Name: מערכת גל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: למדו את תכונות הנדידה של תאים בסביבות תלת-ממדיות באמצעות מערכת ג'ל קונצנטריים. שיטה זו מאפשרת ניטור וניתוח כמותי של השפעת תכונות המטריקס החוץ-תאי על התנהגות התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים W. שמש וק Jansen לדיונים הביקורתיים, ומכירים תמיכה על ידי מעבדת ביומכניקה Nano באוניברסיטה הלאומית של סינגפור. NAK מודה תמיכה על ידי מארי קירי IIF מלגה.

קציר 1. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג MD-MBA-231 תאים מ37 ° C, החממה 5% CO 2. ניתוק תאים מצלחת תרבית רקמה באמצעות 0.5% פתרון טריפסין- EDTA. השתמש 1 מיליליטר של תמיסת טריפסין-EDTA לתאים בתרבית בבקבוק T25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה בצינור חרוטי 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב × 200 גרם במשך 4 דקות, לשאוב supernatant, ותאי resuspend ב 5 מיליליטר של תקשורת בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור צפיפות תאים, ρ, באמצעות hemocytometer. הערה: כדי להכין את הג&#39;ל הפנימי התא-זרע, ההשעיה התא תהיה בהמשך להיות מדולל 10 × להגיע צפיפות זריעת תא הסופית. לכן, נדרש 10 × השעיה תא מרוכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את נפח הבינוני הנדרש כדי להשיג ריכוז 10 × תא: <img alt="משוואת 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq1.jpg" width="175" /> הערה: צפיפות זריעת תא סופית, ג סופי, של כ 215; 10 6 תאים / מיליליטר מומלץ לMD-MBA-231 תאים ומשמש בפרוטוקול זה. צפיפות זריעה אחרת גם יכולה להיות חוקרים לסוגי תאים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה עוד פעם אחת בצינור חרוטי 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב × 200 גרם במשך 4 דקות, ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בכמות הנדרשת (מדיום V מחושבים בשלב 1.3) של מדיום תרבית תאים ללא סרום ביסודיות כדי למזער clumping תא. הערה: פנול אדום הוא auto-ניאון, ויכולים להפריע להדמית הקרינה / החזרה. שימוש במדיום ללא פנול אדום עשוי להיחשב להשגת איכות תמונה הטובה ביותר. </li></ol> 2. הכנת פתרונות קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את פתרון קולגן המניות, 10 × חיץ PBS, מילי-Q H 2 O, 0.1 M NaOH, וכמה צינורות microcentrifuge. שמור את כל על קרח כדי למנוע פילמור קולגן המוקדם, ולשמור על מצב סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן זכוכית סטריליתצלחת תחתית על ידי ההתחממות מראש בחממת 37 ° C. הערה: כל הכרכים בפרוטוקול זה כבר מותאם למנת זכוכית תחתונה עם 12 מ&quot;מ גם. אם נעשה שימוש בסוג מנה אחר, להתאים את הכרכים בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הנפח הנדרש הדרוש כדי להכין 50 μl של 2.4 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון קולגן לג&#39;ל הפנימי (אני פתרון) המבוסס על מניית קולגן הריכוז. הערה: ניתן להשתמש גם בריכוזי קולגן אחרים לג&#39;ל הפנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבת סטרילית (בדרך כלל מכסה המנוע בטיחות ביולוגי), להוסיף באיטיות 5 μl של 10 × חיץ PBS לכמות הנדרשת של מניות פתרון קולגן (מחושבת בשלב 2.3) עם מתערבל עדין. תשמור על עצמך, כדי למנוע היווצרות בועת אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH של התערובת ל -7.4 באמצעות 0.1 M NaOH באמצעות pH מטר מכויל. כמדריך גס, השתמש כ -5 μl להביא קרוב pH 7.4 (הסכום משתנה בהתאם לריכוז המניות וpH). הערה: שים לב שהכרכים מעורבים בזההצעד קטן מדי לשימוש במד pH סטנדרטי. השתמש באחד הטריקים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות קולגן לדוגמאות רבות. התאם את ה- pH בכמות גדולה באמצעות מד pH סטנדרטי ולהפיץ את פתרונות קולגן פני הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לשנות את ה- pH של פתרון קולגן בנפח גדול יותר (i. דואר., נפח המאפשר שימוש במד pH סטנדרטי). שים לב לכמות של NaOH הדרוש כדי להביא את ה- pH ל pH הסופי. להקטין את הכמויות ולהשתמש בכמות המתאימה של NaOH לניסוי. אשר את ערך ה- pH משתמש בנייר לקמוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרת, להשתמש אלקטרודת מיקרו כדי להתאים את ה- pH של כמויות קטנות באופן מדויק יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את הפתרון להיקף של 45 μl באמצעות H 2 O. לבצע את כל הצעדים על קרח כדי למנוע פילמור קולגן המוקדם. </li></ol> 3. כינונה של קונצנטריים ג&#39;ל תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צלחת הזכוכית תחתונה המחוממת מראש (ראה שלב 2.2) מהחממת דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של ההשעיה 10 × המרוכז התא (מוכנה בשלב 1.5) לפתרון I. Resuspend ביסודיות. תשמור על עצמך, כדי למנוע היווצרות בועת אוויר. התערובת עכשיו יש נפח של 50 μl ומכילה את הריכוז הסופי קולגן (2.4 מ&quot;ג / מיליליטר) וצפיפות תאים (c = 2 × 10 6 תאים / מיליליטר סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של הפתרון המכיל תאים שאני לאט לאט למרכז היטב, כך שהיא מהווה טיפה (איור 1 א) בצורה כיפה. תשמור על עצמך כדי למנוע היווצרות בועה בשלב זה. אם צורות בועה, בזהירות אבל במהירות מנסה גם לפגוע בו או למצוץ אותו החוצה באמצעות קצה פיפטה. מניח בעדינות את הצלחת בחזרה בחממה כדי לאפשר את הג&#39;ל הפנימי פלמר במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן O פתרון (לג&#39;ל קולגן החיצוני, acellular) כ -15 דקות לפני תום שלב דגירה זה. הערה: מצב ג&#39;ל החיצוני יכול להיות מגוון במונחים של ריכוז קולגן וpH פילמור ללהשיג ברשתות עם microstructures שונה 10. בפרוטוקול זה, יתמקד ב1.5-4.0 מ&quot;ג / מיליליטר ג&#39;ל קולגן polymerized בpH של 7.4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתבסס על מניית קולגן הריכוז, לחשב את הנפח הנדרש הדרוש כדי להכין 200 μl של O פתרון קולגן בריכוז הסופי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של 10 × PBS חיץ לאט את הכמות הנדרשת של מניות פתרון קולגן (מחושב בשלב 3.4) עם מתערבל עדין. התאם את ה- pH של התערובת לpH הסופי באמצעות 0.1 M NaOH עם השימוש של pH מטר מכויל. ראה הערה לצעד 2.5 לגבי התאמת pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את הפתרון לנפח סופי של 200 μl באמצעות H 2 O. לבצע את כל הצעדים על קרח כדי למנוע פילמור קולגן המוקדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצלחת מן החממה לאחר 45 דקות של פילמור ג&#39;ל הפנימי (ראה שלב 3.3). בעדינות להוסיף 180 μl של O פתרון על גבי ג&#39;ל הפנימי, כך שהפתרון מכסה לחלוטין פנימיג &#39;ומתמלא היטב (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שלב זה בזהירות מבלי ערבוב הפתרון, אשר יכול להוביל לכיווני סיבים לא אחידים בג&#39;ל החיצוני. תשמור על עצמך כדי להימנע מלגעת בג&#39;ל הפנימי עם קצה פיפטה, וכדי למנוע את היווצרותן של בועות או כיסי אוויר. אם צורות בועה, בזהירות אבל במהירות מנסה גם לפגוע בו או למצוץ אותו החוצה באמצעות קצה פיפטה. מניח בעדינות את הצלחת בחזרה בחממה כדי לאפשר לפלמר ג&#39;ל החיצוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצלחת מן החממה לאחר 45 דקות של פילמור. ג&#39;ל צריך להיות כבר התגבש למדי בשלב זה, למרות שהוא עדיין יכול להתנתק מהמשטח התחתון אם טופל בגסות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות יוצק 2 מיליליטר של מדיום תרבית תאים חימם לצלחת (איור 1 ג). לוודא כי ג&#39;ל הוא שקוע לחלוטין בטווח הבינוני. רענן הבינוני כל 2-3 ימים לכל אורכה של התרבות. </li></ol></li></ol> 4. Live- תא הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך מצוידים ביכולת Live- תא הדמיה לטווח ארוך. כולל מובנה בתא דגירה עם טמפרטורה (37 ° C) ובקרת CO 2 (5%). לעבור על המיקרוסקופ ולחמם את הבמה שעה לפחות 1 לפני תחילת הניסוי. הערה: עדשה אובייקטיבית שימוש עם מרחק עבודה ארוך כדי לייעל את התצפית ולוקליזציה של תאים בג&#39;לים 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ג&#39;ל במדיום המכיל 5 μl של צבע גשש תא ניאון למשך 30 דקות כדי לאפשר לוקליזציה מדויקת של התאים במערכת 3D. בהמשך לכך, להסיר צבע מאוגד על ידי שטיפה שלוש פעמים עם 1 × PBS. לאחר מכן, להוסיף בינוני תרבות תאים לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצלחת מן החממה ולמקם אותו על הבמה מיקרוסקופ (1D איור). הערה: הדמיה תא חי יכולה להתחיל בעיקרון מייד לאחר פילמור של ג&#39;ל החיצוני. עם זאת, בשלב זה, התאים in ג&#39;ל הפנימי לא התפשט עדיין. כדי לבחון את ההגירה של התאים הראשונים שפלשו ג&#39;ל החיצוני, Live- תא הדמיה יכולה להתחיל 24 שעות (תלוי בסוג התא) לאחר תחילתה של התרבות. כמדריך גס, סביב 12 - 14 ימים של התרבות יש צורך ברוב של התאים בג&#39;ל הפנימי להיכנס לג&#39;ל החיצוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כרכים נבחרים של צפה (vov של) באזורים בג&#39;ל החיצוני המקיף את הג&#39;ל הפנימי. לאחר 24 שעות של דגירה, אוכלוסיית התא התפשטה, חצה את הממשק בין ג&#39;לי הפנימי וחיצוני, והתחיל לפלוש ג&#39;ל החיצוני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לvov של, כוללים אזורי ג&#39;ל מייד ליד ממשק ג&#39;ל, אזורי ביניים, והאזורים הקרובים לoutskirt של ג&#39;ל החיצוני 7. לא לכלול אזורים קרובים מ -50 מיקרומטר מהמשטחים התחתון וצד, כמו גם מהחלק העליון של ג&#39;ל, כדי למנוע תופעות קצה אפשריות. כל vov בדרך כלל מודד 647 × 647 × 100 מיקרומטר 3 (בx, Y, z וכיוונים, בהתאמה), עם מרווח של 5 מיקרומטר -stack z. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאו מצבי הדמיה, ערוצים / מסננים, זמני חשיפה, והחלטות תמונה נבחרות בצורה נכונה. עבור הדמיה ללא תווית של רשת קולגן, להשתמש במיקרוסקופ ההחזרה confocal בו-זמנית בLive- תא ההדמיה הזמן לשגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות לדוגמא, העלילה היסטוגרמות העצמה, ולהתאים את הרווחים וקיזוזים להתבונן אות מספיק ולמנוע הרוויה על ידי הבטחה כי היסטוגרמה נמצאת בין אפס והעוצמה מקסימלית. אין לשנות הגדרות אלה יותר לאורך כל תקופת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות של vov של נבחר זמן לשגות, עם מרווח זמן, t Δ, של 10 דקות במשך 8 שעות (או יותר במידת צורך). </li></ol> 5. מעקב סלולארי וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע לאחר עיבוד תמונה כמותי מתמונות -stack z באמצעות appropria<html> תוכנת עיבוד תמונת te. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטע הזמן לשגות תמונות כדי לבחור את עמדות תא 3D ב( x, y, z, t) באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל מסגרת, לבדוק באופן ידני את דיוק הלוקליזציה ולהסיר חיוביים שגוי בשל פסולת תא ובליטות סלולריות שעשויים להיחשב בטעות לתאים. הסרת תאי שגשוג מהניתוח והתאים חופפים או קשורים פיצול לאובייקטים שונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור מסלולי תא הזמן לשגות 3D מקואורדינטות התא (x, y, z, t) שהושגו בשלב הקודם על ידי קישור למיקום של כל תא ברצף הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל את הרעש אקראי ומערכת על ידי הסרת מסלולים קצרים יותר מאורך מסלול סף (בדרך כלל 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן את סחיפת מדגם על ידי הפחתת ההתקות נטו הכולל מהמסלולים במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב תזוזת תא,Iles / ftp_upload / 52,735 / 52735eq2.jpg &quot;width =&quot; 80 &quot;/&gt;, ומרחק נדידת תאים, <img alt="משוואה 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq3.jpg" width="100" /> , ממסלולי התא הנצפים, שבו הוא וקטור המייצג את מיקום 3D של תא בזמן והוא המספר הכולל של נקודות זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מהירות תא כS = ד / (t Δ • n), כאשר t Δ הוא את מרווח הזמן בין מסגרות. לחשב יווני נדידת תאים (או התמדה) באמצעות P = Δd / ד. מדד פשוט זה של התמדה מרמז כי לP = 0 העקירה נטו היא אפס ולP = 1 המסלול הוא קו ישר כיוונית. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Horwitz, R., Webb, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+three-dimensional+collagen+matrices+to+provide+contact+guidance+during+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration.</a> Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).</li>
<li>Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+dimensions+in+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">New dimensions in cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 743-747 (2012).</li>
<li>Grinnell, F., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+and+mechanics+in+three-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).</li>
<li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+cancer%3A+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li>
<li>Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+migrating+cell-induced+matrix+reorganization+on+3D+cancer+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).</li>
<li>Achilli, M., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+mechanical+properties+of+collagen-based+scaffolds+for+vascular+tissue+engineering%3A+the+effects+of+pH%2C+temperature+and+ionic+strength+on+gelation%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation.</a> Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).</li>
<li>Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stiffening+and+softening+of+collagen%3A+interplay+of+deformation+mechanisms+in+biopolymer+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks.</a> Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).</li>
<li>Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+adaptability+of+cancer+cells+strongly+affects+anti-migratory+drug+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638(2014).</li>
<li>Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+fibrillar+matrix+architecture+on+tumor+cell+invasion+of+physically+challenging+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments.</a> Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+limits+of+cell+migration%3A+control+by+ECM+space+and+nuclear+deformation+and+tuning+by+proteolysis+and+traction+force%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force.</a> J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration%3A+a+mechanistic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration: a mechanistic perspective.</a> Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).</li>
<li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+versus+directionally+persistent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li>
<li>Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+regulation+of+cell+motile+activity+through+matrix+stiffness+and+porosity+in+three+dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices.</a> Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).</li>
<li>Mouw, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+mechanics+modulate+microRNA-dependent+PTEN+expression+to+regulate+malignant+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression.</a> Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li>
<li>Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -P., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+microrheology+of+heterogeneous+biopolymer+hydrogels+using+covalently+bound+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomech.+Model.+Mechanobiol%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres.</a> Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).</li>
<li>Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+feedback+between+actomyosin+and+focal-adhesion+systems+optimizes+rapid+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration.</a> Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).</li>
<li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+Rho%2FROCK-dependent+matrix+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).</li>
<li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

בפרוטוקול זה אנו מתארים מבחן חוץ גופי לחקר התנהגות הנדידה התלת-ממדית של תאים בסביבות מטריצה הדומות טופולוגית ל-ECMs שנתקלו בהם in vivo. ישנן שלוש נקודות חוזק עיקריות של בדיקה זו בהשוואה לשיטות אחרות הזמינות כיום. ראשית, בדיקה זו מאפשרת לבחון בו זמנית את מנגנוני נדידת התאים הן ברמת האוכלוסייה והן ברמת התא הבודד. זה פותח אפשרויות לחקור נדידת תאים קולקטיבית13, שעד כה הוגבלה במידה רבה למבחנים דו-ממדיים14, תוך התבוננות בהתנהגות התא הבודד בתוך האוכלוסייה. עבור תאים שאינם נודדים באופן טבע...

נדידה של תאים ממלאים תפקיד מרכזי בתגובות פיסיולוגיות שונות כגון התפתחות עוברית, haemostasis, ותגובה חיסונית, כמו גם בתהליכים פתולוגיים כגון מחלות לב וכלי דם, דלקת, וסרטן 1. לנתח את הגורמים ביוכימיים וbiophysical יסוד נדידת תאים ולכן חשוב ביסודו לא רק כדי להבין את העקרונות הבסיסיים של פונקציות סלולריות, אלא גם לקידום יישומים ביו-רפואיים שונים, כגון בהנדסת רקמות, אנטי-גרורות ופיתוח תרופות אנטי-דלקתי. מאז תצפית in vivo היא מאתגרת מבחינה טכנית, הרבה מאמצים התמקד בסיכום במבחנה של נדידת תאים. בשיטות מבחנה ללמוד נדידת תאים במידה רבה תוכננו עבור מבחני על שני משטחים ממדיים (2D), שהבולטים בם השריטה או פצע ריפוי assay 2. מבחני כאלה מציעים התקנה ניסיונית פשוטה, קל live-הדמיה תא, ולספק תובנות שימושיות למנגנונים ביוכימיים שונים שבבסיס נדידת תאים. עם זאת, מבחני אלו אינם מהווים מטריצת ארכיטקטורה תאית (ECM) ושיפוץ, שהם היבטים קריטיים בהבנה בהגירה vivo. לאחרונה, זה כבר מוערך יותר ויותר כי מודל תרבות 3D, לעתים קרובות במטריצות מבוססות קולגן 3, מספק פלטפורמה שיותר דומה למצב בvivo. ואכן, תאי תערוכת דינמיקת migrational כי הם שונים מאלה על משטחי 2D, בעיקר בשל ממדית של הסביבה 4 השונים. יתר על כן, את מאפייני biophysical ומכאניים של מטריקס ברגישות משפיעים תא הגירה 5, כוללים בהקשר של תאים סרטניים פלישה 6. כאן, אנו מציגים שיטה ללמוד 3D נדידת תאי התנהגות בECM עם מאפייני biophysical שיכול להיות בקלות מגוונת עם תנאי הכנה. התאיםזורעים ב&quot; ג&#39;ל הפנימי &quot;ולאפשר להם להימלט וללפלוש&quot; ג&#39;ל החיצוני &quot;בתחילה acellular. השיטה מסתמכת על יכולתו של התא להכיר בנוכחותו של, ונטייה להגר ל, אזורי תא ללא בג&#39;ל החיצוני, אשר קשור באופן הדוק לתא mechanosensing 7. במחקר זה, אנו מעסיקים רשתות קולגן כECMS פלש על ידי תאי סרטן השד פולשני מאוד, MD-MBA-231. יכולים להיות מכוון הנכסים ומייקרו של שני ג&#39;לים הפנימיים וחיצוניים מכאניים 8 ומאופיינות 9 כדי להשיג תנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. שחזור וניתוח של מסלולי התא מאפשרים בדיקה כמותית מפורטת של הגירת התנהגות spatiotemporal בשתי רמת האוכלוסייה ורמת תא בודדת. חשוב לציין, ההתקנה של מערכת ג&#39;ל קונצנטריים מחקה את in vivo טופולוגיה הרקמה מתמודדת על ידי תאים נודדים, במיוחד פולשים תאים סרטניים, ובכך להציע תובנות חשובות בלמנגנונים הפיזיים של נדידת תאים וגרורות.

<table><tbody><tr><td>חממת תרביות תאים</td><td>Fisher Scientific Pte Ltd</td><td>דגם: 371, S/No 318854-6055</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Nikon A1R</td><td></td><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי הפוך מצויד בתא חממה</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td> <td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>צבע CellTracker פלואורסצנטי CMTMR</td><td>Life Technologies</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תחתית זכוכית</td><td>IWAKI Cell Biology</td><td>3931-035</td><td>צלחת בקוטר 35 מ"מ עם באר תחתית זכוכית בקוטר 12 מ"מ</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>iN CYTO</td><td>DHC-N01 (Neubauer Improved)</td><td></td></tr> <tr><td>מד pH של מיקרו-מעבד</td><td>Hanna Instruments</td><td>pH 211</td><td></td></tr><tr><td>Nutragen קולגן</td><td>מתקדם BioMatrix</td> <td>#5010-D</td><td>קולגן בקר מסיס בחומצה מסוג I (מלאי pH ~ 2)</td></tr> <tr><td>עדשת אובייקטיבית</td><td>Nikon</td><td></td><td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9 מ"מ, NA 0.45.</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>מד pH</td><td>Sartorius</td><td>S/No 29153352</td><td>מד pH בסיסי PB-11</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr></tbody></table>

מערכת ג&#39;ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3d

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

היכולת של תאים לנדוד היא חיונית במגוון רחב של פונקציות תא לאורך כל חיים מהתפתחות עוברית וריפוי פצעים לגידול וגרור סרטני. למרות מאמצי מחקר אינטנסיביים, העקרונות ביוכימיים וbiophysical הבסיסיים של נדידת תאים עדיין לא הבינו באופן מלא, במיוחד במייקרו-הסביבות הרלוונטיות מבחינה פיזיולוגית תלת ממדי (3D). כאן אנו מתארים assay במבחנה נועד לאפשר בחינה הכמותית של התנהגויות נדידת תאי 3D. השיטה מנצלת את יכולתו של התא mechanosensing ונטייה לנדוד לתוך מטריצה ​​פנויה בעבר תאי (ECM). אנו משתמשים בפלישה של תאי סרטן השד פולשני מאוד, מד&quot;א MB-231, ג&#39;ל קולגן כמערכת מודל. התפשטות אוכלוסיית תא ודינמיקת ההגירה של תאים בודדים מעל שבועות של התרבות ניתן לנטר באמצעות Live- תא הדמיה וניתחו כדי לחלץ נתונים spatiotemporally נפתרו. יתר על כן, השיטה היא להתאמה בקלות למטריצות תאית מגוונות, ובכך להציע דרך פשוטה אך רבת עוצמה כדי לחקור את תפקידם של גורמי biophysical במייקרו-הסביבה על נדידת תאים.

Assay ג&#39;ל קונצנטריים מוצג כאן בוצע באמצעות תאי סרטן השד פולשני מאוד, מד&quot;א MB-231, עם 2.4 מ&quot;ג / מיליליטר ג&#39;ל קולגן הפנימי וצפיפות זריעת תא של = 2 × 10 6 תאים / מיליליטר, כדוגמא. כפי שניתן לראות באיור 2, בדרך כלל אחרי כמה ימים של תרבות, תאי הפר ממשק ג&#39;ל הפנימי-חיצוני והתחילו לפלוש ג&#39;ל החיצוני. אוכלוסיית התא התפשטה בעיקר רדיאלית החוצה. תנאי פילמור של ג&#39;ל החיצ...

הנכסים ומייקרו של המטריצה ​​תאית מכאניים מאוד משפיעים על הגירת 3D של תאים. שיטה במבחנה ללמוד spatiotemporal התנהגות נדידת תאים בסביבות biophysically משתנים, בשתי רמות אוכלוסייה ותא בודדות, מתואר.

מערכת ג&#39;ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור את מאפייני הנדידה של תאים בסביבות תלת-ממדיות הרלוונטיות מבחינה פיזיולוגית. זאת משיגים תחילה על ידי זריעת תאים בתוך ג'ל קולגן פנימי, אשר עטוף לאחר מכן בג'ל קולגן חיצוני נטול תאים בעל תכונות מטריקס רצויות. לאחר מכן, מאפשרים לתאים לפלוש ולנדוד בתוך הג'ל החיצוני, במהלכו ניתן לנטר אותם ולנתח אותם באופן כמותי.בסופו של דבר, בדיקת הג'ל הקונצנטרית זו משמשת להדגמה כיצד התנהגות נדידת תאים מושפעת מהתכונות הביופיזיקליות של המטריצה החוץ-תאית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת העברה (transfer assay) או בדיקת שריטה (scratch assay), הוא שנדידת התאים מתרחשת בסביבת טיפול רלוונטית פיזיולוגית, שאת תכונותיה המבניות והביופיזיקליות קל מאוד לשלוט בהן. הדגמה חזותית של שיטה זו היא חיונית למדי, כיוון שיצירת מערכת הג'ל הפנימית הקונצנטרית היא עדינה מאוד.ממשק ג'ל תקין הוא קריטי להצלחת ניסוי זה, ולעיתים השגתו עשויה להיות מאתגרת. התחל עם תרבית של תאי MD MBA 2 31 המוכנים לקציר מבקבוקי T 25 ב-80% co fluency. ראשית, בצע trypsin לתאים באמצעות מיליליטר אחד של תמיסה לכל בקבוק.לאחר מכן, אספו את התאים כמשקע באמצעות כוח צנטריפוגלי של 200 G למשך ארבע דקות, השליכו את הנוזל העליון ותלו את התאים מחדש בחמישה מיליליטר של מצע גידול. כעת, מדדו את צפיפות התאים באמצעות המוציטומטר וקבעו את הנפח הדרוש להשגת 100 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, סובבו את התאים ב-200 G למשך ארבע דקות.הסיר את הנוזל העליון (supernatant) והשב את המשקע (pellet) באופן יסודי לנפח הנדרש של מצע גידול נטול סרום. תרחיף זה הוא בריכוז הגבוה פי 10 מהריכוז הסופי של הזריעה. ראשית, אסוף את תמיסאות המקור הנדרשות לדלי קרח; אלו כוללות 10 XPBS, מים מזוקקים ו-0.1 molar sodium hydroxide.כמו כן, קררו מספר מבחנות מיקרו-צנטריפוגה תחת מנדף, תוך שמירה על טכניקה סטרילית, וחלקו למנות (aliquot) את כמות הקולגן הדרושה עבור 50 µL של תמיסת ג'ל פנימית בריכוז 2.4 mg/mL. לאחר מכן, הוסיפו לאט 5 µL של 10 XPBS לקולגן שנמדד. סובבו את המבחנה בעוד ה-PBS מתווסף, אך הימנעו מיצירת בועות.בשלב הבא, התאימו את ה-pH של התערובת ל-7.4 באמצעות תמיסת הבסיס. בדרך כלל חמישה µL יספיקו למשימה. מדריך לפתרון בעיות מסופק בטקסט של הפרוטוקול.לבסוף, הגדילו את הנפח ל-45 µL באמצעות מצע גידול נטול סרום, תוך השארת מקום עבור תרחיף התאים בריכוז 10x. כדי להתחיל, הוסיפו חמישה µL של תרחיף תאים בריכוז 10x לתמיסת הקולגן והשעיקו את התאים היטב בתמיסה ללא יצירת בועות אוויר. כעת, הוסיפו 20 µL מהתרחיף למרכזה של פלטה בעלת תחתית זכוכית שחוממה מראש.בזמן יצירת טיפה בצורת כיפה, אם נובעה בועה, פוצצו אותה במהירות או שאבו אותה פנימה מבלי ליצור בלגן. יציקת הג'ל בצורה הנכונה עלולה להיות מאתגרת מאוד, במיוחד עם תמיסות בעלות צמיגות גבוהה כמו קולגן. השתדלו להימנע מיצירת בועות ככל האפשר ואל תערבלו את התמיסה ברגע שהיא מוכנה לפולימריזציה, מכיוון שערבול עלול להוביל ליישור סיבים מלאכותי.כעת החזירו את הצלחת לאינקובטור למשך 45 דקות כדי לאפשר לשכבה הפנימית להתפלמר 15 דקות לפני סיום הדגירה. הכינו 200 µL של תמיסת ג'ל קולגן חיצונית על קרח. ראשית, העבירו את הנפח הנדרש של מלאי הקולגן לאליקוט.שנית, הוסיפו לאט 20 µL של 10 XPBS תוך כדי ערבוב עדין. לאחר מכן, כווןנו את ה-pH ל-7.4 כפי שנעשה קודם לכן, והשלימו את נפח התמיסה ל-200 µL באמצעות מי Milli Q. כעת הוציאו את הצלחת מהאינקובטור והוסיפו בעדינות 180 µL של תמיסת הג'ל החיצונית מעל כיפת הג'ל הפנימית.פעולה זו צריכה לכסות לחלוטין את התמיסה הפנימית ולמלא את הבאר. אין לערבב את התמיסה ויש להימנע ממגע עם תמיסת הג'ל הפנימית. אם נוצרת בועה בעת הזרקת התמיסה החיצונית, יש לפוצצה במהירות או לשאוב אותה חזרה לתוך הפ pipette.שלב חשוב נוסף הוא לוודא שנוצר ממשק ג'ל תקין. המפתח לשלב זה הוא הוספת תמיסת הג'ל החיצונית, בעוד הג'ל הפנימי עדיין אינו קשוח.קינטיקת הג'לציה עשויה להשתנות בהתאם לתנאי הפולימריזציה, וחשוב למשבי אותו תנאי מראש. כדי לאפשר לג'ל החיצוני לעבור פולימריזציה, החזירו את הצלחת לאנקובטור למשך 45 דקות. לאחר 45 דקות, הג'ל אמור להיות מוצק למדי, אך עדיין עשוי להיזוז; הוסיפו בזהירות שני מיליליטרים של מצע חם כדי להטביע את הג'ל לחלוטין. בכך הושלמה תרבית הג'ל הקונצנטרית; ספקו מצע טרי כל יומיים עד שלושה ימים.בתוך מספר ימים, התאים יתחילו לנדוד אל תוך המטריצה החיצונית; כדי לצפות בנדידתם, צבע את התאים באמצעות מעקב פלואורסצנטי. החלף את ה-2 mL של המצע במצע טרי המכיל 5 µL של צבע והדגר למשך 30 דקות. לאחר תקופת ההדגרה, שטוף את התרבית באמצעות 1 mL של PBS‏ 3 פעמים, למשך שתיים עד שלוש דקות לכל שטיפה. לאחר השטיפות, מלא מחדש את הצלחת במצע רגיל.לאחר מכן, הניחו את הצלחת על מיקרוסקופ עם בקרת סביבה. כעת, השתמשו בהגדרת נפח למיסור של אזורי הג'ל החיצוניים הסמוכים לממשק הג'ל. בדרך כלל, סרקו בשדות ראייה של 647 micron ריבוע בגובה 100 microns, תוך שימוש במרווחים של five micron בערימת ה-ZS.לאחר מכן סרקו את האזורים הבינוניים ולבסוף סרקו את קצוות הג'ל. הסירו אזורים הנמצאים בטווח של 50 microns מהמשטחים התחתונים, העליונים או הצדדיים כדי להימנע מתאים שעלולים לסבול מאפקט שוליים. כדי לנתח את תנועת התאים מהנתונים שנאספו, פתחו תחילה את קובצי התמונה בתוכנה לניתוח נתונים כגון imas.התחל בבחירת הפקודה surpass ולאחר מכן הפקודה surface. פעולה זו תפתח את האפשרות למעקב אחר משטחים. עם הזמן, בחר את האזור המבוקש בתוך מערך הנתונים, כלומר את קואורדינטות ה-Cartesian ואת מסגרת הזמן.בשלב הבא, החסיר את הרקע מאזור העניין (ROI). כדי למנוע איבוד של תא במהלך הסרת הרקע, בחר את הכדור הגדול ביותר שנכנס בתוך האובייקט. כעת, הפרד את האובייקטים המחוברים על ידי בחירת קוטר נקודת הזרע (seed point diameter) והמשך לסווג את כל נקודות הזרע.השלב הבא הוא לסווג את פני השטח באופן ידני. קבצו נקודות זריעה (seed points) המצביעות על אותו אובייקט. בצעו זאת עבור כל נקודות הזמן באזור העניין (region of interest).לבסוף, עקבו אחר העצמים לאחר השלמת המעקב, סווגו את מסלולי העקיבה של העצמים, ולאחר מכן הוציאו את מערך הנתונים הכמותיים לניתוח באמצעות גיליון אלקטרוני. לאחר מספר ימים של תרביות ג'ל קונצנטריות, התאים פרצו את הממשק בין הג'ל הפנימי לחיצוני והחלו לפלוש לג'ל החיצוני. אוכלוסיית התאים התפשטה החוצה בכיוון רדיאלי בעיקר.בוצעה השוואה של תנועת תאים בג'ל חיצוני בעלי צפיפויות קולגן שונות. הדמיה בוצעה לאורך תקופה של שמונה שעות, וכ-200 מסלולי תנועה של תאים חושבו מכל דגימה. תאים במטריקס הדליל ביותר נעו את המרחק הקצר ביותר.חישוב זה התחשב בכל התאים, ולא רק בתאים הנודדים רדיאלית החוצה. בכל המקרים, המרחק הכולל שעברו התאים היה גדול מההעתקה נטו. כצפוי, ההתמדה (persistence) חושבה כיחס בין ההעתקה למרחק.ערך ההתמדה של 0.4 מרמז כי לתאים אלו הייתה נטייה חלשה מטבעה לנדידה כיוונית. חישובים של מהירות ממוצעת הראו כי צפיפות הקולגן לא השפיעה על מהירות התאים. ייתכן שגודל נקבי המטריקס וצפיפות הקולגן, הקשורים זה בזה באופן הפוך, הפעילו השפעה מנוגדת על מהירות הנדידה ובכך ביטלו זה את זה.לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להגיע להבנה טובה של האופן שבו בונים מערכת ג'ל קונצנטרית וכיצד לחקור את נדידת התאים בסביבה תלת-ממדית. בעקבות פרוצדורה זו, תוכלו לבצע פעולות רבות אחרות, כגון מיצוי תאים וניתוח מזגש זעיר (microarray), שבאמצעותם תוכלו לנסות לענות על שאלות נוספות, כמו רמת הביטוי של חלבונים מסוימים בנקודות זמן שונות במהלך הנדידה.

concentric-gel-system-to-study-biophysical-role-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

תהליכים תאיים כגון נדידת תאים מסורתי נחקרו על דו מימדי, משטחי פלסטיק נוקשה. דו"ח זה מתאר טכניקה ישירות חזותי לוקליזציה חלבון וניתוח הדינמיקה חלבון בתאי נודדות בתוך מטריצה ​​יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית תלת מימדי,.

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

שיטה להרכבה של שיפועים ודבק מסיסים בתא מיקרוסקופי למחקרי נדידת תאי חיים מתוארת. הסביבה המהונדסת משלבת משטחי antifouling ופסי דבק עם שיפועי פתרון ולכן מאפשרת אחת כדי לקבוע את החשיבות היחסית של רמזי הדרכה.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

מאמר זה מציג שיטה לתייג קולגן שניתן להשתמש בו גם תיקון נוסף ולהדמית חיה של תרביות תאי 3D fluorescently. כמו כן אנו מספקים פרוטוקול מותאם לדמיין חלבוני cytoskeletal אנדוגניים של תאים בתרבית בסביבות 3D.

חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D

שיטה כמותית ללימודי הגירה ספונטנית של תאים בmicroenvironment מרותק חד ממדי מתוארת. שיטה זו מנצלת את ערוצי microfabricated והוא יכול לשמש כדי לחקור הגירה של מספר הגדול של תאים בתנאים שונים בניסויים אחת.

חקר נדידת תאים בערוצי Microfabricated

נדידת תאים היא תופעה ביולוגית כי הוא מעורב בשפע של פיסיולוגי, כגון ריפוי פצעים ותגובה חיסונית, ותהליכי pathophysiological, כמו סרטן. Assay הגירת מטריצת 3D-קולגן הוא כלי תכליתי כדי לנתח את מאפייני נדידת תאים מסוגים שונים של מסגרת בסביבה דמוית פיזיולוגית 3D.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

נדידת תאים היא חלק חשוב בהתפתחות ובחיים האנושיים. על מנת להבין את המנגנונים שיכולים לשנות את נדידת התאים, אנו מציגים מערכת דיפוזיה של שיפוע מישורי כדי לחקור כימוטקסיס במטריצת קולגן תלת מימדית, המאפשרת להתגבר על מגבלות תא הדיפוזיה המודרניות של מבחנים קיימים.

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

הפרוטוקול הבא מתאר את ההליך להרכבת תרביות דמויות סנדוויץ' שישמשו כשלב ביניים בין סביבות תאיות דו-ממדיות (2D) ותלת מימדיות (3D). למערכות המהונדסות יכולים להיות יישומים בבדיקות מיקרוסקופיה, ביומכניקה, ביוכימיה וביולוגיה של התא.

כמו כריך microenvironments לרתום ניידים / חומרי אינטראקציות

קולגן הוא רכיב ליבה של ECM, ומספק רמזים חיוניים מספר תהליכים תאיים החל הגירת בידול ושגשוגם. הניתן כאן הוא פרוטוקול להטבעת תאים בתוך הידרוג קולגן 3D, טכניקה מתקדמת יותר ליצירת מטריצות קולגן אקראי או מיושר באמצעות microchannels PDMS.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך את ההשפעה של גורמים פרו - ו אנטי - migratory על נדידת תאים בתוך מטריצה תלת מימדי פיברין.

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

פרוטוקול להערכה כמותית של נדידת תאים תלת מימדיים בתוך ולתוך הממשק של הידרוג'לים גרגירים מוצג כאן.

כימות נדידת תאים תלת מימדית בתוך ובתוך ביו-חומרים הידרוג'ל גרגירים

למדו את תכונות הנדידה של תאים בסביבות תלת-ממדיות באמצעות מערכת ג'ל קונצנטריים. שיטה זו מאפשרת ניטור וניתוח כמותי של השפעת תכונות המטריקס החוץ-תאי על התנהגות התאים.

מערכת ג'ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D

גלה סרטונים נוספים