In vivo ההדמיה ומעקב של טכנציום-99m תווית תאי גזע מח העצם mesenchymal בסוסי Tendinopathy
9 בדצמבר 2015
פרוטוקול זה מתאר תיוג רדיו של תאי גזע מזנכימליים של סוסים והשתלתם בפגיעות גידים בסוס על מנת לקבוע את הישרדות התאים ואת התפלגות הרקמות באמצעות סינטיגרפיה גמא.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לעקוב באופן לא פולשני אחר ההתפלגות וגורלן של תאי גזע מזנכימליים מסומנים ממח העצם לאחר הזרקתם, באמצעות סקנטיגרפיה של גמא. גורלן של תאי גזע לאחר ההזרקה אינו מובן דיו. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת מעקב לא פולשני אחר תאי הגזע במספר איברים לאחר המתן, וכן שחציו החיים הקצר של A osteo מבטיח את פינויו תוך 48 שעות.
אף שדבר זה סיפק תובנות לגבי השימוש בתאי גזע בטיפול בטנדונופתיות המתרחשות באופן טבעי, ניתן להשתמש בו גם לחקר טיפולים למחלות לב ומחלות עצם. באופן כללי, האתגרים עבור אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו הם תיאום התאים והערכה לסימון, וכן הכנת המטופל. לצורך יישום מיידי של התאים, התחל במריחת ג'ל צימוד אקוסטי על הגפה הקצוצה והשתמש במתמר ליניארי כדי לסרוק באופן שיטתי את כל אזור המטקרפליס הפלמרי (Palmer metacarpal region) כדי לקבל סדרת תמונות רוחביות ואורכיות, במטרה לזהות את אזור הפגיעה המקסימלי.
לאחר מתן אלחוש מקומי, קרצפו את אתר ההשתלה בתמיסת קרצוף כירורגית של כלורהקסידין למשך חמש דקות לפחות, ולאחר מכן נגבו עם גזה ספוגה באתנול. לאחר הכנת בעל החיים, לבשו זוג כפפות, והעבירו לצנטריפוגה מנה של 1x10⁷ תאי גזע מזנכימליים ממח עצם ב-1 ml של עליון (supernatant) ממח עצם. לאחר מכן, שאבו את העליון באמצעות מזרק של 2 ml, המצויד במחט בכי মাপ 18 או 19, כך שיישארו כ-100 µL של תמיסה במבחנה.
העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנת מיקרו-צנטריפוגה על קרח, ולאחר מכן השתמשו בטפיחות עדינות כדי להחזיר את התאים לתמיסה (resuspend) ב-100 microliters שנותרו מהנוזל העליון. ודאו שהתאים חזרו לתמיסה באופן מלא ושאין גושי רקמה נראים לעין. לאחר מכן, השאירו את התאים בטמפרטורת החדר.
כעת ערבבו מיליליטר אחד של technetium Protec nutate לתוך מבחנה של H-M-P-A-O. לאחר חמש דקות, השתמשו במזרק ומחט של מיליליטר אחד כדי לטפל בתאי הגזע המזנכימליים עם כל המנה של TECHNETIUM 99 M-H-M-P-A-O. לאחר מכן סגרו את המבחנה במכסה, ערבבו את התאים בנקישה עדינה והניחו את המבחנה בטמפרטורת החדר מאחורי מגן עופרת.
לאחר 30 דקות, פתחו את המבחנה בעזרת פינצטה והשתמשו במזרק של מילליטר אחת המצויד במחט gauge 21 כדי להוסיף 1 mL של PBS לתאים. סגרו שוב את המבחנה וערבבו את התאים. לאחר מכן, סבבו את התאים בצנטריפוגה והשתמשו במזרק של 2 mL כדי להעביר בזהירות את העלייה למבחנה מוגנת המסומנת wash one.
לאחר מכן, שטפו את המשקע במיליליטר נוסף של PBS כפי שהודגם כעת. העבירו את השטיפה השנייה לשפוף מוגן המסומן כ-W2 לאחר סיום השטיפה השנייה. השביהו מחדש את התאים באופן יסודי ב-PBS שנותר והוסיפו מנה של על-נוזל (supernatant) של מח עצם קר מאוד, תוך החזקת המתמר במקביל למחט.
החדירו באיטיות מחט 20 gauge באורך 1.5 או 2 אינץ' לאזור הפגיעה המקסימלי במרכז הנגע, בכיוון אורכי. לאחר מכן, תוך שימוש במיגון המתאים, שאבו את התאים למזרק Luer-lock בנפח 2 ml המצויד במחט 20 gauge, והשליכו את המחט תוך הקפדה שלא לאבד נוזלים. לאחר חיבור המזרק למחט שהוצבה מראש בגיד, מקמו את מתמר האולטרסאונד מתחת למחט כך שנתיב המחט ברקמה יהיה גלוי בבירור, והזריקו את התאים לק ngưỡng הנגע בקצב איטי אך קבוע.
וודאו כי הנוזל המוזרק אל תוך הנגע נראה בתמונת האולטרסאונד כנוזל אקואי (koic) המכיל בועות אוויר היפר-אקוגניות; לאחר שכל התאים הוזרקו, הוציאו את המחט. השתמשו באפשרויות "acquire study selection" ו-"bone static" בתוכנת העיבוד כדי להשיג תמונות סטטיות למשך 60 שניות כל אחת. לאחר מכן, השגיו תמונות צדדיות מאזור הנגע, מהקרפוס (carpus) ועד לקצה הדיסטלי, מהאזור המקביל בגפה הנגדית, משדה הריאה השמאלית ומהבלוטה המגן (thyroid) השמאלית בזמנים המצוינים.
לאחר מכן, בחרו את כלי הגדרת אזור העניין (region of interest) ואת כלי האליפסה, ושנו את צורת מסכת הבחירה מעל אזור הנגע לפי הצורך. לבסוף, בחרו באפשרות "add two statistics" כדי לקבל את הספירות מעל אזור העניין. יש להקפיד על כך שאזורי עניין בעלי גודל זהה יסומנו עבור כל בעל חיים בנקודות הזמן השונות.
לאחר הזרקה תוך-נגעיים, התאים ייראו כאזור מוקד של אות עם התפשטות מוגבלת של התאים לרקמת הגיד הסובבת עם הגעתם של פרקי זמן. לעומת זאת, כאשר התאים מוחדרים באמצעות פרפוזיה אזורית דרך וריד פלמר (Palmer) בדיגיטל, נצפה הפסדה הדרגתית של האות באתר ההזרקה. עם הזמן, שדות הריאה הם בדרך כלל שליליים לאחר הזרקה תוך-נגעית, אך לעיתים ניתן לזהות בנקודות זמן מוקדמות אות מוקדי מאוד שהופך לגנרלי יותר עם הזמן.
הבלוטה המגן נותרת שלילית גם בנתיב מתנה זה. פרפוזיה אזורית מדגימה גם היא אות מוקדי בריאות, אשר הופך להיות דיפוזי יותר עם הזמן, אם כי האות אינטנסיבי משמעותית בהשוואה לזה שנצפה בנתיב התוך-נגעי. כאשר בלוטת המגן מראה לעיתים קרובות אות מוקדי, ספירת הרדיו-איזוטופ הראשונית הכוללת של התאים בזמן אפס לפני ההזרקה, והספירות מהגמא-גרם הראשוני באזור העניין.
ניתן להשתמש בנקודת הזמן אפס לאחר ההזרקה כדי לחשב את אחוז הירידה בספירות בכל נקודת זמן לאחר ההזרקה, במטרה לקבוע את הדעיכה החזויה של ה-TC 99 M מהספירות הראשוניות. לאחר מכן, ניתן לחשב גם את ההישארות של התאים שנותרו באתר ההזרקה בכל נקודת זמן לאחר ההזרקה. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם מסלולים אחרים של הגירה תאית כדי לענות על שאלות נוספות לגבי יכולת ההומינג (homing) של תאי הגזע המזנכימליים לאחר פיתוחם.
טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הרפואה האזורית לבחון שיטות לשיפור השמירה על תאים בתוך פגיעות בגידים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו עם הבנה טובה של אופן סימון התאים ותיעוד פיזורם וריכוזם במערכות איברים שונות. זכרו כי עבודה עם קרינה מייננת עלולה להיות מסוכנת ביותר, ואמצעי זהירות כגון ציוד מגן אישי, מדי קרינה, מיגון עופרת וסילוק נכון של פסולת מזוהמת הם חיוניים בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר מעקב לא פולשני אחר תאי גזע מזנכימליים של סוסים לאחר השתלתם בפגיעות בגיד באמצעות סינטיגרפיה גמא. טכניקה זו מאפשרת להעריך את הישרדות התאים ואת התפלגותם ברקמה לאורך זמן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- טיפול בתאי גזע
- רפואה ווטרינרית
- טכניקות דימות
רקע
- גורלן של תאי גזע לאחר הזרקה אינו מובן דיו.
- סצינטיגרפיה גמא מספקת שיטה למעקב לא פולשני אחר תאי גזע.
- לטכניקה זו יש השלכות על הטיפול בטנדינופתיות ובמחלות אחרות.
- האתגרים כוללים תיאום נכון של התאים והכנת המטופל.
מטרת המחקר
- מעקב אחר ההתפלגות וגורלן של תאי גזע מזנכימליים מסומנים.
- העמקת ההבנה של התנהגות תאי גזע in vivo.
- בחינת יישומים פוטנציאליים בהקשרים טיפוליים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מריחת ג'ל צימוד אקוסטי על הגפה.
- שימוש במתמר ליניארי לצורך ההדמיה.
- סריקה שיטתית של אזור גרמי המטקרפוס הכפים (Palmer metacarpal).
- זיהוי אזור הפגיעה המקסימלי באמצעות ההדמיה.
תוצאות עיקריות
- מעקב מוצלח אחר תאי גזע במספר איברים.
- תובנות לגבי ההישרדות וההפצה של תאי גזע לאחר השתלה.
- הוכחת ההיתכנות של שימוש בסצינטיגרפיה של גמא ביישומים וטרינריים.
- מתן בסיס למחקרים עתידיים בטיפולים בתאי גזע.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר ניטור יעיל של טיפולים בתאי גזע.
- סריקת גמא (Gamma scintigraphy) היא כלי בעל ערך ברפואה וטרינרית.
- נדרשים מחקרים נוספים כדי לבחון יישומים רחבים יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
מעקב לא פולשני אחר גורלן של תאי גזע נותן מענה לפער קריטי בפיתוח הרפואה הרגנרטיבית, בכך שהוא מאפשר הערכה כמותית של שימור תאים והתפלגות ביולוגית. יכולת זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בטיפולים פרה-קליניים בתאי גזע, על ידי הבהרת קינטיקה מוקדמת של הישרדות ודפוסי נדידה למטרות שאינן המטרה המקורית. עבור מודלים של פגיעות בגיד בסוסים ובמחקרים תרגומיים, הדמיה כזו מספקת מידע לקבלת החלטות לגבי המשך הניסוי (go/no-go), באמצעות קישור בין התמדה תאית לתוצאות תפקודיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות שימור תאי גזע באתרי פגיעה לעומת פינוי לאיברים כגון הריאות והבלוטה המגן.
- ערך תפעולי: מספק נתוני התפלגות ביולוגית הניתנים לשחזור באמצעות סינטגרפיה של גמא, כדי להשוות בין דרכי הזרקה כגון הזרקה תוך-נגעית לעומת פרפוזיה אזורית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מדידות כמותיות של משתנה תלוי (ספירות גמא מעל אזורי עניין סטנדרטיים) להערכת יעילות סימון התאים והישרדות לטווח קצר.
- ערך תפעולי: קובע זרימת עבודה סטנדרטית לסימון רדיואקטיבי של תאי גזע מזנכימליים באמצעות Tc-99m HMPAO, ובכך תומך במוכנות הבדיקה למחקרים השוואתיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בתיקוף מערכות רלוונטיות למחלה על ידי מעקב אחר הישרדות תאים עד 36 שעות לאחר השתלה בטיפול בטינדנופתיה של סוסים, ומספק מידע לצורך שיקולי מינון ותזמון.
- ערך תפעולי: מקל על שיתוף פעולה בין-תחומי באמצעות ניתוח סטנדרטי של אזורי עניין (region-of-interest) ודרישות לשחזור עבור נקודות זמן של דימות אורך.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו של דימות נגזרת מרצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם ועד להערכה פרה-קלינית, ומספקת מדדים כמותיים של התהלוכות בגוף המסייעים לתעדף אסטרטגיות להחדרת תאי גזע לפני בדיקת היעילות התפקודית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות להדמיה של גורל תאי הגזע וכמותיזציה של שימור הנגע לעומת ספיגה ריאתית או בבלוטת התריס.
- סינון (Screening): מספקת פלטיים כמותיים המותאמים לתקן הבדיקה (ספירות של אזורי עניין), המאפשרים השוואה של חיות תאים תחת תנאי טיפול או הובלה שונים.
- אנליטיקה: מאפשרת חישוב של אחוז הירידה באות לאורך זמן כדי להבחין בין דעיכה רדיואקטיבית לבין פינוי ביולוגי, ובכך מסייעת במידול קינטי.
- מחקר תרגומי: מקשרת נתוני השתרשות מוקדמים לרציפות פרה-קלינית על ידי זיהוי חלונות זמן אופטימליים להערכת תיקון תפקודי במודלים של פגיעות גיד.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת הדמיה לא פולשנית הניתנת לשימוש חוזר ומיושמת למחקרי תאי גזע בהקשרי רקמות מרובים, כולל מודלים של מחלות עצם ולב.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בטיפולי תאי גזע על ידי אספקת ראיות ישירות להתפלגות ביולוגית (biodistribution) וקינטיקה של הישרדות מוקדמת.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לשטיפת תאים, סימון והדמיה, הכוללים טיפול במיגון עופרת.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות לגבי המשך או הפסקה של הניסוי (go/no-go) על ידי כימות אובדן תאים מוקדם (שימור של <10%) ודפוסי התפלגות ביולוגית ספציפיים לאיברים.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכון על ידי הבהרה האם השפעות טיפוליות שנצפו מתואמות עם השתרשות מקומית מתמשכת לעומת פעילות פראקרינית חולפת.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ברדיופארמציה וטיפול בטוח ב-Tc-99m תחת פרוטוקולי בטיחות קרינה.
- תלוי בגישה למכשור גמא סינטגרפיה ומרחבי עבודה ממוגני עופרת לצורך סימון תאים ונהלי הזרקה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין צוותי עיבוד התאים, הדימות והניתוחים הווטרינריים להגדרה עקבית של אזור העניין (region-of-interest).
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת יעילות הסימון מ-MSCs סוסיים למינים אחרים או למקורות תאים אחרים.
- מוגבל למעקב לטווח קצר (עד 36 שעות) בשל זמן מחצית החיים של Tc-99m העומד על 6 שעות, מה שמגביל את הערכת השתקעות התאים לטווח ארוך מעבר לחלון זמן זה.
![כמותי [18F]-NAF-PET-MRI ניתוח להערכת מחזור עצם דינמי במטופל עם Facetogenic כאבי גב תחתון](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F58491.jpg%3Fv%3D2026-07-04T05%253A56%253A06.000Z&w=384&q=75)
