איתור של α-סינוקלאין קשורים למחלות על ידי ELISA משופר במוח של עכברים הטרנסגניים ביתר A53T אדם מוטצית α-סינוקלאין
30 במאי 2015
מתואר ELISA המציע גישה כמותית חדשנית. הוא מגלה באופן ספציפי α-סינקליין הקשור למחלה (αSD) במודל עכבר מהונדס (M83) של סינקלינופתיה באמצעות מספר נוגדנים נגד צורת ה-αS המפוספסת ב-Ser129 או החלק ה-C-סופי של החלבון.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לנטר את הצטברות הפרוטאין הקשור למחלה אלפא סינקלין במודל עכבר מהונדס של מחלת פרקינסון באמצעות גישה כמותית של אלייזה. זה מושג על ידי אפשרות לעכברים לא מחוסנים להזדקן באופן רגיל או על ידי חיסון עכברים באופן תוך מוחי עם תמצית מוח ממחלה של M 83. לאחר שהעכברים מפתחים מחלה קלינית ומוקרבים, אזורי המוח מהעכברים מנותחים.
לאחר מכן מכינים הומוגניים הומוגניים מכל אזור מוח במאגר מלח גבוה, ואלייזה מבוצעת על ההומוגניים על מנת לכמת את האלפא-סינקלין הקשור למחלה בכל אזור מוח. תוצאות האלייזה מראות שהצורה הקשורה למחלה של חלבון האלפא סינקלין מצטברת בעיקר באזורי המוח הקטנים, כולל המזנספלון והגזע המוחי, כמו גם בחוט השדרה של העכברים. היתרון העיקרי של טכניקת האלייזה זו בהשוואה לשיטות זמינות בעבר כמו מערבן בלוד או אימונוהיסטוכימיה, הוא שהיא מספקת כימות מהיר ואמין של האלפא סקל הקשור למחלה.
במודל הניסוי הזה, השיטה הזו יכולה לעזור לנטר את הצטברות והתפשטות החלבון הזה במערכת העצבים המרכזית של עכברי MA שלוש. זה מצביע על מעורבות של מנגנון דמוי מוח עד לפיתוח המדע הקליני. פיתוחים נוספים של שיטה זו יכולים להיחשב בעתיד לצורך חקר דגימות ביולוגיות שונות כמו נוזל השדרה המוחי או הדם שאולי מכילים גם צורות אלפא משתנות המדגימות שהליך זה יהיה טכנאי מהמעבדה שלנו.
כל הנהלים והפרוטוקולים הכוללים בעלי חיים היו בהתאם לדירקטיבה EC 86 6 0 9 EEC, ואושר על ידי comm ETH, הוועדה הלאומית הצרפתית. לצורך בחינת אתיקה וניסויים בבעלי חיים, בעלי החיים הוחזקו וטופלו במתקנים ניסיוניים מאושרים של A ו-S'S באור יאנג לאחר הריגת עכברים והשגת המוחות והחוט השדרה. על פי הפרוטוקול בטקסט, הנח מוח שלם על צלחת פטרי על קרח תחת הגדלה נמוכה.
התחל בהפרדת אחד משני הבלוטות הריחיות על ידי הנחת פורצפס ממש מאחורי הבלוטה. בעזרת תנועה כלפי מטה, נתק אותו מהמוח, ואז הסר את הבלולה השנייה באופן דומה. כעת תוך שימוש בפורצפס כדי לשמור על המוח במקום, הכנס זוג פורצפס שני בין הקורטקס השמאלי והקורטקס הימני והזז אותם קדימה כדי לנתק את שני החצאים.
כעת ממשיכים להחזיק את המוח במקום. ממקמים את הפורצפס השני, שני מילימטרים מאחורי הקורטקס, ושומרים על הלחץ כלפי מעלה כדי להרים את הקורטקס מההיפוקמפוס. ואז מקלפים את החלק הראשון של הקורטקס על ידי התחלה בהיפוקמפוס והתקדמות לכיוון קדמת המוח.
חזור עם החצי השני. לאחר מכן ממקמים את הפורצפס הפתוחים סביב אחד מההיפוקמפוס. ואז סגרו בעדינות את הפורצפס בתחתית האיבר והסירו אותו בעדינות.
חזור עם ההיפוקמפוס השני. ממקמים את הפורצפס מאחורי אחד מהסטריה ומפרידים אותו בעדינות מהמוח. השתמשו בפורצפס להסרת שארית הקורטקס מהסטריום לפני הסרת הסאטו השני כדי להפריד את המוח הקטן משאר המוח בעזרת הפורצפס, השתמשו בלחץ קל על קווי המתאר של המוח הקטן.
לאחר מכן ממקמים את הפורצפס מאחורי המוח הקטן ומזיזים את הפורצפס קדימה כדי להסיר אותו באמצעות החלק הרחב של הפורצפס שהרמו אותם כמו ספינת המוח, המורכבת מארבע מבנים עגולים כדי לראות בבירור היכן מתחבר הגזע המוחי. ואז עשו חתך אנכי בצומת לפני הסרת הגזע המוחי. ממקמים את הפורצפס מאחורי המזנספלון ובגודל אנכית כדי להפריד אותו לחלוטין מהמוח הנותר. כדי להכין הומוגני מוחי, הוסיפו נפח מתאים של מאגר HS לחלקי המוח המנותחים כדי להגיע לאחוז ההומוגני הצפוי כמוצג בטבלה שלהלן.
באמצעות מטחנת רקמות המורכבת מצינור זכוכית סיליקט בור ושבבי מכתש A ו-B, יוצקים אזור מוחי שיי
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה כמותית חדשנית של ELISA לזיהוי α-synuclein הקשור למחלה במודל עכבר טרנסגני של סינוקלינופתיה (synucleinopathy). הטכניקה מאפשרת מעקב אחר הצטברות של α-synuclein באזורי מוח שונים בעקבות התקדמות המחלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- מודלים טרנסגניים
רקע
- α-synuclein מעורב בסינוקלינופתיות (synucleinopathies) כגון מחלת פרקינסון.
- לשיטות מסורתיות כמו western blotting ואימונוהיסטוכימיה יש מגבלות בכימות.
- ELISA מציעה חלופה מהירה ואמינה לכימות חלבונים.
- מודל העכבר הטרנסגני M83 משמש לחקר התקדמות המחלה.
מטרת המחקר
- לכימות של הצטברות α-synuclein הקשור למחלה באזורי מוח ספציפיים.
- להשוואת היעילות של ELISA מול שיטות מסורתיות.
- להעמקת ההבנה של התפלגות α-synuclein בסינוקלינופתיה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- עכברים טרנסגניים הושארו ללא הזרקה או הוזרקו בתמציות ממוח.
- העכברים הושארו להתבגר או לפתח מחלה קלינית לפני ההקטילה.
- אזורי מוח הוצאו והומוגניזרו בבופר מלח בריכוז גבוה.
- בוצע ELISA כדי לכמת את רמות ה-α-synuclein בדגימות.
תוצאות עיקריות
- נצפתה הצטברות משמעותית של α-synuclein הקשור למחלה באזורי המוח הזנביים.
- רמות גבוהות זוהו ב-mesencephalon, בגזע המוח ובחוט השדרה.
- בדיקת ELISA סיפקה כימות מהיר ואמין בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- הממצאים תומכים בשימוש ב-ELISA למחקר של α-synuclein בסינוקלינופתיות (synucleinopathies).
מסקנות
- שיטת ה-ELISA החדשנית יעילה לכימות של α-synuclein במודלים טרנסגניים.
- גישה זו יכולה לסייע למחקרים נוספים בתחום הסינוקלינופתיות (synucleinopathies).
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון התערבויות טיפוליות המכוונות להצטברות של α-synuclein.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי כמותי של α-synuclein הקשור למחלה הוא קריטי להפחתת סיכונים בתהליך התיקוף של מטרות (target validation) בגילוי תרופות למחלות סינוקלינופתיה. גישה מבוססת ELISA מאפשרת כימות מהיר ואמין על פני אזורים שונים במוח, ותומכת בהחלטות go/no-go בתוכניות פרה-קליניות. שיטה זו מגבירה את הביטחון החזוי על ידי אספקת קריאות ניתנות להרחבה ולשחזור עבור מחקרים מכניסטיים ומעקב אחר התערבויות טיפוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של פתולוגיית α-synuclein כמטרה טיפולית במודלים של מחלת פרקינסון.
- ערך תפעולי: מספק מדדים כמותיים, ספציפיים לנוגדנים, להבהרה של מעורבות המטרה וסימון של ויסות המסלול.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי קישור בין הצטברות מולקולרית לבין התקדמות פנוטיפית של המחלה.
סקר ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק כימות סטנדרטי המתאים לסריקה רחבה (high-throughput) של α-synuclein הקשור למחלה.
- ערך תפעולי: דורש רק 10 μg של מקובילי brain לצורך זיהוי, מה שמשפר את יעילות הבדיקה בהשוואה ל-Western blot.
- ערך שחזור: מראה תוצאות עקביות לאורך תנאי הדבקה וההזדקנות, ומאפשר מעקב אורך (longitudinal tracking) מהימן.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר ניטור של התפשטות דמוית פריון במערכת העצבים המרכזית (CNS), ובכך מספק מידע למודלים מכניסטיים של התפשטות המחלה.
- ערך תפעולי: מזהה הצטברות באזורי המוח הזנביים ובחוט השדרה, בתיאום עם הפתולוגיה הקלינית.
- ערך תרגומי: תומך במאמצים להסמכת סממנים ביולוגיים (biomarkers) על ידי אספקת תוצאות כמותיות של חלבונים הקשורים למחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת ה-ELISA משתלבת ברצף הגילוי החל מתיקוף המטרה ועד לבדיקות יעילות פרה-קליניות, ובכך מאפשרת הערכה איטרטיבית של תרכובות המווסתות את ה-α-synuclein.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על אגרגציה של α-synuclein ונוירוטוקסיות במודלים טרנסגניים.
- סריקה: מאפשר יצירת מערכות ביולוגיות מוכנות לבדיקה עם פלטים כמותיים להערכת ספריות של תרכובות.
- אנליטיקה: מספק קריאות מבוססות בליעת אור ב-450 nm, המאפשרות השוואה סטטיסטית של השפעות הטיפול בין אזורי מוח שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין זיהוי מולקולרי לתוצאות פנוטיפיות, ובכך תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון.
- שימוש חוזר ארגוני: מקיים פלטפורמה סטנדרטית לכימות α-synuclein, הישמימה על פני מודלים של מחלות ושיטות טיפוליות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון באישור המטרה באמצעות זיהוי כמותי וספציפי של α-synuclein הקשור למחלה.
- ערך תפעולי: מספק תוצאות מהירות (בתוך שעות) בהשוואה לימים הנדרשים עבור Western blot, ובכך מאיץ את לוחות הזמנים של הפרויקט.
- ערך אסטרטגי: מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים על ידי מתן אפשרות לקבלת החלטות go/no-go מוקדמות המבוססות על המנגנון.
- השפעה על תיק הפיתוח: משפר את יעילות ההון על ידי תיעדוף תרכובות עם מעורבות מטרה (target engagement) מוכחת in vivo.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באופטימיזציה של ELISA, תיקוף נוגדנים והומוגניזציה של רקמת מוח.
- תלוי בהכנת בופר בעל ריכוז מלח גבוה ובגישה לקורא מיקרו-פלטות למדידת בליעה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך טיפול עקבי בדגימות ובפרוטוקולי דגירה.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש תיקוף של ספציפיות הנוגדן ונגישות האפיטופ.
- מגבלה מעשית: זיהוי האות תלוי בהצטברות מספקת של α-synuclein הקשור למחלה, שעשויה להשתנות בהתאם למודל ולגיל.
