Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of <em>Caenorhabditis elegans</em>

Michal Turek; Judith Besseling; Henrik Bringmann

doi:10.3791/52742

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של Elegans Caenorhabditis

JoVE Journal
Neuroscience

This content is Free Access.

JoVE Journal Neuroscience

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של Elegans Caenorhabditis

Full Text

10,079 Views

07:51 min

June 24, 2015

DOI: 10.3791/52742-v

Michal Turek¹, Judith Besseling¹, Henrik Bringmann¹

¹Max Planck Institute for Biophysical Chemistry

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study demonstrates a method for monitoring behavior and neural activity in Caenorhabditis elegans using agarose microfluidic chambers. The technique allows for long-term imaging of calcium transients and behavior across various life stages of the organism.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Behavioral Biology
Imaging Techniques

Background

Understanding behavior requires observing neural activity over extended periods.
Agarose microfluidic chambers facilitate this observation without immobilizing the subjects.
Calcium imaging provides insights into neuronal activity during behavioral changes.
Visual demonstrations of the method are essential for successful implementation.

Purpose of Study

To monitor the development of behavior and neural activity in C. elegans.
To demonstrate the effectiveness of agarose microfluidic chambers for long-term imaging.
To analyze calcium transients in command interneurons during different life stages.

Methods Used

Worms were cultured in food-filled agarose microfluidic chambers.
Long-term calcium imaging was conducted using an E-M-C-C-D camera.
Multiple chambers were imaged sequentially or simultaneously.
Data analysis included frame subtraction for mobility assessment and calcium data analysis.

Main Results

Behavioral patterns and calcium transients were recorded for both larval and adult stages.
Successful imaging of command interneurons was achieved.
Long-term changes in behavior were documented, including mating and egg-laying.
The method proved effective for observing developmental changes in a controlled environment.

Conclusions

Agarose microfluidic chambers are a valuable tool for studying behavior and neural activity in C. elegans.
This technique allows researchers to follow developmental changes over extended periods.
High-quality imaging facilitates detailed analysis of neuronal activity related to behavior.

Frequently Asked Questions

What is the main advantage of using agarose microfluidic chambers?

They allow for long-term imaging of behavior and neural activity without immobilizing the organism.

How are the worms prepared for imaging?

Worms are cultured in food-filled agarose chambers, and individual worms are placed in separate chambers for observation.

What imaging techniques are used in this study?

Long-term calcium imaging is performed using an E-M-C-C-D camera.

Can multiple worms be imaged at once?

Yes, multiple chambers can be filmed simultaneously or sequentially.

What types of behavior were observed in the study?

Both larval and adult behaviors, including mating and egg-laying, were documented.

What is the significance of calcium imaging in this research?

Calcium imaging provides insights into neuronal activity associated with behavioral changes.

הדמיית התנהגות ופעילות עצבית לאורך זמן ארוך ללא קיבוע של החיה היא תנאי מוקדם להבנת התנהגות. ניתן להשתמש בהדמיית תאים מיקרופלואידיים של אגרוז (AMI) כדי לדמות פעילות עצבית והתנהגות עבור כל שלבי החיים של Caenorhabditis elegans.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לעקוב אחר התפתחות התנהגות ופעילות עצבית של אלגנטיות בכירים מרובים. זה מושג על ידי תרבית התולעים בתאים מיקרופלואידיים מלאים במזון. הדמיית סידן לטווח ארוך מתבצעת באמצעות מצלמת E-M-C-C-D וזמני חשיפה קצרים מופעלים על ידי TTL.

ניתן להגדיל את ההליך על ידי סריקת מספר תאים ברצף או על ידי צילום מספר תאים בבת אחת. התוצאות מראות התנהגות זחלים ובוגרים כמו גם סידן חולף של נוירונים בין-פיקודיים. היתרון העיקרי של טכניקת מיקרו תא זו הוא שניתן לעקוב אחר התנהגות והתפתחות לאורך זמן עם הדמיה באיכות גבוהה.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד למלא את תאי המיקרו בכמות הנכונה של מזון וחום. כדי להתחיל הגדר מיקרוסקופ עם מחמם מכסה, אוטומטי stage ומערכת מצלמות E-M-C-C-D. לייצר חותמות פולימתיל סובוקסן במתקן מיקרופלואידיקה או באמצעות בית יציקה מסחרי.

חותכים את שבב ה-PDMS ל-16 חותמות בודדות באמצעות אזמל. לאחר מכן, חשוף גם את החותמת וגם מגלשת זכוכית לפלזמת אוויר למשך כדקה אחת לפני הצמדת החותמת לשקופית. עובד לאט כדי למנוע המסת הפלסטיק.

גזרו שטח מרובע מתחתית צלחת בגודל 3.5 סנטימטר. הכינו כמה מנות בבת אחת. הכן ציטוטים סטריליים של אירו נקודת התכה גבוהה ונמוכה לפני השימוש.

הנח שלוש נקודות של אירוסים בעלי נקודת התכה גבוהה על בלוק חימום. בנוסף, המיס אחד של Aero נקודת התכה נמוכה לפני העברתו לבלוק חימום נפרד. ראשית, קחו את צלחת הפלסטיק עם הפתח המרובע שנוצר קודם לכן והניחו אותה הפוכה כשהפתח פונה כלפי מעלה.

השתמש בחתיכת סרט דביק דו צדדי כדי לכסות את הפתח. סובבו את המנה כך שהסרט הדביק יהיה בתחתית והניחו את המנה על משטח קשה. חותכים את הפתח חופשי בעזרת אזמל.

לאחר מכן, מלאו את האזור המקיף את הפתח בשני מיליליטר של נקודת התכה גבוהה. המתן עד שהאגרוס יהיה מוצק. לאחר ההתמצקות, הסר את סרט המגן המכסה את הסרט הדביק הדו-צדדי בצד השני.

התוצאה היא טבעת עדינה של סרט דביק המקיפה את החלק החיצוני של הפתח. האגרו משמש כמאגר לחות שיקיף מאוחר יותר את הדגימה. לפני בניית תאי המיקרו, הכן את משטח חותמת ה-PDMS על ידי חשיפתו לפלזמת אוויר למשך 20 עד 60 שניות.

צור שני מרווחים בגובה שווה על-ידי ערימת חמש עד תשע שקופיות זכוכית. הנח מגלשת זכוכית בודדת בין שתי ערימות המרווחים. לאחר מכן, הנח את שקופית הזכוכית המכילה את חותמת ה-PDMS על פני המרווחים.

התאם את גובה המרווחים כך שיהיה מרווח של 1.5 מילימטר בין משטח הדפוס למגלשת הזכוכית. כשהוא מוכן, הנח טיפה של נקודת התכה גבוהה חמה על השקופית ליד חותמת ה-PDMS והחלק במהירות את החותמת אופקית לתוך הנוזל. לאחר שה-aros התמצק ונראה אטום, משוך את החותמת אנכית בתנועה אחת.

בעזרת קיסם פלטינה עדין, העבירו את הביצים או התולעים יחד עם חיידקי OP 50 על הארוס. השתמש בריסים כדי לפזר ביצה אחת או תולעת אחת לכל תא יחד עם מזון. כרית ארוס אחת צריכה להכיל כ-30 תולעים.

חותכים את לוח הארוס המכיל את תאי המיקרו לריבוע כך שישתלב יפה בפתח המנה. השתמש במלקחיים כדי להרים את הלוח ולהניח אותו הפוך על החלקת כיסוי זכוכית לאחר נפילתו, אין להרים או להחליק את החלקת הכיסוי. כדי להימנע מדחיפת תכולה מהתאים שלהם.

התאים אטומים כעת. לאחר מכן, הנח את החלקת הכיסוי בפתח צלחת הפלסטיק. לחץ בעדינות על החלקת המכסה כלפי מטה על הטבעת העשויה מסרט דביק דו צדדי.

הקפד לא לשבור את הכוס. הפוך את המנה והשתמש בארוס בעל נקודת התכה נמוכה כדי למלא את הפער בין לוח האגרו למאגר הארוס כאשר הארוס התמצק. אוטמים את המנה עם מכסה ופרם.

לאחר סיום הכנת תאי המיקרו, בדוק אותם בצורה נכונה תחת מיקרוסקופ סטריאו. מילוי תאים ושליטה בלחות הם קריטיים להצלחה. כדי להתחיל, הנח את הצלחת המכילה את תאי המיקרו על המיקרוסקופ והתמקד בדגימה: הקלט 40 מסגרות תמונה ב-20 שניות כל חצי שעה למשך 24 שעות.

לאחר מכן, הגדר את הסריקה כך שהיא תבקר בכל תולעת באמצעות השלב. שאפו לצלם כ-30 תולעים בהפעלה אחת. ניתן לצלם תולעים מרובות על ידי התרחקות.

השתמש בהגדלה נמוכה יותר כדי לכסות מספר תאי מיקרו ולצלם מספר תאי מיקרו סמוכים בו זמנית. לאחר סיום רכישת התמונה, הפרד את הנתונים עבור כל תא בודד על ידי חיתוך אזור עניין המכסה חיה אחת. מסגרת, ניתן להשתמש בחיסור כדי להעריך במהירות נתוני ניידות.

לאחר הדמיית הדמיית סידן מבוצעת הדמיית סידן במיקרוסקופ מורכב המצויד לפלואורסצנטיות אפי שדה רחב. כדי להגביל את החשיפה לאור, השתמש באות לוגי של טרנזיסטור טרנזיסטור המפעיל נורית LED כדי להאיר את הדגימה. במקביל, המצלמה מתעדת פריים.

הפעל סרט רצף במשך 24 שעות. זה מצלם כל תולעת כל 15 עד 30 דקות. הקלט תחילה 20 שניות עם DIC.

ואז 20 שניות עם פלואורסצנטיות GFP. ולבסוף, תמונה של ה-MK 2 אות לרמות ביטוי שליטה. לבדיקת נתונים חזותיים, השתמש במפת צבעים כוזבת כדי לשפר את הנראות של שינויים קטנים בעוצמת הקרינה.

לבסוף, בצע ניתוח נתוני סידן באמצעות נהלים סטנדרטיים. דוגמה זו מציגה התנהגות זחלים. תא בעל ממדים גדולים יותר מאפשר התפתחות מביצה לבוגר לטווח ארוך, שינויים בהתנהגות מוצגים כאן.

זרעי זחל הנדוניה כאן הם שלב חיים חלופי המעורב בתנאי סביבה קשים. תולעת בוגרת זו הטילה ביצים רבות לתוך החדר. לבסוף, תמונה זו מציגה הרמפרודיטה בוגרת וזכר מזדווגים בתוך תא בוגר.

הדמיית סידן של הפיקוד הבין-נוירוני A VA עבור זחל L אחד מוצגת כאן. התמונות האלה מראות פעילות סידן עבור אותו סוג של תא עצב בחיה בוגרת. הגדלת ההדמיה לטווח ארוך מאפשרת לצלם 30 תולעים על שבב מצלמה אחד.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב למלא את התאים בכמות המזון הנכונה ולהבטיח את התנועות הנכונות של אגרו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בהדמיית מיקרו תא ארוס בשלבי חיים שונים של אלגנטיות ים.