי כדוריות הדם האדומות, המירו את התוצאות למיקרומטרים רבועים באמצעות תמונת סרגל המדידה.לאחר מכן, חשבו את השטח של תא דם אדום אחד כדי לקבוע נציג. העריכו את מספר תאי הדם האדומים בתוך כל צביר שזוהה לאחר רכישת הנתונים. בעזרת המצלמה המהירה, עברו למצלמה בעלת הפולסים הכפולים המשמשת את מערכת ה-microparticle image velocimetry.השתמשו בתוכנת דימות כזו המוצגת כאן לצורך רכישת תמונות של הזרימה ועיבוד התמונות לקביעת שדה המהירות. הקפידו להרכיב משקפי מגן ולאחר מכן הדליקו את מערכת הלייזר ואת המצלמה. הניחו מיקרומטר מתחת למיקרוסקופ והשתמשו בתמונה שהתקבלה כדי לכייל את המערכת.לאחר מכן, התחילו את זרימת הנוזל והדמינו את החלקיקים בשני הנוזלים. אתרו את המישור המרכזי של המיקרו-תעלה על ידי התמקדות בחלקיקים המהירים והבהירים ביותר בזרימה. לאחר מכן, הגדירו את מרווח הזמן בין הפריימים לכ-2 מילישניות, כך שהחלקיקים המהירים ביותר יזוזו בין 5 ל-10 פיקסלים בין שתי התמונות, והתחילו להקליט את הזרימה. הגדירו את התוכנה לרכישת 100 זוגות תמונות עבור כל סוגי תרחיפי כדוריות הדם האדומות ועבור שיעורי גזירה שונים.לאחר עיבוד מקדים של התמונות, בחרו את הגודל והצורה של חלון המתאם (correlation window), וכן את אחוז החפיפה בין התמונות. הציגו את התוצאות כשדה מהירות ממוצע שחושב מ-100 זוגות תמונות, וכן את שגיאת השורש הממוצעת של הריבועים (root mean square error) במהירות.כבה את המצלמה הלייזרית ואת המחשב. לאחר ביצוע כל המדידות ועיבוד התמונה, חשב את קצב הגזירה (sheer rate) על ידי זיהוי והערכה ראשונית של עובי הדם בערוץ המיקרו על בסיס ההקלטה של המצלמה המהירה. לצורך כך, בצע ממוצע של כל הפריימים בהקלטה הספציפית כדי לקבל תמונת רקע של הווידאו.לבסוף, הגדירו את שכבת הדם על ידי בדיקה חזותית של התמונה הממוצעת של כל הפריימים וזיהוי ידני של קצה שכבת הדם. לאחר מכן, השגיאו ידנית את ערך המהירות עבור עובי שכבת הדם המתאימה מתוך פרופיל המהירות שהופק, וחשבו את קצב הגזירה על ידי חלוקת ערך המהירות בעובי שכבת הדם. העב이는 המוצג כאן מייצג את התנועות נטו של ארבעה מקבצי תאי דם אדומים שזוהו בשלושה פריימים רצופים.צבירים גדולים של יותר מ-30 תאים מוצגים בצבע אדום. צבירים בינוניים של בין תשעה ל-30 תאים מוצגים בצבע ירוק, וצבירים קטנים של פחות מתשעה תאים מוצגים בצבע כחול. מהירותו של צביר משתנה בהתאם למיקומו במיקרו-תעלה המוצגת.להלן פרופילי המהירות של תאי דם אדומים התלויים בהמטוקריט של 5%, המטוקריט של 10% והמטוקריט של 15% בקצב זרימה של 10 µL לשעה. ניתן לראות כי המהירות שואפת לאפס בשני הקצוות כמצופה, ונקודת ההשכלה בין שני זרמי הזרימה משתנה מעט בין רמות ההמטוקריט; ככל שקצב הגזירה הכולל עולה, גודל האגרגטים בכל רמת המטוקריט יורד. זאת מכיוון שכוח הגזירה במיקרו-תעלה עולה על כוח האגרגציה, מה שגורם לתאי הדם האדומים להתפרק.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להבטיח איכות תמונה טובה של הזרימה בתעלת המיקרו ולהבטיח ניגודיות בין כדוריות הדם האדומות הזורמות לבין רקע התמונה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לנתח באופן איכותי וכמותי אגרגטים של כדוריות דם אדומות תחת תנאי זרימה מבוקרים.

controlled-microfluidic-environment-for-dynamic-investigation-red

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מפל הידבקות טסיות מתקיים בנוכחות זרימה גזירה, גורם לא היוו ב קונבנציונאלי (סטטי) היטב הצלחת מבחני. מאמר זה מדווח על assay טסיות צבירה תוך שימוש בתבנית microfluidic צלחת היטב לחקות פיסיולוגי תנאי הזרימה גזירה.

הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים Microfluidic

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של המכשיר microfluidic לחקירת chemotaxis חיידקים הדרגתיים ריכוז יציב של chemoeffectors.

מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה

שיטת לתרבות monolayer תא האנדותל לאורך כל פני השטח הפנימי של המכשיר 3D microfluidic עם כלי הדם בגודל הערוצים (&lt;30 מיקרומטר) מתואר.

מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

סרטון זה מדגים בדיקת כימוטקסיס נויטרופילים בשיטת All-on-Chip. השיטה מאפשרת בידוד ישיר של נויטרופילים מהדם כולו על ידי ברירה שלילית אימונומגנטית ואחריה בדיקת כימוטקסיס על שבב מיקרופלואידי.

שיטה מיקרופלואידית מבוססת שבב לניתוח מהיר של כימוטקסיס נויטרופילים באמצעות דם מלא

velocimetry תמונת מיקרו חלקיקים (μPIV) משמש כדי לחזות תמונות לזווג של חלקיקי מיקרו נזרעו בזורם דם אשר חוצה קורלציה לתת פרופיל מהירות מדויקת. שיעור גזירה, מהירות המרבית, צורת פרופיל מהירות, וקצב זרימה, כל אחד מהם יש יישומים קליניים, ניתן לגזור ממדידות אלה.

Velocimetry תמונת מיקרו חלקיקים למדידות בפרופיל מהירות של מיקרו זורם דם

פרוטוקול זה מפרט assay נועד למדוד chemotaxis נויטרופילים אדם מטיפה אחת של דם מלא עם שחזור חזק. גישה זו עוקפת את הצורך בהפרדת נויטרופילים ודורשת זמן הכנת assay רק כמה דקות. שבב microfluidic מאפשר למדוד החוזרים ונשנים של chemotaxis נויטרופילים לאורך זמן בתינוקות או יונקים קטנים, שבו נפח דגימה מוגבל.

פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

מאמר זה מתאר מודל ניסיוני של המוסטאסיס המודד פונקציה וקרישה טסיות זמנית. טסיות קרינת הפיברין נמדדות בזמן אמת, וקצב הידבקות טסיות דם, קרישת שיעור, והתחלה של קרישה נחושה. המודל משמש כדי לקבוע מאפיינים טסיות procoagulant תחת זרם מתרכז עבור עירוי.

מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

הגירה תא קולקטיבי בפיתוח, ריפוי הפצע, וגרורות סרטן מונחה לעתים קרובות על ידי מעברי הצבע של גורמי גדילה או מולקולות איתות. המתואר כאן היא מערכת ניסיונית המשלבת מיקרוסקופ המתיחה עם מערכת microflu, והפגנה של איך לכמת את המכניקה של הגירה קולקטיבית תחת הדרגתי הביוכימי.

מיקרוסקופ גרירה משולב עם מיקרופלואידיקה עבור הגירה קולקטיבית כימוטקטיק

אנו מציגים מערכת מיקרופלואידית למחקרי תפוקה גבוהה על מכונות חיים מורכבות, המורכבת מ-1500 יחידות תרבות, מערך של משאבות פריסטליות משופרות ומודולוס ערבוב באתר. השבב המיקרופלואידי מאפשר ניתוח של התנאים המיקרו-סביבתיים המורכבים והדינמיים ביותר ב-vivo.

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

פרוטוקול זה מתאר גישה כמותית למדידת צבירה עצמית מיקרוביאלית באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה.

ציטומטריית זרימה של הדמיה לחקר צבירה עצמית מיקרוביאלית

חקר ההתנהגות התאית תחת לחץ מכני הוא חיוני להתקדמות במכניקה התאית ובמכנוביולוגיה. אנו מציגים את טכניקת Fluorescence Micropipette Aspiration (fMPA), שיטה חדשנית המשלבת גירוי מכני מבוקר עם ניתוח מקיף של איתות תוך תאי בתאים בודדים. טכניקה זו חוקרת מחקרים מעמיקים חדשים של מכנוביולוגיה של תאים חיים.

בדיקת שאיפת מיקרופיפטה פלואורסצנטית לחקר מכנוסנסינג של תאי דם אדומים

למדו לכמת צבירת תאי דם אדום במיקרו-זרימה תחת קצבי גזירה מבוקרים באמצעות עיבוד תמונה. שיטה זו מאפשרת חקירה דינמית של דינמיקת זרימת הדם במיקרו-מחזור.

סביבת Microfluidic מבוקרת לדינמית חקירה של צבירת תאי דם האדום

גלה סרטונים נוספים