בVivo הדינמיקה של רשתית microglial הפעלה במהלך מוחיה: Confocal Ophthalmoscopic הדמיה וMorphometry הסלולרי בעכבר גלאוקומה

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לאפיין את הדינמיקה של מיקרוגליה במודל עכבר של גלאוקומה כרונית באמצעות דימוי קונפוקלי in vivo של הרשתית. דבר זה מושג על ידי אופתלמוסקופיה קונפוקלית חודשית לא פולשנית או CSLO לצפייה במיקרוגליה פלואורסצנטית על הרשתית ועל ראש עצב הראייה. ניתוח תמונות חיות באמצעות סגמנטציה של גוף התא (SOMA) המבוססת על סף (threshold) ומורפומטריה מכמתים שינויים במספר תאי המיקרוגליה ובמידת ההפעלה שלהם.

התוצאות מראות כי ניתן להשתמש בדימות CSLO חודשי בעכברים חיים כדי לנטר את קינטיקת התפלגות צפיפות התאים המיקרוגליאליים ואת ההפעלה המורפולוגית במהלך השלבים המוקדמים של התקדמות ניוון עצבי כרוני. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דימות קונפוקאלי בדו-פוטון של מיקרוגליה חיובית ל-GFP במוח עכברים, הוא שדימות CSLO של הרשתית מאפשר תצפית וניטור ישירים של תאים מיקרוגליאליים לאורך התקדמותם של הפרעות ניוון עצבי הקשורות להזדקנות באורגניזם שלם. הרעיון לשיטה זו עלה במוחי לראשונה לאחר שהדגמנו ex vivo, כי מיקרוגליה הראתה הפעלה וצבירה אינטנסיביות באזור המרכזי של עכברי DBA through J צעירים, בגילים שקדמו לניוון עצבי שניתן לזיהוי.

כדי לבחון האם שינויים מוקדמים אלו במערכת החיסון המולדת, שקדמו לגלאוקומה שניתן לזיהוי, גרמו לניוון עצבי, היה עלינו לבסס גישה in vivo למעקב אחר שינויים במיקרוגליה. את הליך רכישת התמונות בזמן אמת ידגים קיסר רומרו, טכנאי במעבדתי. כדי להתחיל בפעולה, הפעילו את מערכת ה-CSLO והזינו את פרטי הסשן. לאחר מכן, הכינו את התשתית לצילום מאובטח.

חברו עדשה אובייקטיבית נקייה בשדה רחב של 55 מעלות. הניחו עכבר על פלטפורמת ההדמיה שתי דקות לאחר מתן חומר ההרדמה, והרחיבו את שני האישונים באמצעות טיפות מידריאטיות. חמש דקות לאחר מכן, ודאו שהעכבר מרודם.

בשלב הבא, כסו כל עין בעדשות מגע תוך הפעלת לחץ מינימלי. כוון את העכבר כך שהעין הימנית תפגוש את עדשת העדשה (objective lens) והמ Orbita תהיה מקבילה לעדשה. אין צורך להגביל את תנועת החיה, אך יש לשמור אותה במרחק קבוע מעדשת העדשה.

במשך 10 עד 15 הדקות הבאות, כאשר העין מיושרת למכשיר, העכבר לא יזוז או ימצמץ בעוד תנועות עיניו נמעקבות על ידי מערכת הדימות בזמן אמת CSLO. התחילו את סשן הדימות באיסוף תמונת קרקית של הרשתית הפנימית. לשם כך.

בחר במצב האינפרא-אדום, המתאים לאורך גל עירור של 820 nanometers. לאחר מכן, כוון את הספק של הלייזר ל-100% ואת הרגישות לטווח שבין 40% ל-60%. בשלב הבא, תוך עבודה במהירות, אתר את העין באמצעות הג'ויסטיק כדי לכוון את האופתלמוסקופ, והכן את המכשיר לאיסוף תצוגת קרקית של הדיסקה האופטית וכלי הדם ברשתית. בדוק את הקרנית ואת העדשה כדי לשלול פגיעה או עכירות.

הוציאו מהמחקר עיניים עם פגמים או פציעות שעלולים להשפיע על רכישת התמונה. כעת, על ידי קירוב העדשה לאין, אתרו את אזור הדיסקה האופטית, שהיא פניו של ראש העצב האופטי (ONH). לאחר מכן, מרכזו את התמונה על ה-ONH.

מיקום נכון של ה-ONH הוא המפתח להשגת מיקוד ודמיסיה (demission) אחידים לאורך התמונה. השלב הבא הוא ויזואליזציה של המישורים הפנימיים של הרשתית וכן של ה-ONH. עבור מישור מוקד לייחוס, השתמש בכלי דם ראשיים הממוקמים על פני השטח הויטראליים של הרשתית, המתאימים ל-59 ו-60 דיופטר, או אף עמוק יותר ב-55 דיופטר באזורים שקועים של הדיסקה האופטית.

בשלב הבא, כוון את רמת רוויית התמונה באמצעות הפיתול שבלוח המגע, עד שמעגל לבן של תאורה יכסה את מרבית קרקעית העין מסביב לדיסכוס האופטי. לאחר מכן, בחר ברמת הרווייה הנמוכה יותר המפיקה הילה אחידה, המעידה על ניגודיות אופטימלית עבור אותה עין. ייתכן שיהיה צורך למקם מחדש את המצלמה אם נותרו אזורים כהים.

כעת, אספו תמונת קרנייתית (fundus) ברזולוציה גבוהה של הרשתית המרכזית על ידי ממוצע של 30 פריימים שצולמו בזמן אמת כדי לשפר את יחס האות לרעש. הדבר תואם ל-4.7 פריימים לשנייה, אשר נורמלו באופן מיידי ובאותה מיקום כדי להכין את הדגימה לאיסוף תמונת פלואורסצנציה של תאים חיוביים ל-GFP. עברו למצב דימוג פלואורסצנציה בלוח מסך המגע, אשר בוחר בלייזר כחול עם עירור לייזר של 488 nanometer ומערכת מסנני חסימה של 460 עד 490 nanometer, והגדירו את הרכישה ל-100% בעוצמת הלייזר ו-100 עד 125% רגישות.

כעת, אספו תמונת פלואורסצנציה דו-ממדית של נקודת XY אחת של ה-ONH, תוך ביצוע ממוצע של 100 סריקות x. לאחר מכן, צלמו תמונה רב-נקודתית של הרשתית מסביב ל-ONH; בחרו ב-composite בלוח הבקרה, ולאחר מכן הזיזו את האופתלמוסקופ לאורך הציר הנחיר-רקה (nasal temporal axis). התוכנה מבצעת ממוצע של אזורים שנסרקו לאחרונה ומחברת אותם בזמן אמת.

אם איכות התמונה של אזורים ברשתית אינה מספיקה כדי לאפשר ממוצע, העיגול הירוק המזהה את האזור שנסרק יהפוך לאדום. התמונה המורכבת שמתקבלת מכסה שטח של עד 1.7 על ארבעה מילימטרים. יש לנקוט זהירות במהלך רכישת התמונה המורכבת.

תמונות ברזולוציה גבוהה עלולות ללכת לאיבוד אם נזיז את העדשה במהירות רבה מדי לפני השלמת ממוצע הסריקה וחיבור התמונות (stitching). כאשר ההשפעה של ההרדמה מתחילה פגוע, יש להפסיק את סשן ההדמיה מכיוון שהעכבר מתחיל לנשום בכבדות וההדמיה הופכת לבלתי אפשרית. התחילו ביישור רצופי של תמונות קרנית העין (fundus) עבור סדרת זמן, תוך שימוש בכלי הדם ובדיסק האופטי כנקודות ייחוס.

השתמש בתוכנה רגילה לעריכת תמונות כדי ליישר את כל התמונות עד לחפיפת ה-O hs שלהן. התמונה העליונה תהיה שקופה למחצה בזמן הגרירה. לאחר מכן, סובב כל תמונה ברצף עד שכלי הדם הראשיים שלה יחפפו לכלי הדם בתמונה הקודמת, ושמור את הסידור לעיון עתידי.

יש לרשום את הזווית המתוקנת עבור כל תמונה ולהחיל אותה על תמונת הפלואורסצנציה של נקודת ה-XY היחידה המתאימה. כעת ניתן לזהות תאי מיקרוגליה בודדים חיוביים ל-GFP הממוקמים ברשתית המרכזית על ידי פתיחת קובצי ה-TIFF המיושרים בתוכנת Fluor render. כדי להציג את כל התאים, יש למלא את המסך בתמונה ולהגדיר את תצוגת הרינדור כ-composite orthogonal ו-interpolated.

לאחר מכן, הגדירו את התכונות: 0.58 gamma, 255 saturation point, 255 luminance, 195 alpha ב-1.00 shading. השלימו את הבחירות על ידי הגדרת ערוצי ה-RG כגלויים. הסתירו את ערוץ B על ידי לחיצה כפולה עליו במסגרת סביבת העבודה כדי לסגמנט תאים בודדים.

בחרו את הערוץ האדום ובצעו סף (threshold) על ידי הגברת הסף הנמוך עד שמרבית התאים יסומנו כמסוכי (masked) עם חפיפה מינימלית, תוך החרגת תהליכי התא ושמירה על הסף הגבוה כקבוע. לבסוף, שמרו את הקובץ עם התאים המסוכים באמצעות פקודת הלכידה (capture). פתחו את התמונה עם התאים המסוכים בעורך הגרפיקה של רסטר (raster) שם.

הפוך את סולם האפור לצפייה ישירה והתאם את הרזולוציה ל-300 DPI ומעלה. תמונת ה-RGB נשמרת כקובץ TIF. השלב הבא של ניתוח התמונות החיות הוא של מיקרוגליה, לכן תבוצעו סגמנטציה ומורפומטריה כדי לזהות את ה-SATA לצורך כימות השטח.

השתמש בתוכנה המסוגלת לבצע מדידות עוצמה וספירה של אובייקטים על בסיס סף (threshold). פתח את קובץ ה-TIFF עם התאים המופרדים (segmented cells), ובחר בשינוי קנה מידה מסוג spline לרזולוציה מקסימלית, ובחר בערוץ האדום כשחור-לבן לצורך ויזואליזציה טובה יותר. לאחר מכן, בצע כיול לתמונה על ידי הגדרת הקוטר האופקי שלה כ-1.4 עד 1.7 millimeters, בהתאם לגיל, כדי לבצע סגמנטציה של תאים בודדים.

כעת, ביצעו סף עוצמה (intensity thresholding) על הערוץ האדום. פתחו את פונקציית סף העוצמה תחת פקודת ספירת אובייקטים ועדכון חשבון. השתמשו בפונקציה זו כדי לעקוב אחר פרמטרים דו-ממדיים עבור כל סף של אזור העניין (region of interest) המייצג פרט בודד.

בשלב הבא, הגדירו את סף העוצמה בהיסטוגרמת העוצמות. בחרו את ה-50 עד 60% הנמוכים מתוך 255 הרמות, ועדנו את ערך הסף הסופי של התאים הבודדים. העריכו באופן ויזואלי את החפיפה בין מסיכת הצבע של הסף בכחול לבין היקף גוף התא (soma) באפור, באמצעות בקר השליטה של סרגל הכלים הבינארי או קטלוג האובייקטים.

זהו באופן ידני אזורי עניין סומטיים הכוללים מספר תאים. הפרד אלמנטים אלו על ידי הפרדת אזורי העניין. בעת ביצוע פעולה זו, השתמש במתג כדי להציג כעת את התאים באופן ישיר באמצעות הגבלת שטח.

סווג את תאי המיקרוגליה כפעילים (activated) אם שטח הסומות (somata) שלהם גדול מ-50 עד 60 מיקרון רבוע. סווג את המיקרוגליה כלא פעילים (deactivated) אם הסומות שלהם קטנים יותר.

לבסוף, אששו את התהליך ובדקו את מורכבות ההסתעפות בכל תא מיקרוגליה מופעל על ידי הנחת מסכת הגוף התאי (somal mask) ותמונת נקודת ה-XY הבודדת אחת על השנייה, עם הגברת הניגודיות ב-50%. הפרוטוקול המתואר שימש להדמיה של תאי מיקרוגליה על פני שטח נרחב של הרשתית המרכזית. בעכברי DBA two J צעירים, הומוזיגוטים למבטא CX three C one GFP, הרזולוציה הגבוהה של התאים בשילוב עם דימוג תמונות חיות, סף חיתוך (thresholding) וניתוח מורפומטרי אפשרו סגמנטציה אוטומטית של תאים בודדים חיוביים ל-GFP, ובכך התאים הובחנו על סמך השטח. דגם עכברי DBA two J מדמה גלאוקומה כרונית והודמג מדי חודש כדי לנטר את התפתחות הגליוזיס מקומית והפעלת מיקרוגליה בגילאים הקודמים לניוון עצבי גלוי, באופן העקבי עם ההתקדמות המשתנה של הניוון העצבי בעיניים בודדות. ניתוח זה חשף שינויים בהפעלת מיקרוגליה ברשתית ובגליוזיס עם הזמן.

הניתוח זיהה גם שינויים דינמיים בצפיפות המיקרוגליה הכוללת והמופעלת בתוך רשתות בודדות. צפיפות אוכלוסיית המיקרוגליה לא הייתה קשורה לשינויים בצפיפות התאים המבטאים GFP, בהתאם לממצאים אחרים. לפיכך, ניתוח CSLO יכול לשמש כאינדיקטור להתקדמות מוקדמת של המחלה.

במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לייעל בקפידה את רמות הרוויה של התמונה הפלואורסצנטית של GFP פלוס מיקרוגליה, הממוקמת ברשתית הפנימית; השחזור של תמונות ה-CSLO של הרשתית המרכזית, כמו גם פירוט תאי עקבי שזוהה ברחבי הרשתית המרכזית, תלויים באופן קריטי בשלב זה לאחר פיתוחו. פרוטוקול דימוי חי זה מיושם במעבדתנו כדי לבחון את הקשר הפוטנציאלי בין שינויים מוקדמים במיקרוגליה של הרשתית וראש עצב הראייה, לבין התקדמות מאוחרת של גלאוקומה ב-DBA/2J ובמודלים אחרים של דגנרציה כרונית של הרשתית. אסטרטגיית דימוי חי זו עשויה לאפשר גם זיהוי מוקדם של פתולוגיות כרוניות אחרות המכוונות גם הן לרשתית ולעצב הראייה לצורך דגנרציה, כגון טרשת נרכים, מחלת אלצהיימר ומחלת פרקינסון.