מערכת ג'ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את מאפייני הנדידה של תאים בסביבות תלת מימדיות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית. זה מושג תחילה על ידי זריעת תאים בג'ל קולגן פנימי שלאחר מכן סגור בג'ל קולגן חיצוני נטול תאים עם תכונות המטריצה הרצויות. לאחר מכן, התאים מורשים לפלוש ולנדוד בג'ל החיצוני שבמהלכו ניתן לנטר אותם ולנתח אותם כמותית.

בסופו של דבר, בדיקת ג'ל קונצנטרית זו משמשת כדי להראות כיצד התנהגות נדידת התאים מושפעת מהתכונות הביופיזיקליות של המטריצה החוץ-תאית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו בדיקת העברה או בדיקת שריטות, הוא שנדידת התא מתרחשת בסביבת אמנה רלוונטית פיזיולוגית שקל מאוד לשלוט בתכונותיה המבניות והביופיזיקליות. הדגמה חזותית של שיטה זו חיונית למדי מכיוון שהיווצרות מערכת הג'ל הפנימית של הנתב המרוכז עדינה למדי.

ממשק ג'ל נכון חשוב מאוד להצלחת הניסוי הזה, שלפעמים יכול להיות קצת מאתגר להשגה. התחל בתרבית של תאי MD MBA 2 31 מוכנים לקציר מצלוחיות T 25 בשטף של 80%. טריפסין ראשון הוא התאים המשתמשים במיליליטר תמיסה לכל בקבוק.

לאחר מכן אספו את התאים ככדור תוך שימוש בכוח של 200 גרם למשך ארבע דקות, השליכו את החטיפה והשעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של תרבית. מדיה. כעת מדוד את צפיפות התאים באמצעות ציטומטר המו וקבע את הנפח הדרוש ל-100 מיליון תאים למיליליטר. ואז סובב את התאים ב -200 גרם למשך ארבע דקות.

הסר את הסופרנטנט והשהה היטב את הגלולה לנפח הנדרש של מדיום תרבית ללא סרום. מתלה זה הוא פי 10 מריכוז הישיבה הסופי. כדי להתחיל לאסוף את תמיסות המלאי הנדרשות בדלי קרח, הם כוללים 10 מים חלביים XPBS, ו-0.1 נתרן הידרוקסיד מולארי.

כמו כן, יש לקרר כמה צינורות מיקרו צנטריפוגות מתחת למכסה המנוע, תוך שמירה על טכניקה סטרילית, להוציא את כמות הקולגן הרצויה ל-50 מיקרוליטר של 2.4 מיליגרם לתמיסת ג'ל פנימית של מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו לאט לאט חמישה מיקרוליטרים של 10 XPBS לקולגן הנמדד. סובב את הצינור עם הוספת ה-PBS, אך הימנע מיצירת בועות.

לאחר מכן, התאם את ה-pH של התערובת ל-7.4 עם תמיסת הבסיס. בדרך כלל חמישה מיקרוליטר יעשו את העבודה. מדריך לפתרון בעיות מסופק בפרוטוקול הטקסט.

לבסוף, הביאו את הנפח ל-45 מיקרוליטר עם מדיום תרבית ללא סרום והשאירו מקום לתרחיף 10 x תאים. כדי להתחיל, הוסף חמישה מיקרוליטרים של תרחיף תאים 10 x לתמיסת הקולגן והשהה מחדש את התאים ביסודיות בתמיסה מבלי ליצור בועות אוויר. כעת לצלחת תחתונה מחוממת לזכוכית, הוסף 20 מיקרוליטר מהמתלה למרכז.

ובכן, יצירת טיפה בצורת כיפה אם נוצרת בועה, קרעו אותה במהירות או שאבו אותה מבלי לעשות בלגן. יציקת הג'ל בצורה הנכונה יכולה להיות מסובכת מאוד, במיוחד עם פתרונות צמיגים מאוד כמו קולגן. נסו להימנע ככל האפשר מייצור בועות ואל תסובבו את התמיסה ברגע שהיא מוכנה לפילמור, מכיוון שנפיחות עלולה לגרום ליישור סיבים מלאכותיים.

כעת החזירו את המנה לחממה למשך 45 דקות כדי לתת לשכבה הפנימית להתפלמר 15 דקות לפני סיום הדגירה. הכן 200 מיקרוליטר תמיסת ג'ל קולגן חיצונית על קרח. ראשית, ציטט את הנפח הנדרש של קולגן מלאי.

שנית, הוסיפו לאט לאט 20 מיקרוליטר של 10 XPBS עם מערבולת עדינה. לאחר מכן התאם את ה-pH ל-7.4 כמו קודם, והביא את התמיסה עד 200 מיקרוליטר עם מי Milli Q. כעת הוציאו את המנה מהחממה והוסיפו בעדינות 180 מיקרוליטר מתמיסת הג'ל החיצונית על גבי כיפת הג'ל הפנימית.

זה אמור לכסות לחלוטין את התמיסה הפנימית ולמלא את הבאר. אין לערבב את התמיסה ולהימנע מלגעת בתמיסת הג'ל הפנימית. אם נוצרת בועה בזמן פליטת התמיסה החיצונית, מהר לקרוע אותה או למצוץ בחזרה לתוך הפיפטה.

צעד חשוב נוסף הוא לוודא שמתקבל ממשק ג'ל מתאים. המפתח לשלב זה הוא להוסיף את תמיסת הג'ל החיצונית. כאשר הג'ל הפנימי עדיין לא אושר.

קינטיקה של הג'ל יכולה להשתנות בהתאם למצב הפילמור וחיוני לייעל מצב זה מראש כדי לתת לג'ל החיצוני להתפלמר החזר את המנה לחממה למשך 45 דקות. לאחר 45 דקות, הג'ל צריך להיות מוצק למדי, אך עדיין ניתן לעקור אותו בזהירות, להוסיף שני מיליליטר של מדיום חם כדי לטבול את הג'ל במלואו. זה משלים את תרבות הג'ל הקונצנטרית המסופקת מדיום טרי כל יומיים-שלושה.

תוך ימים, תאים יתחילו לנדוד לתוך המטריצה החיצונית כדי לצפות בנדידתם, לצבוע את התאים בגשש פלואורסצנטי. החלף את שני מיליליטר המדיום במדיום טרי המכיל חמישה מיקרוליטר צבע ודגירה למשך 30 דקות לאחר תקופת הדגירה, שטוף את התרבית באמצעות מיליליטר אחד של PB S3 פעמים למשך שתיים-שלוש דקות לכל שטיפה. לאחר השטיפות, מלאו את הכלי במדיה רגילה.

לאחר מכן הניחו את המנה על מיקרוסקופ מבוקר סביבה. כעת השתמש בהגדרת נפח שימוש כדי לסרוק את אזורי הג'ל החיצוניים ליד ממשק הג'ל. בדרך כלל סרוק בתצוגות מרובעות של 647 מיקרון בעובי של 100 מיקרון, תוך שימוש במרווחים של חמישה מיקרון בערימת ZS.

לאחר מכן סרוק את אזורי הביניים ולבסוף סרוק את פאתי הג'ל. אל תכלול אזורים בטווח של 50 מיקרון מהמשטחים התחתונים, העליונים או הצדדיים כדי למנוע תאים שעלולים לסבול מאפקט קצה. כדי לנתח את תנועת התאים מהנתונים שנאספו, פתח תחילה את קבצי התמונה בתוכנת ניתוח נתונים כגון IMAS.

התחל על-ידי בחירת מעבר הפקודה ולאחר מכן משטח הפקודה. זה מושך את האפשרות לעקוב אחר משטחים. עם הזמן, בחר את אזור העניין בתוך מערך הנתונים, כלומר הקואורדינטות הקרטזיות ומסגרת הזמן.

לאחר מכן, הפחיתו את הרקע מאזור העניין. כדי למנוע אובדן תא עקב הסרת הרקע, בחר את הכדור הגדול ביותר שמתאים לעצם. כעת, פצל את האובייקטים המחוברים על ידי בחירת קוטר נקודת הזרע והמשך לסווג את כל נקודות הזרע.

השלב הבא הוא לסווג את המשטח עכשיו באופן ידני. קבץ נקודות זרע המצביעות על אותו אובייקט. עשה זאת בין כל נקודות הזמן באזור העניין.

לבסוף, עקוב אחר האובייקטים לאחר השלמת המעקב, סווג את מסלולי האובייקטים ולאחר מכן פלט את מערך הנתונים הכמותיים לניתוח באמצעות גיליון אלקטרוני. לאחר מספר ימים של תרביות ג'ל קונצנטריות, תאים פרצו את ממשק הג'ל החיצוני הפנימי והחלו לפלוש לג'ל החיצוני. אוכלוסיית התאים התפשטה החוצה בכיוון רדיאלי בעיקר.

הושוותה תנועת התאים בג'ל החיצוני של צפיפויות קולגן שונות. ההדמיה בוצעה במשך שמונה שעות, וכ-200 מסלולי תאים חושבו מכל דגימה. תאים במטריצה הדקה ביותר נעו במרחק הקטן ביותר.

חישוב זה לקח בחשבון את כל התאים, לא רק את התאים הנודדים רדיאלית החוצה. בכל המקרים, המרחק הכולל שעברתי היה גדול מהתזוזה נטו. כצפוי התמדה חושבה כיחס בין תזוזה למרחק.

ערך ההתמדה של 0.4 מצביע על כך שלתאים אלה הייתה נדידה כיוונית חלשה באופן מהותי. חישובי מהירות ממוצעת הראו שצפיפות הקולגן לא השפיעה על מהירות התאים. יתכן שגודל נקבוביות המטריצה וצפיפות הקולגן, הקשורים זה לזה, השפיעו הפוך על מהירות הנדידה ובכך קיזזו זה את זה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות מערכת ג'ל קונצנטרית וכיצד לחקור את נדידת התאים הזו בסביבה תלת מימדית. בעקבות ההליך הזה, אתם יכולים לעשות הרבה דברים אחרים כמו מיצוי תאים, ניתוח מיקרו-מערך, שבו אתם יכולים לנסות לענות על שאלות נוספות כמו כמה חלבונים מסוימים מתבטאים במהלך נקודות זמן שונות בנדידה.