בידוד של תאי גזע / עצביים מהאזור סביב חדרי המוח של העכברוש למבוגרים וחוט השדרה אנושי

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבודד תאי גזע עצביים מהאזור הפראונטריקולרי (paraventricular region) של חוט השדרה של חולדה בוגרת או של בן אדם. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הוצאת חוט השדרה באמצעות למינקטומיה (laminectomy). השלב השני הוא חיתוך של חוט השדרה לרוחבו למקטעים של סנטימטר אחד, וביצוע דיסקציה לאזור הפראונטריקולרי מכל מקטע של חוט השדרה.

בשלב הבא, הרקמה הקצוצה נחתכת לחתיכות של 1 mm ולאחר מכן עוברת דיסוציאציה אנזימטית. השלב הסופי הוא הפרדת תאים שלמים באמצעות צנטריפוגציה דרך מדרג צפיפות לא רציף והזרעה של תרחיף התאים. לבסוף, ניתן להעריך את היווצרות ה-neurospheres ואת צמיחתם של תאי גזע עצביים באמצעות מיקרוסקופיה של אימונופלורסצנציה.

היום אדגים כיצד לבודד תאי גזע עצביים מהאזור הפראוונטריקולרי של חוט השדרה של חולדה בוגרת. ניתן להשתמש בתאים אלו כדי לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום תאי הגזע העצביים, כגון אילו גורמים חיצוניים מקדמים הגבלה של שושלת תאים, או כיצד תאים אלה מגיבים לגירויים שונים או למע tatsächlich.

בשלב הבא, לאחר מינון יתר של חומר הרדמה, יש לעקר את עורו של החולדה ולהשתמש במספרי ניתוח גדולים כדי להסיר את השטח הגבי, ובכך לחשוף את עמוד השדרה. החזיקו את מספרי הניתוח בניצב ובאופן רוחבי לשטח הגבי. גזרו את עמוד השדרה מעל הגפיים האחוריות.

לאחר מכן, השתמש במספריים קטנים יותר כדי לחתוך לאורכו את השריר הגבי שמעל עמוד השדרה בכיוון רוסטראלי כדי לחשוף את הזקירים (spinous processes), החל מהקצה החשוף. הכנס כלי חיתוך עצם קטן וקהה באופן אקסטרא-אורלי אל ההיבט הלטרלי של התעל השדרנית, במרווח שבין חוט השדרה לעמוד השדרה. מקם את הלהב בעומק רדוד ובמקביל לחוט השדרה.

לאחר מכן, בצעו חתכים קטנים ב-lamina וקלפו אותה בזהירות כדי לחשוף את חוט השדרה. זווית זו מונעת נזק לחוט השדרה שמתחתיה. המשיכו להסיר את ה-lamina בכיוון הרוסטרלי (rostral).

כדי לחשוף את חוט השדרה החזי והצווארי, הרם בעדינות את חוט השדרה מעמוד השדרה באמצעות פינצטה רחבה (blunt tissue forceps) וגזור את השורשים בעזרת מיקרו-מספריים. כדי לשחרר את חוט השדרה, מקם את חוט השדרה שהוצא בצלחית פטרי המכילה תמיסת חיטוי לנתיחה של חולדה, סטרילית וקרה מאוד (ice cold). שטוף את הרקמה בתמיסת הנתיחה הקרה והשתמש במספריים כדי לחתוך את חוט השדרה לרוחבו למקטעים של one centimeter. עבור כל מקטע רקמה, החזק את הרקמה ביד אחת בעזרת פינצטה עדינה, וביד השנייה השתמש במיקרו-מספריים כדי להסיר בזהירות את החומר הלבן יחד עם מרבית החומר האפור, כך שיישאר רק האזור הפריוונטריקולרי (periventricular region) של חוט השדרה.

העבירו את רקמת ה-periventricular המנותחת לכלי Petri סטרילי בנפח 10 סנטימטר המכיל בופר לניתוח חולדות קר בטמפרטורת קרח. כדי להתחיל בבידוד תאי גזע עצביים של חולדה, השתמשו במספרי מיקרו כדי לקצוץ את רקמת ה-periventricular המנותחת לחתיכות של מילימטר מעוקב אחד. לאחר מכן, הכינו את בופר הדיסוציאציה האנזימטית על ידי הוספה של חמישה מיליליטר של Earl's balanced salt solution למבחנה של papain מתוך ערכה לדיסוציאציית papain.

הנח את המבחנה בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות, כדי שהפפאאין ימוס לחלוטין והתמיסה תיראה צלולה. לאחר מכן, הוסף 500 µL של Earl's balanced salt solution למבחנה של ה-DNAs מערכת הדיסוציאציה. ערבב בעדינות, הוסף 250 µL מתמיסת ה-DNA למבחנה המכילה פפאאין וערבב בעדינות.

בשלב הבא, העבירו למבחנה כ-0.2 גרם מהרקמה הקצוצה, והניחו את המבחנה על פלטפורמת נדנדה בטמפרטורה של 37 °C למשך 45 דקות עד שעה. לאחר האינקובציה, טריטורו את התערובת באמצעות פיפטה של 10 millilitres כדי לפרק שאריות רקמה שנותרו וליצור סספנסיית תאים עכורה. העבירו את סספנסיית התאים למבחנה קונית סטרילית של 15 millilitres וסבבו בצנטריפוגה ב-300 Gs למשך חמש דקות.

בטמפרטורת החדר במהלך הצנטריפוגציה, הכין את תמיסת ה-OVO moid על ידי ערבוב של 2.7 milliliters של Earl's balance salt solution עם 300 microliters של תמיסת מעכב albumin OVO MOID שחודשה. לשפופרת קונית של 15 milliliter, הוסף 150 microliters של תמיסת ה-DNA שהוכנה מראש לתמיסת ה-oval moid וערבב על ידי הפיכת השפופרת; הסר את העלייה (supernatant) מהתאים שהשקיעו, וסספנד מיד את משקע התאים בתערובת המדוללת של DNA albumin inhibitor. לאחר מכן, הכין גרדיאנט צפיפות לא רציף על ידי הוספת חמישה milliliters של תמיסת albumin inhibitor לשפופרת של 15 milliliter, ובעזרת פיפט של חמישה milliliters, שכב בעדינות ובאיטיות את סספנד התאים מעל תמיסת ה-albumin inhibitor.

סובב את הדגימה בצנטריפוגה ב-70 gs למשך שש דקות בטמפרטורת החדר. בסיום, השלך את הנוזל העליון (supernatant) ותלה את משקע התאים ב-1 ml של מצע EFH לחולדה שחומם מראש והוכן כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. ספור את צפיפות התאים החיים באמצעות המוציטומטר והעבר את התאים לבקבוק תרבית T 25 בצפיפות של 10 תאים ל-µL ב-EFH.

דגרו את הבקבוקים בטמפרטורה של 37 °C בריכוז של 5% carbon dioxide והניחו לתרביות לגדול ללא הפרעה במשך שבוע אחד כדי למנוע אגרגציה של הספירות. מוצג כאן חתך רוחבי של חוט השדרה של חולדה שנצבע ב-luxal fast blue, וכן ב-hematin ו-eoin כדי להראות את הגבולות של החומר הלבן והחומר האפור. הקו המקווקו מסמן את שארית הרקמה הפריוונטריקולרית שחולקה ואובדה בפרוטוקול זה מאזור זה.

נוירוספירות, כדוגמה לאלו המוצגות כאן, יגדלו כצפות באופן חופשי בתרבית סספנסיה בהגדלה גבוהה. ניתן לראות מיקרו-קוצים בולטים מהנוירוספירות; הנוירוספירות מתרבות, כפי שמעיד צביעה חיובית ל-KI 67, כאשר הנוירוספירות פוּרקו ונזרעו בבארים מצופות ב-matrigel. בנוסף, הן יבטאו בעיקר nestin, המהווה סמן לתאי אב עצביים.

בעקבות הליך זה, ניתן להוסיף גורמים אקסוגניים לתאים המגודלים כדי לעודד דיפרנציאציה. ניתן גם להשתיל את תאי הגזע העצביים הבוגרים או את צאצאיהם במודלים שונים של בעלי חיים כדי להעריך את יכולתם לשיקום רגנרטיבי. אני מקווה שסרטון זה יהיה לכם לעזר, ובהצלחה בניסוייכם.