הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להתבונן בתפקיד העומס המכני על המכנוביולוגיה של התא כמעט בזמן אמת. זה מושג על ידי בניית מערכת עם ממברנות גמישות שעליהן מגדלים ונמתחים תאים. כשלב שני, מתחו את הממברנה כדי לכייל את ספירת המנועים עם מתח הממברנה.

לאחר מכן, תאי אפיתל ריאות של עכבר נמתחים ומצלמים גרעינים. על מנת להראות שמתח הממברנה מועבר לתאים, האלונקות משולבות ב-A FM להזחת ננו על מנת למדוד את הנוקשות של התאים הבודדים לפני ואחרי המתיחה. התוצאות מראות נזק ישיר לתאים עקב מתיחה מיושמת.

בהתבסס גם על הדמיה פלואורסצנטית, ייצור מיני חמצן תגובתיים הוכח כגדל עם מתיחה. ובכן, שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המכנית של הריאות, כגון האם תאי האפיתל יכולים להיפגע באמצעות הנשמה מכנית או לא. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תאי ריאה, ביולוגיה מכנית, וניתן ליישם אותה גם על רקמות רכות אחרות כגון כבד או פרוסות צלחת גדילה.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל השילוב הלא קונבנציונלי של כלים המשמשים בניסויים אלה כמו מיקרוסקופ הכוח האטומי. כדי להתחיל, הכינו קרום PDMS מצופה קולגן המותאם לשימוש בתרבית תאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, תאי אפיתל ריאות של עכברי זרעים ב-2.5 מיליון תאים לבאר על קרום מצופה קולגן סטרילי וגמיש.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך יומיים עד שהתאים מגיעים לשטף. לאחר מכן השתמש באגרוף ביופסיה של 1.5 מילימטר כדי לנקב שני חורים בכל אחת משש לשוניות המהדק, 20.5 מילימטרים ממרכז המבנה אם אין צורך ביומרה. והסר את אמצעי תרבית התאים.

ודא שהמפעיל המכני נמצא במצב מתח אפס, ומקם את הממברנה על האלונקה כך שחורי האגרוף יתיישרו עם הפינים והמהדקים. הנח את המהדקים העליונים במקומם, ולאחר מכן הדק את הברגים בזה אחר זה, לסירוגין צדדים שונים. הוסף מדיית תרבית תאים אחת של מיליליטר לפני הנחת המכשיר על במת המיקרוסקופ.

מרכז את המכשיר על נתיב האור. לאחר מכן, תקן את המכשיר לבמה. התמקד בממברנה על ידי התאמת המיקום במישור ובאנכיות של המכשיר המכני עם בקר במה של המיקרוסקופ בבלוק כניסת היעד.

הזן ערך ספירת מנועים, המתאים לרמת המתח הרצויה שיש להחיל. לאחר מכן, הגדר את הערך בבלוק כניסת המהירות ל-10 סל"ד או פחות כדי לצפות באותו שדה לפני ואחרי המתיחה מכיוון שהשדה עשוי להשתנות ביחס למטרת המיקרוסקופ, וייתכן שיהיה צורך להתאים את שלב המיקרוסקופ במהלך המתיחה. לאחר שהכל מוגדר, לחץ על go.

התחל בביצוע התאמות למיקרוסקופ הכוח האטומי. הגדל את גובה ראש ה-FM למיקומו המרבי בכיוון Z. לאחר מכן הניחו מאריכים על הרגליים כדי להרים את המישור שבו שלוחת FM יוצרת קשר עם הדגימה.

לאחר מכן, הסר את לוחית סורק A FM ואת המטרה הרצויה מהמיקרוסקופ. הוסף מרווח למטרה ולאחר מכן הרכיב אותו בחזרה על המיקרוסקופ. לאחר מכן הנח את לוחית הסורק בחזרה על A FM. גובה המרווח יהיה תלוי במטרה ובהגדרת FM ספציפית, אך יש צורך להשתמש במרווח אם רוצים הדמיה אופטית מכיוון שתוכנית התצפית תזוז לכיוון Z.

לאחר מכן, הפעל את תוכנת A FM, תוכנת המיקרוסקופ האופטי וכל מקורות האור הדרושים, כולל מקור האור למדידות פלואורסצנטיות. הרכיב שבב עם קרן שלוחה בעלת קשיחות של 200 פיקו ניוטון לננומטר או פחות למדידת המודול האלסטי של תאים חיים ב-A FM. לאחר מכן יישר את הלייזר לאחר מכן, הרכיב פתק כיסוי זכוכית על המכשיר והשתמש בו כדי לכייל את קשיחות השלוחה בהתאם להצעות היצרן. מיד לפני הרכבת הממברנה למכשיר המתיחה, חותכים את הקירות לגובה של כמילימטר אחד.

זה מפחית את ההפרעה שחווים בין דפנות הממברנה לתא העומס. לאחר מכן הסר את אמצעי תרבית התאים והרכיב את הממברנה על המכשיר המכני. הנח את המכשיר המכני עם המתאם על הסורק באמצעות התוכנה.

מתחו את הממברנה לרמת מתח המתיחה הרצויה לפני כניסת ננו. הוסף 0.5 מיליליטר או פחות של מדיה לתאים כדי לשמור על לחותם, אך הקפד גם להימנע מדליפה שעלולה לפגוע בסורק FM או במיקרוסקופ. לאחר מכן חבר את קרן השלוחה עם הממברנה.

עקוב אחר הפרוטוקול של מכשיר ה-FM המסוים כדי לסרוק אזורי עניין. כאשר הוחל זן של 20% על תאים שנזרעו על הממברנה, התאים נעקרו ב-20%כפי שמצוין כאן, השפעת התאים על ייצור מיני חמצן תגובתיים נמדדה בתאי אפיתל הסימפונות באמצעות חיישן סופראוקסיד מיטוכונדריאלי מצטבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. בהיעדר מתיחה מכנית, ייצור ה-ROS לא גדל באופן משמעותי במשך 60 דקות כאשר מתיחה בודדת של 17% הופעלה ונשמרה על

הייתה עלייה ב-ROS המיטוכונדריאלי שנמשכה עוד 60 דקות עם שילוב האלונקה המכנית במיקרוסקופ הכוח האטומי. מודול אלסטי, מפות של תאי אפיתל ריאות של עכבר לפני ואחרי מתח מתיחה של 10% התקבלו מהאזורים המתוארים כאן. 300 עקומות סטייה מאולצת בודדות נרשמו על פני שטח של 40 על 40 מיקרומטר המראות שינוי בלוקליזציה של אזורי מודולוס גבוה עם הפעלת מתח.

לאחר השליטה, ניתן לבצע מתיחת תאים תוך 15 דקות. בעוד שכניסת ננו FM עשויה לצרוך שעתיים של ביצוע כראוי בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בתאים בזהירות אך במהירות מכיוון שהתוצאות עלולות להיות מושפעות לרעה מתסיסה וחשיפה ממושכת לאוויר בחדר לפני דיווח הנתונים. אל תשכח שעבודה עם FM יכולה להיות מאתגרת ביותר.

יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הרחקת כל הנוזלים מהסורק בעת ביצוע הליך זה.