העכבר נאיבי CD4 + בידוד תא T במבחנה בידול לתוך תת תא T
16 באפריל 2015
תאי T נאיביים CD4+ מקוטבים לתת-קבוצות שונות בהתאם לסביבה בזמן ההפעלה. ניתן להשיג את ההתמיינות של תאי CD4+ T נאיביים לתת-קבוצות אפקטורים שונות במבחנה באמצעות הוספת גירויים של קולטני תאי T ואותות ציטוקינים ספציפיים.
המטרה הכוללת של ההליך הבא היא לקטב CD נאיבי, ארבעה תאי T חיוביים שבודדו מבלוטות לימפה של עכבר, וטחול לתת-קבוצות עוזרות T נפרדות. במבחנה, זה מושג על ידי עיבוד ראשון של טחול ובלוטות לימפה שנקטפו מעכברי בר בוגרים. בשלב השני, אוכלוסיית התאים החיוביים CD מועשרת על ידי הפרדת חרוזים מגנטיים ולאחר מכן ממוינת עוד יותר על ידי ביטוי סמן תאי ה-T הנאיבי שלהם.
בשלב האחרון, התאים מטופלים בגורמים המפעילים קולטני תאי T וציטוקינים מקטבים כדי לגרום להתמיינות שלהם לשושלות עוזרות T שונות. בסופו של דבר ציטומטריית זרימה. Elis A ו-PCR בזמן אמת משמשים להערכת היעילות של התמיינות תאי ה-T המסייעים.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תאי ה-T, כגון כיצד ביטוי של מולקולות ספציפיות או טיפול בתרופות ספציפיות משפיעים על אופי התגובה של תאי T. התחל בהצמדת הגפיים של עכבר C 57 שחור בן חמישה עד 10 שבועות ללוח הניתוח, ולאחר מכן חתוך את העור לאורך מפי הטבעת ועד הסנטר, תוך הקפדה לא לנקב את רקמת הצפק הבסיסית. לאחר מכן, הצמידו את העור לפתיחה והשתמשו בזוג מלקחיים אחד כדי לתפוס את בלוטת הלימפה ובזוג אחר כדי להפריד את הרקמה מכל אחד מהמיקומים המצוינים בתמונה.
כאשר כל בלוטת לימפה נקצרת, הניחו אותה בכלי איסוף המכיל PBS בתוספת 1% FBS או PBS פלוס, ואז פתחו בזהירות את הצפק והסירו את הטחול. מניחים את הטחול גם בצלחת האיסוף, ומעבירים את המנה לדלי קרח כדי להעשיר עבור ה-CD ארבעה תאים חיוביים. פצלו את בלוטות הלימפה בטחול לשתי צלחות נפרדות של 60 מילימטר המכילות שלושה מיליליטר PBS בתוספת כל אחת באמצעות מלקחיים סטריליים.
לאחר מכן, הניחו ריבוע של רשת ניילון סטרילית מעל הטחול והשתמשו בצד האגודל של בוכנת מזרק כדי לרסק אותם בעדינות על הרשת עד שכמעט כל הרקמה נכנסת לתרחיף. צנרת את המתלה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לפרק את הגושים המסיסים הנותרים ולאחר מכן הנח חתיכת רשת ניילון חדשה מעל פתח צינור חרוטי של 15 מיליליטר. סנן את המתלה לתוך הצינור כדי להסיר את כל הפסולת שנותרה.
כעת חזור על הדיסוציאציה המכנית של בלוטות הלימפה ומלא את שני הצינורות של התאים המסוננים ב- PBS plus. לאחר מכן הפוך את הצינורות כמה פעמים וסובב את התאים. השעו מחדש את גלולת בלוטות הלימפה בשני מיליליטר PBS.
הוסף מיליליטר אחד של קר כקרח, תמיסת CK לכל עכבר לכדור תאי הטחול. לאחר דקה אחת, הפסק את ליזיס כדוריות הדם האדומות עם 10 מיליליטר PBS פלוס. הפוך את הצינור וסובב שוב את התאים.
לאחר מכן השעו מחדש את גלולת הטחול ב-10 מיליליטר נוספים של PBS פלוס, הוסיפו את תאי בלוטות הלימפה וסובבו את תרחיף התאים המאוגדים. הפעם השעו את הגלולה ב-15 מיקרוליטר CD, ארבעה חרוזים מגנטיים מדוללים ב-85 מיקרוליטר PBS פלוס לכל עכבר למשך 15 עד 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. ואז לדלל את התאים ב -10 מיליליטר PBS פלוס.
סנן את המתלה דרך מסננת ניילון לצינור חדש של 15 מיליליטר וסובב את התאים. שוב, סובב מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר PBS פלוס לכל עכבר ובחר באופן חיובי עבור התקליטור ארבעה תאים חיוביים על ידי בחירת חרוזים מגנטיים בהתאם להוראות היצרן. לאחר השגת ה- CD ארבעה שבר תאים חיובי וחיובי, שטפו את התאים ב -10 מיליליטר PBS פלוס כדי למיין את ה- CD ארבעה שבר תאי T חיובי.
לאחר מכן, סמנו את התאים עם הנוגדנים הפלואורסצנטיים המתאימים למשך 15 עד 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך לאחר הכביסה. סנן את התאים המסומנים כדי להסיר כל פסולת והעביר אותם לתוך צינור פקס על קרח והגן עליו מפני אור מיין את ה-CD ארבע חיובי, CD 25 שלילי CD 62 L, CD חיובי CD 44 אוכלוסייה שלילית למדיום RPMI שלם. כאשר כל התאים נאספו.
שטפו את תאי ה-T הנאיביים במדיום טרי ושלם. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה והשלימו RPMI, ספרו את תאי ה-T הנאיביים והתאימו את הריכוז ל-1 פעמים 10 לששת התאים למיליליטר כדי לגרום להתמיינות תת-קבוצה של מסייע T במבחנה. לאחר מכן, שטפו כל באר של צלחות תרבית תאים שצופו בעבר באנטי CD 3 ואנטי CD 28 במיליליטר אחד של PBS וצלחת סטרילית ללא FBS.
התאים משלימים לבסוף את אמצעי התרבות עם הציטוקינים המתאימים ונוגדנים חוסמים כמתואר בטבלה ודוגרים על התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך ארבעה עד חמישה ימים לאחר ארבעה עד חמישה ימים בתרבית. ניתן לבצע צביעת ציטוקינים תוך-תאיים של CD ארבעה תאי T חיוביים מתרביות TH 1, TH 2 השראת TH 1, TH 2 השראת תרביות TH 17. כדי לאשר שכל תת-קבוצה של תאי T מציגה את פרופיל הציטוקינים הצפוי.
ואכן, לאחר גירוי מחדש של 24 שעות עם אנטי CD שלושה EISs, A מראה כי תת-הקבוצות מציגות את הייצור החוץ-תאי המקביל של חלבוני הציטוקינים המתבטאים תוך תאיים. PCR בזמן אמת עבור גורמי שעתוק ספציפיים לשושלת מאמת עוד יותר את פרופילי גורמי השעתוק המתאימים של ארבע תת-קבוצות תאי T חיוביים של CD במבחנה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולעבד תאי שיקוף של בלוטות הלימפה והטחול כדי להשיג CD נאיבי ארבעה תאי T חיוביים.
יתר על כן, תוכל להבדיל בין תאי T אלה לתאי TH אחד, TH שני TH 17 או תאי ireg.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורה לפולריזציה של תאי CD4 + T נאיביים לתתי-אוכלוסיות נפרדות של תאי T מסייעים (T helper) באמצעות טכניקות in vitro. התהליך כולל בידוד תאים מקשרי לימפה וטחול של עכבר, העשרה של אוכלוסיית תאי CD4 + T, וטיפול בהם באמצעות גירויים וציטוקינים ספציפיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
רקע
- תאי T מסוג CD4+ נאיביים יכולים להתמיין לתתי-אוכלוסיות שונות של תאי אפקטור.
- תהליך ההתמיינות מושפע מגורמים סביבתיים במהלך ההפעלה.
- שיטות in vitro מאפשרות מחקר מבוקר של קיטוב תאי T.
- ציטומטריה של זרימה ו-PCR משמשים להערכת יעילות ההתמיינות.
מטרת המחקר
- ביסוס שיטה מהימנה לקיטוב של תאי CD4 + T נאיביים.
- בחינת ההשפעות של גירויי קולטן תאי T וציטוקינים על הדיפרנציאציה.
- מתן מסגרת למחקר של שושלות תאי T מסייעים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד תאי T מסוג CD4 + נאיביים מקשרי לימפה ומטחול של עכבר.
- הפרדה באמצעות חרו지를 מגנטיים להעשרת אוכלוסיית תאי ה-CD4 + T.
- מיון המבוסס על ביטוי של סממנים לתאי T נאיביים.
- טיפול בגורמים המפעילים את קולטן תאי ה-T ובציטוקינים מקטבים.
תוצאות עיקריות
- קיטוב מוצלח של תאי CD4 + T נאיביים לתתי-אוכלוסיות נפרדות של תאי T מסייעים.
- ציטומטריית זרימה ו-PCR בזמן אמת אישרו את יעילות הדיפרנציאציה.
- הדגמה של השפעתם של ציטוקינים ספציפיים על גורל תאי ה-T.
- מתן תובנות לגבי ביולוגיה של תאי T ויישומים טיפוליים פוטנציאליים.
מסקנות
- השיטה מקטבת ביעילות תאי CD4 + T נאיביים in vitro.
- הממצאים מחזקים את ההבנה של מנגנוני ההבחנה של תאי T.
- השלכות פוטנציאליות עבור אימונותרפיה ופיתוח חיסונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד והבחנה של תאי CD4+ T נאיביים של עכבר מאפשרים בחינה מכניסטית של מסלולי איתות של ציטוקינים המניעים את ההתחייבות לתתי-סוגים של תאי T מסייעים. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות בתהליך גילוי תרופות אימונו-מודולטוריות על ידי קישור הפרעות מולקולריות לפנוטיפים חיסוניים תפקודיים. השיטה מספקת מערכת ניתנת להרחבה ולשחזור להפחתת סיכונים בביולוגים או במולקולות קטנות המיועדות לוויסות של החסינות הנרכשת.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקת השערות לגבי האופן שבו מולקולות או תרופות ספציפיות משפיעות על גורל ההבחנה של תאי T.
- ערך תפעולי: מספק מערכת in vitro מבוקרת לבידוד משתנים המשפיעים על מחויבות לשושלות Th1, Th2, Th17 או Treg.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור של מודולציה של מטרה לתוצרי ציטוקינים וגורמי שעתוק ספציפיים לשושלת.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר תתי-אוכלוסיות מובחנות של תאי T helper עם מדדים כמותיים של ציטוקינים וגורמי שעתוק.
- שחזוריות: תהליך עבודה סטנדרטי לבידוד וקיטוב מאפשר סריקת תרכובות עקבית בין ניסויים שונים.
- יכולת הרחבה: העשרה באמצעות חרו지를 מגנטיים ומיון FACS מאפשרים עיבוד של מספר תאים מספק עבור פורמטים של בדיקות רב-בארים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה פתולוגיות של תאי T מסייעים המונעות על ידי ציטוקינים, הרלוונטיות למחלות אוטואימוניות, דלקתיות ומדבקות.
- המשכיות תרגומית: ניתן להמריץ מחדש תת-אוכלוסיות מובחנות ולנתח אותן לצורך ייצור ציטוקינים פונקציונלי, ובכך לגשר בין ממצאים in vitro לתיקוף ex vivo.
- התאמה לסממנים ביולוגיים: גורמי שעתוק ספציפיים לשושלת (למשל, T-bet, GATA3, RORγt, FoxP3) משמשים כסממנים ביולוגיים מכניסטיים למעקב אחר מעורבות המטרה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד למחקרים מכניסטיים פרה-קליניים, ובכך מאפשרת תכנון איטרטיבי של אימונומודולטורים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בחקירת סיגנלינג של TCR והשפעות הסביבה של ציטוקינים על החלטות לגבי גורל תאי T.
- סריקה: מספק אוכלוסיות תאי T מקוטבות וסטנדרטיות להערכת השפעת תרכובות על בידול תתי-אוכלוסיות.
- אנליטיקה: ציטומטריית זרימה ו-real-time PCR מספקים קריאות כמותיות ורב-פרמטריות להתחייבות לשושלת (lineage commitment) ויעילות סיגנלינג.
- מחקר תרגומי: מאפשר הערכה של תפקוד תתי-אוכלוסיות מובדלות באמצעות גירוי חוזר של ציטוקינים, ובכך תומך בתיקוף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאים את זרימת העבודה של בידוד ובידול ליבה למספר רב של מחלקות מטרה ותנאי ציטוקינים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: תובנה מכניסטית לגבי השפעות המטרה על קביעת שושלת תאי T helper וקיטוב חיסוני.
- ערך תפעולי: בידוד תאים, דיפרנציאציה ומדדי אנליזה סטנדרטיים משפרים את השחזוריות של הבדיקה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות go/no-go על ידי קישור של מודולציית המטרה לתוצאות חיסוניות תפקודיות בשלב מוקדם של הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מקל על תיעדוף של מועמדים אימונו-מודולטוריים בהתבסס על פרופילים חיזויים של דיפרנציאציית תאי T.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בעיבוד רקמות עכבר, הפרדה באמצעות חרוזי מגנט ומיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS).
- תלוי בתשתית לתרבית תאים סטרילית, בריאגנטים של ציטוקינים ובציוד לציטומטריה זרימתית או qPCR.
- מחייב סטנדרטיזציה בין מפעילים להבטחת בידוד עקבי של תאי T נאיביים וקיטוב של תתי-אוכלוסיות.
- התאמה לזני עכברים חלופיים או למודלים של מחלות עשויה לדרוש אופטימיזציה של תנאי הציטוקינים.
- המגבלות כוללות שונות בין תורמים ואת הצורך בתיקוף לכך שממצאים in vitro משקפים ביולוגיה in vivo.
