העכבר נאיבי CD4 + בידוד תא T במבחנה בידול לתוך תת תא T
April 16th, 2015
תאי T נאיביים CD4+ מקוטבים לתת-קבוצות שונות בהתאם לסביבה בזמן ההפעלה. ניתן להשיג את ההתמיינות של תאי CD4+ T נאיביים לתת-קבוצות אפקטורים שונות במבחנה באמצעות הוספת גירויים של קולטני תאי T ואותות ציטוקינים ספציפיים.
המטרה הכוללת של ההליך הבא היא לקטב CD נאיבי, ארבעה תאי T חיוביים שבודדו מבלוטות לימפה של עכבר, וטחול לתת-קבוצות עוזרות T נפרדות. במבחנה, זה מושג על ידי עיבוד ראשון של טחול ובלוטות לימפה שנקטפו מעכברי בר בוגרים. בשלב השני, אוכלוסיית התאים החיוביים CD מועשרת על ידי הפרדת חרוזים מגנטיים ולאחר מכן ממוינת עוד יותר על ידי ביטוי סמן תאי ה-T הנאיבי שלהם.
בשלב האחרון, התאים מטופלים בגורמים המפעילים קולטני תאי T וציטוקינים מקטבים כדי לגרום להתמיינות שלהם לשושלות עוזרות T שונות. בסופו של דבר ציטומטריית זרימה. Elis A ו-PCR בזמן אמת משמשים להערכת היעילות של התמיינות תאי ה-T המסייעים.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תאי ה-T, כגון כיצד ביטוי של מולקולות ספציפיות או טיפול בתרופות ספציפיות משפיעים על אופי התגובה של תאי T. התחל בהצמדת הגפיים של עכבר C 57 שחור בן חמישה עד 10 שבועות ללוח הניתוח, ולאחר מכן חתוך את העור לאורך מפי הטבעת ועד הסנטר, תוך הקפדה לא לנקב את רקמת הצפק הבסיסית. לאחר מכן, הצמידו את העור לפתיחה והשתמשו בזוג מלקחיים אחד כדי לתפוס את בלוטת הלימפה ובזוג אחר כדי להפריד את הרקמה מכל אחד מהמיקומים המצוינים בתמונה.
כאשר כל בלוטת לימפה נקצרת, הניחו אותה בכלי איסוף המכיל PBS בתוספת 1% FBS או PBS פלוס, ואז פתחו בזהירות את הצפק והסירו את הטחול. מניחים את הטחול גם בצלחת האיסוף, ומעבירים את המנה לדלי קרח כדי להעשיר עבור ה-CD ארבעה תאים חיוביים. פצלו את בלוטות הלימפה בטחול לשתי צלחות נפרדות של 60 מילימטר המכילות שלושה מיליליטר PBS בתוספת כל אחת באמצעות מלקחיים סטריליים.
לאחר מכן, הניחו ריבוע של רשת ניילון סטרילית מעל הטחול והשתמשו בצד האגודל של בוכנת מזרק כדי לרסק אותם בעדינות על הרשת עד שכמעט כל הרקמה נכנסת לתרחיף. צנרת את המתלה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לפרק את הגושים המסיסים הנותרים ולאחר מכן הנח חתיכת רשת ניילון חדשה מעל פתח צינור חרוטי של 15 מיליליטר. סנן את המתלה לתוך הצינור כדי להסיר את כל הפסולת שנותרה.
כעת חזור על הדיסוציאציה המכנית של בלוטות הלימפה ומלא את שני הצינורות של התאים המסוננים ב- PBS plus. לאחר מכן הפוך את הצינורות כמה פעמים וסובב את התאים. השעו מחדש את גלולת בלוטות הלימפה בשני מיליליטר PBS.
הוסף מיליליטר אחד של קר כקרח, תמיסת CK לכל עכבר לכדור תאי הטחול. לאחר דקה אחת, הפסק את ליזיס כדוריות הדם האדומות עם 10 מיליליטר PBS פלוס. הפוך את הצינור וסובב שוב את התאים.
לאחר מכן השעו מחדש את גלולת הטחול ב-10 מיליליטר נוספים של PBS פלוס, הוסיפו את תאי בלוטות הלימפה וסובבו את תרחיף התאים המאוגדים. הפעם השעו את הגלולה ב-15 מיקרוליטר CD, ארבעה חרוזים מגנטיים מדוללים ב-85 מיקרוליטר PBS פלוס לכל עכבר למשך 15 עד 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. ואז לדלל את התאים ב -10 מיליליטר PBS פלוס.
סנן את המתלה דרך מסננת ניילון לצינור חדש של 15 מיליליטר וסובב את התאים. שוב, סובב מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר PBS פלוס לכל עכבר ובחר באופן חיובי עבור התקליטור ארבעה תאים חיוביים על ידי בחירת חרוזים מגנטיים בהתאם להוראות היצרן. לאחר השגת ה- CD ארבעה שבר תאים חיובי וחיובי, שטפו את התאים ב -10 מיליליטר PBS פלוס כדי למיין את ה- CD ארבעה שבר תאי T חיובי.
לאחר מכן, סמנו את התאים עם הנוגדנים הפלואורסצנטיים המתאימים למשך 15 עד 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך לאחר הכביסה. סנן את התאים המסומנים כדי להסיר כל פסולת והעביר אותם לתוך צינור פקס על קרח והגן עליו מפני אור מיין את ה-CD ארבע חיובי, CD 25 שלילי CD 62 L, CD חיובי CD 44 אוכלוסייה שלילית למדיום RPMI שלם. כאשר כל התאים נאספו.
שטפו את תאי ה-T הנאיביים במדיום טרי ושלם. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה והשלימו RPMI, ספרו את תאי ה-T הנאיביים והתאימו את הריכוז ל-1 פעמים 10 לששת התאים למיליליטר כדי לגרום להתמיינות תת-קבוצה של מסייע T במבחנה. לאחר מכן, שטפו כל באר של צלחות תרבית תאים שצופו בעבר באנטי CD 3 ואנטי CD 28 במיליליטר אחד של PBS וצלחת סטרילית ללא FBS.
התאים משלימים לבסוף את אמצעי התרבות עם הציטוקינים המתאימים ונוגדנים חוסמים כמתואר בטבלה ודוגרים על התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך ארבעה עד חמישה ימים לאחר ארבעה עד חמישה ימים בתרבית. ניתן לבצע צביעת ציטוקינים תוך-תאיים של CD ארבעה תאי T חיוביים מתרביות TH 1, TH 2 השראת TH 1, TH 2 השראת תרביות TH 17. כדי לאשר שכל תת-קבוצה של תאי T מציגה את פרופיל הציטוקינים הצפוי.
ואכן, לאחר גירוי מחדש של 24 שעות עם אנטי CD שלושה EISs, A מראה כי תת-הקבוצות מציגות את הייצור החוץ-תאי המקביל של חלבוני הציטוקינים המתבטאים תוך תאיים. PCR בזמן אמת עבור גורמי שעתוק ספציפיים לשושלת מאמת עוד יותר את פרופילי גורמי השעתוק המתאימים של ארבע תת-קבוצות תאי T חיוביים של CD במבחנה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולעבד תאי שיקוף של בלוטות הלימפה והטחול כדי להשיג CD נאיבי ארבעה תאי T חיוביים.
יתר על כן, תוכל להבדיל בין תאי T אלה לתאי TH אחד, TH שני TH 17 או תאי ireg.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מתאר נוהל לפולריזציה של תאי T CD4 + na茂ve לתת-סוגים מובחנים של תאי T עוזרים באמצעות טכניקות in vitro. התהליך כולל בידוד תאים מבלוטות הלימפה והטחול של עכברים, העשרת אוכלוסיית תאי ה-CD4 + T, וטיפול בהם בגירויים ובציטוקינים ספציפיים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה תאית
- נוירולוגיה
רקע
- תאי T CD4 + na茂ve יכולים להתמיין לתת-סוגים שונים של תאים ביצירה.
- תהליך ההתמיינות מושפע מגורמים סביבתיים במהלך ההפעלה.
- שיטות in vitro מאפשרות מחקר מבוקר של פולריזציה של תאי T.
- שיטות ציטומטריה זרימה ו-PCR משמשות להערכת יעילות ההתמיינות.
מטרת המחקר
- לבסס שיטה אמינה לפולריזציה של תאי T CD4 + na茂ve.
- לחקור את ההשפעות של גירויים ותרכובות ציטוקין על התמיינות.
- לספק מסגרת לחקר שושלות תאי T עוזרים.
שיטות ששימשו
- בידוד של תאי T CD4 + na茂ve מבלוטות לימפה ותחול של עכברים.
- הפרדה מגנטית של חרוזים להעשרת אוכלוסיית תאי ה-CD4 + T.
- מיון על בסיס ביטוי של סמן T-cell na茂ve.
- טיפול בגורמים להפעלת תאי T וציטוקינים מפולריזים.
תוצאות עיקריות
- פולריזציה מוצלחת של תאי T CD4 + na茂ve לתת-סוגים מובחנים של תאי T עוזרים.
- ציטומטריה זרימה ו-PCR בזמן אמת אישרה את יעילות ההתמיינות.
- הוכחה להשפעת ציטוקינים ספציפיים על גורל תאי T.
- תובנות לגבי ביולוגיה של תאי T ויישומי טיפול פוטנציאליים.
מסקנות
- השיטה פולרליזה באופן יעיל תאי T CD4 + na茂ve in vitro.
- הממצאים משפרים את ההבנה של מנגנוני התמיינות תאי T.
- השלכות פוטנציאליות לאימונותרפיה ופיתוח חיסונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Isolating and differentiating mouse naive CD4+ T cells enables mechanistic interrogation of cytokine signaling pathways that drive T helper subset commitment. This approach supports target validation in immunomodulatory drug discovery by linking molecular perturbations to functional immune phenotypes. The method provides a scalable, reproducible system for de-risking biologics or small molecules intended to modulate adaptive immunity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables hypothesis testing of how specific molecules or drugs influence T cell differentiation fate.
- Operational Value: Provides a controlled in vitro system to isolate variables affecting Th1, Th2, Th17, or Treg lineage commitment.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by connecting target modulation to lineage-specific cytokine and transcription factor outputs.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates differentiated T helper subsets with quantifiable cytokine and transcription factor readouts.
- Reproducibility: Standardized isolation and polarization workflow enables consistent compound screening across experiments.
- Scalability: Magnetic bead enrichment and FACS sorting allow processing of sufficient cell numbers for multi-well assay formats.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models cytokine-driven T helper pathologies relevant to autoimmune, inflammatory, and infectious disease.
- Translational Continuity: Differentiated subsets can be restimulated and analyzed for functional cytokine production, bridging in vitro findings to ex vivo validation.
- Biomarker Alignment: Lineage-specific transcription factors (e.g., T-bet, GATA3, RORγt, FoxP3) serve as mechanistic biomarkers for target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical mechanistic studies, enabling iterative design of immunomodulators.
- Discovery Biology: Supports interrogation of TCR signaling and cytokine milieu effects on T cell fate decisions.
- Screening: Delivers standardized, polarized T cell populations for assessing compound influence on subset differentiation.
- Analytics: Flow cytometry and real-time PCR provide quantitative, multiparametric readouts for lineage commitment and signaling efficacy.
- Translational Research: Enables assessment of differentiated subset functionality via cytokine restimulation, supporting preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Core isolation and differentiation workflow can be adapted across multiple target classes and cytokine conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic insight into target effects on T helper lineage specification and immune polarization.
- Operational Value: Standardized cell isolation, differentiation, and analytical readouts improve assay reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking target modulation to functional immune outcomes early in discovery.
- Portfolio Impact: Facilitates prioritization of immunomodulatory candidates based on predictive T cell differentiation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse tissue processing, magnetic bead separation, and fluorescence-activated cell sorting.
- Dependent on sterile cell culture infrastructure, cytokine reagents, and flow cytometry or qPCR equipment.
- Necessitates standardization across operators for consistent naive T cell isolation and subset polarization.
- Adaptation to alternative mouse strains or disease models may require optimization of cytokine conditions.
- Limitations include donor variability and the need for validation that in vitro findings reflect in vivo biology.
