מכשירים מבוססי נייר לבידוד ואפיון של תאית שלפוחית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות פלטפורמה מבוססת נייר. זה מושג על ידי למינציה ראשונה עם שני יריעות פוליסטירן עם תאית עגולה, מגזרות נייר מיושרות על מערך של חורים רשומים. השלב השני הוא צימוד כימי של מולקולות שיקשרו שלפוחיות חוץ-תאיות לאזור בדיקת הנייר.

לאחר מכן, ניתן להזרים את הדגימה הביולוגית ישירות לאזור בדיקת הנייר, ולבודד שלפוחיות חוץ-תאיות לאחר שלב השטיפה. השלב האחרון הוא אפיון, שלפוחיות חוץ-תאיות שנלכדו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, אלייזה או ניתוח טרנסקריפטומי. בסופו של דבר, ניתן לטהר ולרכז תת-קבוצות של שלפוחיות חוץ-תאיות מדגימות סרום קטנות של 10 מיקרוליטר.

אז היתרון העיקרי של הטכניקה הזו על פני שיטות קיימות כמו חינוך אולטרה הוא שהיא הרבה יותר עדינה, הרכבה ופשוטה לביצוע. מדגים את ההליך יהיה סטודנט לתואר שני. החל משתי יריעות פוליסטירן, צור מערך של גזרות עגולות.

כל אחד מהם מציג קוטר של פחות מחמישה מילימטרים עם ניקוב חורים ידני או פלוטר חותך אוטומטי cad. בנוסף, גזרו סדרה של כרומטוגרפיה בקוטר חמישה מילימטרים, דיסקי נייר עם אגרוף חור. הניחו דף פוליסטירן אחד על הספסל והניחו דיסק נייר בודד על גבי כל חור עובר מתאים.

סנדוויץ' את דיסקיות הנייר על ידי רישום וכיסוי גיליון הפוליסטירן השני. בדוק את היישור הכללי לפני הדבקת הכריך בלמינציה תרמית. לאחר מכן, התחל שינויים כימיים במשטח על דיסקי הנייר על ידי הכנסת המכשיר למינציה לתא פלזמה.

הפעל בקצרה את משטח הנייר עם פלזמת חמצן עם שחרור ואקום החדר, העביר מיד את מכשיר הנייר לתמיסת הצילין ודגר למשך 30 דקות. הגדר את טמפרטורת החדר. הסר נתיבי cy עודפים על ידי שטיפת המכשיר בחמישה מיליליטר של אתנול הוכחה 200.

לאחר מכן דגרו את המכשיר עם תמיסת קישור A-G-M-B-S למשך 15 דקות. הגדר את טמפרטורת החדר. הסר מולקולת קישור עודפת עם כמויות גדולות של שטיפות אתנול.

לאחר מכן, דגרו את המכשיר עם avadon למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס והסירו את avadon הלא קשור עם שטיפת PBS של חמישה מיליליטר. לאחר מכן המכשיר יכול להמשיך לשלב קשירת הנוגדנים או להיות מאוחסן בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבעה שבועות במידת הצורך. עם הצמדת עדן פיפטה 10 מיקרוליטר של תמיסת חסימה על אזורי דיסק הנייר החשופים ודגירה על הנייר למשך 10 דקות.

בטמפרטורת החדר, חזור על תוספת של 10 מיקרוליטר של תמיסת חסימה והדגירה בטמפרטורת החדר של 10 דקות. פעמיים נוספות כדי להשלים את הפונקציונליזציה הביולוגית של מצע הנייר החשוף פיפטה 10 מיקרוליטר של מולקולות הלכידה הביוטיניות על הדיסקים ודגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עבור שלפוחיות חוץ-תאיות, מולקולות הלכידה הנבחרות יכולות להיות נוגדנים נגד CD 63 או שין חמש. חזור על תהליכי הפיפטינג של 10 מיקרוליטר והדגירה של 10 דקות.

פעמיים נוספות לאחר לכידת מולקולה מצורפת. שטפו את החלקים העודפים על ידי פיפטינג. 10 מיקרוליטר של מאגר הכביסה המתאים על כל דיסק נייר.

דגרו את הכביסה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר וחזרו על שלבי הכביסה של 10 מיקרוליטר ודקה אחת פעמיים נוספות. מכשיר הנייר הפונקציונלי במלואו מוכן כעת לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות מסרום או הומור מימי לעיבוד סרום. אסוף 10 מיליליטר של דם היקפי בצינור ואקטיינר והפוך בעדינות את הצינור חמש פעמים.

הנח את הצינור במצב אנכי והמתן 30 דקות. הגדר את טמפרטורת החדר, צנטריפוגה את דגימת הדם למשך 15 דקות. הגדר את טמפרטורת החדר.

העבירו את שכבת הסרום השקופה העליונה לצינור פלסטיק נקי והשליכו את השלב התחתון המוצק למחצה. הבהירו את הסרום במהירות צנטריפוגה גבוהה יותר למשך 30 דקות. הגדר את טמפרטורת החדר.

העבירו את הסופרנטנט לתוך שפופרת טרייה והסירו חלקיקים עדינים על ידי העברת הסופרנטנט דרך מסנן של 0.8 מיקרומטר. ניתן להשתמש בסרום המסונן שנוצר באופן מיידי או לאחסן אותו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. אם יש לחלץ את השלפוחיות החוץ-תאיות מהומור, אסוף הומור מימי מהמטופלים ישירות באמצעות פרוצדורות פולשניות ואחסן את הדגימות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.

עד לשימוש, אין צורך בשלבי סינון או הבהרה עבור דגימות הומור זגוגית. כדי לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות מהומור סרום או מימי, הבחין בפיפטה חמישה מיקרוליטר מהדגימה הביולוגית על כל דיסק מצע נייר פונקציונלי ביולוגית. דגרו את המקום למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר וחזרו על תהליכי הפיפטינג של חמישה מיקרוליטר והדגירה של דקה.

פעמיים נוספות לאחר כריכת זיקה, שטפו שלפוחיות לא קשורות על ידי פיפטינג ראשון של 10 מיקרוליטר ממאגר הכביסה המתאים. דגרו את המאגר למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר וחזרו על הכביסה של 10 מיקרוליטר והדגירה שלאחר מכן. צעד עוד פעמיים.

השלפוחיות החוץ-תאיות שנלכדו מוכנות כעת לבדיקות הבאות במורד הזרם כדי לקבע את השלפוחיות שנלכדו על פיפטת תמיכת הנייר הפונקציונלית 10 מיקרוליטר של קיבוע 0.5 x קרנופסקי על כל דיסק נייר. תן לתגובת הקישור הצולב להמשיך בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ושטוף את כל הדיסקים בכמויות גדולות של PBS למשך חמש דקות. לאחר מכן, יבש את מצעי הנייר על ידי מריחת השטיפות הבאות לפי הסדר.

דגירה אחת של 35% אתנול, שתי דגירות של 50% אתנול, שתי דגירות של 70% אתנול, שתי דגירות של 95% אתנול וארבע דגירות של 100% אתנול. עבור כל שטיפה בודדת, הניחו לתמיסת האתנול לדגור על גבי דיסקיות הנייר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. כאשר מכשיר הנייר יבש בעצמות, מצפים את הדגימות בשכבה של 18 ננומטר של זהב פלדיום בהתזה מתכתית.

הכנס את הדגימה למיקרוסקופ אלקטרונים סורק ובצע מיקרוסקופיה בחמישה קילו-וולט כדי למנוע טעינה עודפת של הדגימה הביולוגית כדי לזהות שלפוחיות שנלכדו באמצעות בדיקות חיסוניות. התחל בהוספת חמישה מיקרוליטרים של נוגדן ראשוני נגד CD תשעה על כל דיסק נייר ודגירה בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. הסר את כל הנוגדנים הלא קשורים על ידי שטיפת מכשיר הנייר עם 30 מיליליטר PBS בטמפרטורת החדר באמצעות תסיסה מכנית.

לאחר מכן, פיפטה חמישה מיקרוליטרים של פרוקסידאז צנון סוסים מצומד נוגדן משני על כל נייר. דיסק ודגירה בטמפרטורת החדר למשך דקה. שטפו את המכשיר עם 30 מיליליטר PBS באמצעות תסיסה מכנית כדי להסיר נוגדנים משניים לא קשורים.

לבסוף, הוסף חמישה מיקרוליטרים של צבע ותערובת מצע מטרית על כל נייר.דיסק. דגרו את התגובה בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 דקות וסרקו את השינוי שנוצר בעוצמת צבע הספוט באמצעות סורק שולחני. כדי להתחיל, בודד דיסקי נייר בודדים מהמכשיר בתפזורת על ידי חיתוך אזורים של לרבד פוליסטירן עודף באמצעות מספריים או סכין גילוח.

הנח כל דיסק נייר לתוך מיקרו צנטריפוגה נקייה של 1.5 מיליליטר. שני ליס השלפוחיות שנלכדו על ידי הוספת 265 מיקרוליטר של מאגר ליזה. ו-35 מיקרוליטר של מנשא להסרת פוליסכריד מבוסס PVP לכל מערבולת צינור במרץ.

כדי להבטיח שלפוחית מלאה, ליזה ועקירה של מולקולות RNA משוחררות, הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת הומוגנאט למערבולת הליזאט כדי לערבב ולדגור את הצינור על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסף 330 מיקרוליטר של תערובת כלורופורם פנול חומצה לליזאט כדי להבטיח הפרדה ספציפית לשלב נכון של RNA משני החלבונים ומערבולת ה-DNA במרץ למשך 15 שניות לפחות לכל צינור. צנטריפוגה את הצינור במלוא המהירות למשך חמש דקות.

בטמפרטורת החדר, העבירו את ה-RNA המכיל את הפאזה המימית העליונה לצינור טרי של 1.5 מיליליטר והשליכו את השלב האורגני התחתון. הוסף 1.25 נפחים מימיים בשווי 100% אתנול ל-RNA ומערבולת לערבוב קצר. לאחר מכן מרחו את התערובת על עמוד מיצוי מוצק RNA מסחרי.

צנטריפוגה של הצינור למשך 15 שניות בטמפרטורת החדר והשליכו את הזרימה דרך שבר. שוטפים את העמוד על ידי הוספת 700 מיקרוליטר תמיסת עבודה. ראשית, צנטריפוגה את הצינור למשך חמש עד 10 שניות והשליך את הזרימה דרכו.

לאחר מכן, שטפו את העמוד עם 500 מיקרוליטר של תמיסת עבודה. מספר שתיים, צנטריפוגה את הצינור למשך חמש עד 10 שניות. השליכו את הזרימה וחזרו על הכביסה פעם נוספת.

הסר את כל שאריות האתנול עם סיבוב אחרון של דקה אחת בטמפרטורת החדר והעביר את עמוד המיצוי המיובש לצינור טרי של 1.5 מיליליטר. הוסף 100 מיקרוליטר מים ללא R RNA שחוממו מראש. צנטריפוגה את הצינור במלוא המהירות למשך חמש עד 10 שניות והשליך את עמוד החילוץ העליון במידת הצורך.

לרכז ולטהר עוד יותר את ה-RNA EIT באמצעות ערכת ניקוי RNA מסחרית באמצעות ביוטין עם תווית פלואורסצנטית. ככתב של Surface Im Mobilization. ניתן לראות את היעילות והספציפיות של פרוטוקול פונקציונליזציית הנייר על ידי השוואת הקרינה הגבוהה שנגרמה על המשטח שהשתנה על פני משטחי נייר לא פונקציונליים.

יתר על כן, כאשר מולקולת המדווח מוחלפת בנוגדנים נגד CD 63 ביוטיניליים, מצע הנייר המתפקד כהלכה יאפשר קצב לכידת שלפוחית חוץ-תאית גבוה יותר על פני מצע נייר בקרה שלילי. כאשר מולקולות לכידה שונות משותקות על מצעי נייר, נראה כי תת-קבוצות שונות של שלפוחיות חוץ-תאיות מציגות התפלגות גודל שונה באמצעות מכשיר הנייר. ניתן גם לבדוק הן את תכולת ה-RNA התוך-שלפוחית והן את השפע של חלבוני פני השטח הספציפיים לשלפוחית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולספק את העלייה בתא באמצעות מכשיר מבוסס נייר.