הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את תפקידה של מאמץ מכני במכנוביולוגיה של תאים בזמן אמת כמעט. דבר זה מושג תחילה על ידי בניית מערכת בעלת ממברנות גמישות שעליהן גדלים תאים ונמתחים. כשלב שני, יש למתוח את הממברנה כדי לכייל את ספירות המנוע מול המתיחה של הממברנה.

בשלב הבא, תאי אפיתל של ריאות עכבר נמתחים והגרעינים מדומיינים. כדי להראות כי מאמץ הממברנה מועבר לתאים, המותחים שולבו לאחר מכן ב-AFM לביצוע ננו-אינדנטציה (nano indentation) במטרה למדוד את הקשיחות של תאים בודדים לפני ואחרי המתיחה. התוצאות מראות נזק ישיר לתאים כתוצאה מהמתיחה שהופעלה.

על בסיס דימוי פלואורסצנציה, הוכח כי ייצור מיני חמצן רעילים (reactive oxygen species) עולה עם מתיחה. שיטה זו יכולה לספק מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה המכנית של הריאה, כגון השאלה האם תאים אפיתליאליים עלולים להיפגע כתוצאה מהנשמה מלאכותית. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הביולוגיה המכנית של תאי ריאה, וניתן להחיל אותה גם על רקמות רכות אחרות, כגון פרוסות של כבד או של לוח הגדילה.

בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה זו יתקשו בשל השילוב הבלתי שגרתי של הכלים המשמשים בניסויים אלה, כגון מיקרוסקופ הכוח האטומי. ראשית, הכינו ממברנת PDMS מצופה קולגן המותאמת לתרבית תאים, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר מכן, זרעו תאי אפיתל של ריאת עכבר בריכוז של 2.5 million cells per well על גבי ממברנה סטרילית, גמישה ומצופה קולגן.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 למשך יומיים עד שהתאים יגיעו למצב של confluence. לאחר מכן, השתמשו במנקב ביופסיה של 1.5 millimeter כדי ליצור שני חורים בכל אחת משש לשוניות התפסן, במרחק של 20.5 millimeter ממרכז המבנה (construct) במידה ואין רצון למתיחה מוקדמת. הסירו את מצע גידול התאים.

ודאו שהמפעיל המכני נמצא במצב של אפס מאמץ (zero strain), ומקמו את הממברנה על המותח כך שחורי הפאנץ' יתאימו לפינים ולתופסנים. מקמו את התופסנים העליונים, ולאחר מכן הדקו את הברגים אחד אחד, לסירוגין בין הצדדים השונים. הוסיפו 1 mL של מצע גידול לתאים לפני הנחת המכשיר עלבמת המיקרוסקופ.

מרכז את המכשיר על נתיב האור. לאחר מכן, קבע את המכשיר לבמה. בצע פוקוס על הממברנה על ידי כיוון המיקומים במישור האופקי ובמישור האנכי של המכשיר המכני באמצעות בקר הבמה של המיקרוסקופ בבלוק הקלט של היעד.

הזינו ערך של ספירת מנוע (motor count), התואם לרמת המתיחה הרצויה ליישום. לאחר מכן, הגדירו את הערך בבלוק קלט המהירות ל-10 RPM או פחות, כדי שניתן יהיה לצפות באותו שדה לפני ואחרי המתיחה, שכן השדה עלול לזוז ביחס לעדשת המיקרוסקופ, וייתכן שיהיה צורך להתאים את במה של המיקרוסקופ במהלך המתיחה. לאחר שהכל הוגדר, לחצו על go.

התחילו בביצוע כיוונונים למיקרוסקופ הכוח האטומי. הגביהו את ראש ה-a FM למצב המקסימלי שלו בציר Z. לאחר מכן, התקינו מאריכים על הרגליים כדי להגביה את המישור שבו קניסור (cantilever) ה-a FM בא במגע עם הדגימה.

בשלב הבא, הסר את לוחית הסורק של ה-A FM ואת העדשה הרצויה מהמיקרוסקופ. הוסף ספייסר (spacer) לעדשה ולאחר מכן התקן אותה שוב על המיקרוסקופ. לאחר מכן, החזר את לוחית הסורק אל ה-A FM. גובה הספייסר יהיה תלוי בעדשה ובמערך ה-A FM הספציפי, אך השימוש בספייסר הכרחי אם ברצונך לבצע דימוי אופטי, כיוון שמישור התצפית יוסט בכיוון Z.

בשלב הבא, הפעל את תוכנת ה-A FM, את תוכנת המיקרוסקופ האופטי ואת כל מקורות האור הדרושים, כולל מקור האור למדידות פלואורסצנציה. התקן על ה-A FM שבב בעל קורת קנטילבר עם קשיחות של 200 pico newtons per nanometers או פחות, לצורך מדידת המודול האלסטי של תאים חיים. לאחר מכן, כוון את הלייזר, התקן כיסוי זכוכית (cover slip) על המכשיר והשתמש בו כדי לכלל את קשיחות הקנטילבר בהתאם להנחיות היצרן. מיד לפני התקנת הממברנה למכשיר המתיחה, גזור את הדפנות לגובה של כ-one millimeter.

פעולה זו מפחיתה את ההפרעות שנוצרות בין דפנות הממברנה לבין תא העומס (load cell). לאחר מכן, הסר את מצע גידול התאים והרכב את הממברנה על ההתקן המכני. מקם את ההתקן המכני עם המתאם על הסורק באמצעות התוכנה.

מתחו את הממברנה לרמת המתיחה הרצויה לפני ביצוע הננו-אינדנטציה. הוסיפו 0.5 מיליליטר או פחות של מצע גידול על התאים כדי לשמור על הידרטציה, אך היזהרו למנוע שפיכה שעלולה לגרום לנזק לסורק ה-FM או למיקרוסקופ. לאחר מכן, הבאי את קורת הקנטילבר למגע עם הממברנה.

יש לעקוב אחר הפרוטוקול של מכשיר ה-AFM הספציפי לסריקת אזורי העניין. כאשר הופעל מאמץ של 20% על תאים שנזרעו על הממברנה, התאים הוזזו ב-20% כפי שמוצג כאן; השפעת התאים על ייצור רדקלי חמצן רבובים (ROS) נמדדה בתאי אפיתל ברונכיאליים באמצעות חיישן מיטוכונדריאלי מצטבר לסופראוקסיד, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. בהיעדר מתיחה מכנית, ייצור ה-ROS לא עלה באופן משמעותי לאורך 60 דקות כאשר הופעלה ונשמרה מתיחה בודדת של 17%.

נרשמה עלייה ב-ROS מיטוכונדריאלי שנמשכה למשך 60 דקות נוספות עם שילוב המותח המכני במיקרוסקופ הכוח האטומי. מודול אלסטיות ומפות של תאי אפיתל מריאה של עכבר לפני ואחרי מאמץ מתיחה של 10% התקבלו מהאזורים המסומנים כאן. 300 עקומות סטייה כפויה בודדות נרשמו על פני שטח של 40 על 40 מיקרומטר, המראות שינוי בלוקליזציה של אזורים בעלי מודול גבוה עם הפעלת המאמץ.

לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע מתיחת תאים בתוך 15 דקות. בעוד שביצוע נכון של הזחה ננומטרית באמצעות FM עשוי לארוך שעתיים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לטפל בתאים בזהירות אך במהירות, שכן תוצאות הבדיקה עלולות להיפגע כתוצאה מטלטול ומחשיפה ממושכת לאוויר החדר לפני דיווח הנתונים. אין לשכוח שהעבודה עם FM יכולה להיות מאתגרת ביותר.

בעת ביצוע הליך זה, יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון הרחקת כל הנוזלים מהסורק.