Name: הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: למדו הדפסה רובוטית של תאי סרטן ספירואידים במערכת מימית דו-שלבית לבדיקת סמים נוגדי סרטן בפורמט 96-באר. שיטה זו מאפשרת סינון בקיבול גבוה של תרכובות כימיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים למימון מהמכונים הלאומיים לבריאות R21CA182333.

1. הכנת מערכת שלב שתי פולימרית מימית (ATPS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 0.5 גרם של פוליאתילן גליקול (PEG) (MW: 35,000) ולהוסיף אותו ל9.5 מיליליטר של מדיום גידול מלא בחרוטי 15 מיליליטר סטרילי כדי להכין 10 מיליליטר של 5% (w / v) שלב PEG המימי. הערה: הוספת מחצית בינונית לחרוטים הראשונים ואחרי הוספת הפולימר ולאחר מכן את יתרת הסכום של מדיום ממזער הידבקות של הפולימר לקירות חרוטי ומסייע הפולימר יתמוסס מהר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 0.128 גרם של dextran (DEX) (MW: 500,000) ולהוסיף אותו ל.872 מיליליטר של מדיום גידול מלא בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge סטרילי כדי להכין 1 מיליליטר של 12.8% (w / v) שלב DEX המימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת שני פתרונות לדקות על 1 לפזר הפולימרים במדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את שני הפתרונות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי להבטיח פירוק ותערובות הומוגנית. שמור את הכובעים מעל פני המים, כדי למנוע האפשרות של זיהום של פתרונות מהאמבטיהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את פתרון שלב PEG לתוך מזרק סטרילי, פלסטיק ולהעביר אותו דרך מסנן מזרק של גודל נקבובית 0.2 מיקרומטר כדי להסיר זיהומים. הערה: מלא את המזרק עם פתרון PEG, למקם אותו בהכנסה של המסנן על גבי צינור חרוטי ותוך שימוש בכוח, לדחוף את הפתרון באמצעות המסנן לאט. זה נורמלי לחוות התנגדות נגד תנועה של בוכנת המזרק. הפסד קטן של פתרון הפולימר מתרחש כחלק מהפתרון יישאר במסנן, אבל ריכוז הפולימר לא ישתנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של פתרון שלב DEX ולדלל אותו ב 10 μl של מדיום בצינור נפרד ללגרום 6.4% (w / v) פתרון שלב DEX. לשאוב מפתרון שלב PEG 100 μl ומוציא אותו לתוך צלחת פטרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 0.5 μl של 6.4% (w / v) פתרון שלב DEX לפתרון שלב PEG. חזותי לאשר הקמת ATPS מוצלחת על ידי התבוננות ירידת DEX תחת מיקרוסקופ. גבול הירידהצריך להישאר גלוי, המצביע על נוכחותם של שני שלבים יציבים, נפרדים מימי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את המניה המימית PEG ופתרונות שלב DEX ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הערה: מומלץ שפתרונות פולימר מוכנים טריים לפני כל ניסוי ושימוש בתוך 24 שעות של אחסון. </li></ol> 2. הכנה לSpheroids Cell ההדפסה של הסרטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי סרטן של עניין (למשל, תאי סרטן השד מד&quot;א- MB-157) ל- 90% -100% monolayer מחוברות. למד&quot;א-MB-157 תאים, להשתמש בינוני מורכב DMEM המכיל 10% FBS, גלוטמין 1%, ואנטיביוטיקת 1%. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים באמצעות חיץ ניתוק תא (על פי הפרוטוקול של היצרן) ולטעון את ההשעיה לחרוטי 15 מיליליטר. צנטריפוגה זה במשך 5 דקות ב173.3 XG, להסיר supernatant, ותאי resuspend ב 1 מיליליטר של מדיום גידול שלם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי עומס על hemocytometer ולספור אותם על מנת לחשב את המספר הדרוששל תאים לצפיפות תאי אליפטית רצויה. Monolayer ומחוברות של מד&quot;א-MB-157 תאים שגודלו בבקבוק T75 בדרך כלל נותנת ~ 7 x 10 6 תאים. הערה:. צפיפות תאים דרושה לירידת נפח כדי ליצור אליפטית אחת תהיה תלויה בסוג התא 22 לדוגמא, צפיפות של 1.5 x 10 4 או גדולים יותר למד&quot;א-MB-157 תאים מומלצת לכל טיפת שלב DEX 0.3 μl ל להבטיח היווצרות אליפטית יחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה בפעם שנייה במשך 5 דקות ב173.3 XG וresuspend אותם בנפח מתאים של מדיום גידול להתרכז תלוי על צפיפות תאים רצויה. הערה: לדוגמא, אם 7 x 10 6 תאים סרטניים נקצרו, הנפח הכולל של השעיה תא הנדרשת ליצירת אליפטית של צפיפות 1.5 x 10 4 תאים בירידת שלב DEX 0.3 μl יהיה 140 μl. עם זאת, בשל דילול עם פתרון שלב DEX בשלב הבא, להשתמש רק 70 μl של מדיום תרבית תאים לresuspend תאים. </li><li&gt; הוסף להשעית תא וכתוצאה מכך נפח שווה של 12.8% (w / v) פתרון שלב DEX המימי ערוכים 1.2. לדוגמא אליפטית צפיפות 1.5 x 10 4 תאים, 70 μl של פתרון שלב DEX מתווסף 70 μl של השעיה תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב ביסודיות את ההשעיה התא על מנת להבטיח פיזור אחיד של תאים וערבוב של פתרון DEX. Pipetting למעלה ולמטה צריכים להיעשות בעדינות כדי למנוע היווצרות בועה. </li></ol> 3. הכנה לדפוס של Spheroids Co-תרבותי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי סרטן (לדוגמא, מד&quot;א-MB-157 תאים אנושיים של סרטן השד) ותאי תמיכה (למשל, fibroblasts אדם) ל- 90% -100% monolayer מחוברות. לקצור כל סוג תא באמצעות חיץ ניתוק תא (על פי הפרוטוקול של היצרן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון כל השעיה לחרוטי 15 מיליליטר, צנטריפוגה במשך 5 דקות ב173.3 XG, וsupernatant לשאוב מכל חרוטי. תאי Resuspend של כל חרוטי ב 1 מיליליטר של g המלאבינוני rowth. הערה: צבעי ניאון כגון Calcein AM (כתם תא חי) וצבעים גרעיניים (Hoechst) ניתן להשתמש כדי להבחין בין שני סוגי התאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון כל סוג תא בנפרד על hemocytometer ולספור אותם על מנת לחשב את המספר הנדרש של כל סוג תא ליחס רצוי של תאי סרטן לתאים תומכים בspheroids שיתוף תרבותי. monolayers המחוברות של מד&quot;א-MB-157 תאים וfibroblasts גדל בצלוחיות T75 בדרך כלל נותנים ~ 7 x 10 6 ו ~ 6 x 10 6 תאים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הנפח הנכון מההשעיה של תאים תומכים להשעיה תאים סרטניים לתת יחס רצוי של מספר שני סוגי תאים. לדוגמא, השתמש יחס של 50 תאים סרטניים לתאי פיברובלסטים 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חרוטי המכילים את ההשעיה התא המעורבת במשך 5 דקות ב173.3 תאי XG וגלולים בנפח מתאים ללגרום לצפיפות סופית הכוללות כמויות שווה של מדיום גידול ו12.8% (w / v) DEX המימיפתרון שלב (שהוכן ב1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה השעיה תא וכתוצאה מלמעלה ולמטה כדי להבטיח ההומוגניות של ההשעיה. </li></ol> 4. הדפסה של Spheroids גידול לתוך צלחת 96-היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני ניסויים, צלחות מעיל שאינם מטופלים, מסביב לתחתית 96-היטב עם 1% (w / v) pluronic על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. ציפוי זה מונע תא קובץ מצורף על פני תקופת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 50 μl 5% המסוננים (w / v) שלב PEG המימי לבאר כל צלחת 96-היטב (צלחת יעד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, לערבב את ההשעיה התא (מוכן בשלב 2 או שלב 3 למונה ותרבות משותפת, בהתאמה), ולהוסיף 20 μl של ההשעיה לכל זה היטב מעמודה של צלחת 384 גם אחד (צלחת מקור) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המטפל הנוזלי ו&quot; הביתה &quot;ראש pipetting לרשום קואורדינטות. לאחר מכן לאסוף פרוטוקול שהוגדר בעבר (להלן ב4.6) כדי להבטיח מעבדתי ופרמטרים מוגדרים נכוניםly. זה צעד &quot;מתביית&quot; עשוי להיות שונה עבור מפעילי נוזל שונים. הערה: הזרימה של הפרוטוקול, שמוצג צעד-אחר-צעד בהמשך ב4.6, יהיה דומה ללא קשר למטפל נוזל רובוטית משמש; עם זאת, ממשק תכנות עשוי להיראות שונה בשל השימוש בתוכנות שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת המקור, צלחת היעד, ותיבות קצה פיפטה בעמדות מוגדרות בתחנת העבודה של המטפל הנוזלי כפי שמוצג באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את הפרוטוקול הכולל את השלבים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עומס עמודה אחת של חביות מהראש pipetting של המטפל הנוזלי עם ערבוב הטיפים פיפטה (8 טיפים) מתחנת העבודה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ההשעיה התא בבארות של צלחת המקור (איור 1). בחר ערבוב קטן יותר מתא ההשעיה הנפח בבארות כדי למנוע היווצרות בועת נפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא טיפים לתיבה ריקה טיפים פסולת (איור 1). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> עומס עמודה אחת של חביות מהראש pipetting עם טיפים פיפטה מחלק 10 μl (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב 0.3 μl של ההשעיה התא מצלחת המקור (איור 1) לכל קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר ההשעיה התא לתוך בארות של טור של צלחת יעד אחד (איור 1). השתמש בגובה לוותר של 0.5 מ&quot;מ וקצב זרימה לוותר של μl הקטן מ 1 / sec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.6.1 באמצעות 4.6.6 עד הדפסת טור-by-טור לכל צלחת היעד היא מלאה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את צלחת היעד ממשטח העבודה ולשים אותו בחממה לחה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לשמור אופקי צלחת כאשר נשא אותה לחממה כדי למנוע שיבוש של טיפות שלב DEX המכילות תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת למשך 24 שעות כדי לאפשר צבירה של תאים לתוך אליפטית בתוך טיפת שלב DEX. </li></ol> &lt;class = &quot;jove_title&quot; p&gt; 5. טיפול התרופתי של Spheroids תאים הסרטני שימו לב כי בפרוטוקול הבא הוא לטיפול תרופתי 4 ימים ויכלול את חידוש בתרופה טרי לאחר יום 2. זה יכול להיות שונה לתקופות טיפול אחרות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזותי לאשר היווצרות אליפטית ב96-גם צלחות לאחר 24 שעות. במידת הצורך, בארות תמונה למדידת הגודל של spheroids על ידי ממוצע הקטרים ​​הקטנים ביותר והגדולים ביותר של כל אליפטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון המניות של תרופה רצויה על ידי המסתו בממס המומלץ על ידי היצרן בריכוז מסיסות שנקבע מראש. לדוגמא, לפזר ציספלטין במים ב2 מ&quot;ג / מיליליטר. הערה: הגן על פתרון המניות של התרופה מהאור אם התרופה היא רגישה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בטכניקת דילול סדרתי, להכין ריכוזי תרופה מדוללים עם מדיום תרבית תאים ממניות הפתרון מוכן בשלב הקודם. כל דילול צריך להיעשות פעמיים הריכוז הרצוי. דיליחסי ution ישתנו בהתאם לריכוז המניה מתחיל ורצויים ריכוזים עובדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פתרון תרופה שהוכן בשלב הקודם לכל אחד. ניתן לעשות זאת על ידי רובוט או pipetting הידני. הערה: כל ריכוז תרופה יהיה מדולל במחצית לריכוז הרצוי על ידי שלב PEG המימי 50 μl כבר בכל טוב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש spheroids משני טורים של צלחת 96-היטב (n = 16) עבור כל ריכוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבארות שליטה, להוסיף רק 50 μl של מדיום תרבות טרי 50 μl הקיים של שלב PEG המימי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה spheroids עם התרופה במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, מוגנות מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות של דגירה, להכין דילולים טריים של התרופה בריכוזים רצויים ולחדש את התרופה על ידי הוספת 50 μl של פתרון תרופה טרי היטב כל אחד. הערה: הבארות כבר מכילות ריכוז התרופה הרצויה מt התרופה הראשוןreatment. לכן בשלב זה חידוש, כל ריכוז הנו מוכן בריכוז הרצוי שכן אין דילול יתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה spheroids עם התרופה לעוד שעה 48 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, המוגנת מפני אור. </li></ol> 6. ניתוח סלולרי ליכולת הקיום בSpheroids <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות של דגירה עם תרופה מחודשת (כלומר, זמן כולל של טיפול בspheroids עם סמים הוא 4 ימים), למדוד את הנפח הכולל של מדיום באחד היטב על ידי pipetting הידני. הערה: נפח אופייני ובאחד הוא ~ 140 μl (ירידה קטנה מתרחשת עקב אידוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הנפח של מגיב תא כדאיות (למשל, PrestoBlue) כריכוז של 10% מכלל גם הנפח. הוספת נפח זה של מגיב כדאיות תא היטב כל אחד. הערה: עם קיים נפח תקשורת של 140 μl בבאר, בהיקף של 15.6 μl נדרש לתת ריכוז של 10% מכלל תושבי עיר היטב. זה מחושב על ידיהחלוקה הקיימת תקשורת על ידי 9 (140 μl / 9 = 15.6 μl) הנפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת עם מגיב כדאיות תא מתווסף גם כל 6 שעות על 37 מעלות צלזיוס, המוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת בקורא מיקרו צלחת ולקרוא את אותות הקרינה ב 560 ננומטר ואורכי גל עירור 590 ננומטר ופליטה, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את כדאיות אחוזים מהתאים בspheroids ידי נרמול אות הניאון מבארות שטופלו לזה של בארות שליטה לאחר שקלול הערכים מאותם תנאי הטיפול. </li></ol>

<ol><li>Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systems biology in drug discovery.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).</li>
<li>Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+for+anticancer+drug+discovery--a+novel+approach+based+on+engineered+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines.</a> Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).</li>
<li>Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+microarrays+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Cell microarrays in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).</li>
<li>Gidrol, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+microarrays+in+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell microarrays in pharmacology.</a> Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).</li>
<li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).</li>
<li>Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decline+in+new+drug+launches%3A+myth+or+reality%3F+Retrospective+observational+study+using+30+years+of+data+from+the+UK%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK.</a> BMJ Open. 3, (2013).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+engineering%3A+the+other+face+of+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Tumor engineering: the other face of tissue engineering.</a> Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).</li>
<li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li>
<li>Carlsson, J., Yuhas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-overlay+culture+of+cellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Rec.+Results+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liquid-overlay culture of cellular spheroids.</a> Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).</li>
<li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+angiogenesis+studied+in+confrontation+cultures+of+multicellular+tumor+spheroids+and+embryoid+bodies+grown+from+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells.</a> FASEB J. 15, 995-1005 (2001).</li>
<li>Tekin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+microwells+for+formation+and+retrieval+of+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+chip%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates.</a> Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).</li>
<li>Patra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+uniform-sized+cell+spheroids+formation%2C+culture%2C+harvesting+and+flow+cytometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis.</a> Biomicrofluidics. 7, 54114(2013).</li>
<li>Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconfigurable+microfluidic+hanging+drop+network+for+multi-tissue+interaction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis.</a> Nat. Commun. 5, 4250(2014).</li>
<li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-ring+structures+stabilize+microdroplets+to+enable+long+term+spheroid+culture+in+384+hanging+drop+array+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates.</a> Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).</li>
<li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).</li>
<li>Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+cultures%3A+from+molecular+mechanisms+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications.</a> Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).</li>
<li>Minchinton, A., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumors.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
<li>Jeong, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+tension-mediated%2C+concave-microwell+arrays+for+large-scale%2C+simultaneous+production+of+homogeneously+sized+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies.</a> Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).</li>
<li>Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+imaging%2C+and+analysis+plate+for+facile+handling+of+384+hanging+drop+3D+tissue+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22JALA%22%5BJournal%5D)">Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids.</a> JALA. 19, 208-214 (2014).</li>
<li>Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput%2C+polymeric+aqueous+two-phase+printing+of+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Func.+Mater%22%5BJournal%5D)">High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids.</a> Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).</li>
<li>Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+aqueous+biphasic+tumor+spheroid+microtechnology+for+anti-cancer+drug+testing+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).</li>
<li>Albertsson, P. -A., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+diagrams%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzym%22%5BJournal%5D)">Phase diagrams.</a> Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).</li>
<li>Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+co-culture+patterning+using+aqueous+two-phase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems.</a> J. Vis. Exp. (73), (2013).</li>
<li>Frampton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+two-phase+system+patterning+of+detection+antibody+solutions+for+cross-reaction-free+multiplex+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA.</a> Sci. Rep. 4, 4878(2014).</li>
<li>Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+direct+visual+analysis+of+hydrolytic+enzyme+activity+using+aqueous+two-phase+system+droplet+phase+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions.</a> Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).</li>
<li>Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+spatio-temporally+controlled+cell+microprinting+with+polymeric+aqueous+biphasic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system.</a> Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).</li>
<li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanolitre+liquid+patterning+in+aqueous+environments+for+spatially+defined+reagent+delivery+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells.</a> Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).</li>
<li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+aqueous+biphasic+system+rehydration+facilitates+high+throughput+cell+exclusion+patterning+for+cell+migration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Func.+Mater%22%5BJournal%5D)">Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies.</a> Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).</li>
<li>Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+aqueous+biphasic+systems+for+non-contact+cell+printing+on+cells%3A+engineering+heterocellular+embryonic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches.</a> Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).</li>
<li>Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).</li>
<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li>
<li>Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444(2010).</li>
<li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li>
<li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li>
<li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+drug+screen%3A+considerations+and+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li>
<li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li>
<li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cance%22%5BJournal%5D)">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li>
<li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+tumours+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

Spheroids להציג מודל מציאותי כדי להבין טוב יותר פיזיולוגיה גידול ויעילות תרופה ולספק כלי שימושי לגילוי תרופות אנטי-סרטני. יישומים כגון יפיקו תועלת רבה מטכניקות דור אליפטית ותחזוקה פשוטות שרק דורשים מעבדתי סטנדרטי, כלים טיפול נוזליים וציוד הקרנה. השימוש במערכת דו-שלב מימית תאי סרטן לצבירה באופן ספונטני במסגרת שלב הירידה מאפשרת ייצור יעיל ותחזוקה של spheroids עם מפעילי נוזל רובוטית, ובטיפול תרופתי באתר וניתוח נקודת סיום של תגובות תאיות עם ריאגנטים וכלים מסחריים. כך...

מבחני מבוססי תאים לספק כלי חשוב לפיתוח והגילוי של תרופות אנטי-סרטניות חדשות. 1,2 מבחינה הסטורית, תרבויות monolayer של תאי הסרטן להיות מועסקת לחקור את היעילות של תרכובות מועמד מפני סוגים מסוימים של תאים סרטניים. קלות התחזוקה של תרבויות monolayer בתרבות צלחות סטנדרטית, התאימות של צלחות סטנדרטיים עם כלים רובוטיים מסחריים לתוספת של חומרים כימיים, ועם ציוד הקרנה לניתוח במורד הזרם של תגובות תאיות לתרכובות כימיות הם היתרונות העיקריים שהופכים את תרבויות 2D כלי אטרקטיבי לבדיקת סמים. 3 למרבה הצער, מבחני תא monolayer לעתים קרובות אינם מצליחים לחזות את היעילות של תרכובות in vivo, מה שהופך את פיתוח תרופות וגילוי תהליך יקר מאוד. 4,5 למרות השקעה משמעותית ומאמץ על ידי חברות תרופות ויחידות אקדמיות, ~ 1% בלבד תרופות אנטי-סרטני תרופות בניסויים קליניים אושרועל ידי ה- FDA בשני העשורים האחרונים. 6 פער בין תרבויות 2D and 3D הסביבה המורכבת של תאי סרטן בגוף חי הוא חסרון עיקרי של מערכות תרבות monolayer. 7 לכן, ההקרנה של תרכובות מועמד נגד תאים סרטניים בסביבה שדומה יותר ל סביבת גידול 3D עשויה לזרז פיתוח של תרופות כימותרפיות רומן. 8 spheroids תאים סרטניים להציג מודל 3D גידול רלוונטי במבחנה. 9,10 Spheroids הוא אשכולות קומפקטיים היוצרים באמצעות הרכבה ספונטנית או מושרה של תאים סרטניים על משטחים שאינם חסיד או בהשעיה תוך שימוש בטכניקות כגון בקבוק טווה, כיסוי נוזל, מיקרו microfabricated . גם מערכים, מיקרופלואידיקה, וטיפות תלויות 11-16 Spheroids לחקות תכונות עיקריות של גידולים מוצקים כוללים גיאומטריה ותחבורה מוגבלת של חמצן, חומרי מזון, ותרכובות תרופה לאזור המרכזי; ומכאן, שהם להתחדש respon התרופה באופן הדוק יותרse של גידולים מוצקים בהשוואה לתרבויות monolayer. 17-19 למרות היתרון הבולט הזה, spheroids אינו בשימוש שיגרתי עבור הקרנה של תרכובות כימיות כנגד תאים סרטניים. קושי לייצר spheroids בגודל אחיד בהגדרת תפוקה גבוהה סטנדרטית שתואמת לרובוטיקה זמינה מסחרי וכלים הקרנה / הדמיה פוגע שילוב של תרבות אליפטית לצנרת פיתוח תרופות. למרות שחומרים מותאמים אישית וצלחות הפכו זמינים מסחרי לאחרונה לתת מענה לצורך זה, שיקולי עלות להרתיע השימוש הנרחב שלהם. שתי טכניקות עיקריות עם היכולת לייצר spheroids בגודל עקבי בתפוקה גבוהה להשתמש פלטפורמת ירידת תלייה חדשה ומיקרו-בארות microfabricated. 13,16,20 עם זאת, שתי הגישות דורשות צלחות ומכשירים שהם יקרים כדי להמציא ולא נוחים למשתמשי קצה מיוחדים במרכזי מחקר ליבה והפרמצבטיקה בי EF הגדול ביותרמבצרים לגילוי של תרופות אנטי-סרטניות חדשות מתקבלות. למרות שיפור מסוים ביציבות של טיפות המכיל תא עם עיצוב האחרון של תליית צלחות ירידה, כל חור אחר רק של הצלחת עדיין משמש בתרבות, כדי למנוע התפשטות / מיזוג של טיפות. 16 זה מקטין את התפוקה ניסיונית באופן משמעותי. בנוסף לסמים והתחדשות קשה עם ידני או רובוטית pipetting וspheroids צריך להיות מועבר לתוך צלחת סטנדרטית לאנליזה ביוכימית כי תצורת צלחת זה לא בקלות בקנה אחד עם ציוד הקרנה קונבנציונלי כגון קוראי צלחת. 21 מיקרו-בארות מפוברקות באמצעות ליתוגרפיה הרכה גם לאפשר ייצור אליפטית גודל מבוקר. 13,20 עם זאת, אי התאמה של פלטפורמה זו עם כלים pipetting סטנדרטיים מונעת טיפול של spheroids הבודד עם תרכובות סמים / ריכוזים שונים, חושפת את כל spheroids למצב טיפול בודד. לכן, שיטה זו אינה מתאימה לגבוההקרנת מתחם תפוקה שדורשת בדיקות סימולטני של תרכובות / ריכוזים מרובים. כדי להתגבר על המכשולים הללו, טכניקה חדשה לייצור תפוקה גבוה של spheroids תאים סרטניים בגודל באופן עקבי ב96-גם צלחות סטנדרטי פותחה. 22,23 הגישה מבוססת על מערכת פולימרים מימית שני שלבים (ATPS) עם פוליאתילן גליקול ( לאחרונה PEG) וdextran (DEX) כמו פולימרים יוצרי שלב. 24 ATPSs כבר נוצל במגוון רחב של יישומים ביולוגיים תא הרומן לאפשר micropatterning תא ומקומי מסירה של חומרים כימיים ביולוגיים לתאים בתקשורת מימית מאוד. 25-32 כדי ליצור אליפטית, תאי סרטן מעורבבים עם שלב DEX המימי וירידה תת-microliter של ההשעיה וכתוצאה מכך הוא pipetted לפתרון שלב PEG המכיל גם הטבילה מימית. הירידה נשארה immiscible מהשלב הטבילה ותאי גבולות כדי להקל על היווצרות אליפטית. שֵׁדוֹןortantly, שלב הטבילה המימי מאוד מספק חומרים מזינים לתאים של אליפטית וממזער את הבעיה הידועה של אידוי תקשורת משותפת לכמה מבחני אחרים שגורמים לשינויים בosmolality תקשורת ותנודות של ריכוזי תרופה. טכניקה זו מאפשרת ייצור אליפטית וטיפול תרופתי רק באמצעות חומרים כימיים, זמינים מסחרית וכלים pipetting ב96-גם צלחות סטנדרטית. חשוב לציין, ניתוח של תגובות תאיות של spheroids מתבצע באותה הצלחת באמצעות מבחני ביוכימיים סטנדרטיים וקוראי צלחת. הקלות של עבודה עם ATPS וכושר הסתגלות של הגישה לטיפול נוזל רובוטית עושה דור תפוקה גבוה של שני מונו-תרבות ושיתוף התרבות spheroids טכניקת מעבדה פשוטה. גישה חדשה זו תהיה צעד גדול קדימה לכיוון אינטגרציה של spheroids תאים סרטניים בתהליכי פיתוח תרופות וגילוי עם תפוקת בדיקות משופרת ועלות-תועלת (מספר גדל והולך של תרכובות וredu נבדקוצריכת CED מגיב) ויעילות (הפחתת ידיים על זמן). פרוטוקול מפורט לייצור הרובוטית של spheroids תאים סרטניים ב96-גם צלחות בגישת ATPS מתואר להלן. בנוסף, פרטים של טיפול התרופתי של spheroids וכתוצאה מכך וניתוח במורד הזרם של תגובות תאיות באמצעות assay ביוכימיים מסחרי מוצגים.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>ריאגנטים וחומרים מתכלים</חזקים></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול, MW: 35,000</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>94646</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרן, MW: 500,000</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 9007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Clacein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>15663-27-1</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-108</td><td>Sigma Aldrich</td><td>542342</td><td></td></tr><tr><td>טיפים חד פעמיים (10 ומיקרו; l)</td> <td>Fluotics</td><td>C-P10V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>טיפים חד פעמיים (70 ומיקרו; l)</td> <td>Fluotics</td><td>C-P70V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות עגולות תחתונות</td><td>Nunc</td><td>268200</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>מטפל בנוזלים</td><td>Agilent Technologies</td><td>SRT Bravo</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Biotek Instruments</td><td>Synergy H1M</td><td></td></tr></tbody></table>

הפקה רובוטית של תאי סרטן spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

ספרואידים של תאים סרטניים מציגים מודל רלוונטי במבחנה של גידולים אווסקולריים ליישומים לבדיקת תרופות נגד סרטן. פרוטוקול מפורט לייצור ספרואידים חד-תרבתיים וקו-תרבויות בפורמט צלחת של 96 בארות בתפוקה גבוהה מתואר בעבודה זו. גישה זו משתמשת במערכת דו-פאזית מימית כדי להגביל תאים לטיפה של השלב המימי הצפוף יותר השקוע בתוך השלב המימי השני. הטיפה מונחת על פני הבאר ושומרת על תאים בסמיכות ליצירת ספרואיד יחיד. טכנולוגיה זו הותאמה למטפל בנוזלים רובוטיים כדי לייצר ספרואידים מבוקרי גודל ולזרז את תהליך ייצור הספרואידים ליישומי סינון תרכובות. ספרואידים שטופלו בתרופה בשימוש קליני מראים ירידה בכדאיות התאים עם עלייה במינון התרופה. השימוש בצלחת מיקרו-באר סטנדרטית ליצירת ספרואידים מקל על ניתוח הכדאיות של תאים סרטניים של ספרואידים שטופלו בתרופות עם קורא מיקרו-צלחות. טכנולוגיה זו פשוטה ליישום הן באופן רובוטי והן עם כלים אחרים לטיפול בנוזלים כגון פיפטות ידניות.

תחנת העבודה של המטפל הנוזלי רובוטית מוצגת באיור 1. ראש pipetting וכל התחנות בשימוש בהדפסה רובוטית של spheroids בסעיף 4.6 מסומנות. התמונה מציגה את השימוש בשתי תחנות שונות לתיבות קצה (סט אחד של טיפים לערבוב והסט השני לaspirating / מחלק של תערובת שלב תא השעיה מימי DEX). כל ההתקנה שוכנת בתוך ארון בטיחות ביולוגית סטנדרטי כדי לשמור על סטריליות. איור 2 מתאר סכמטי של התהליך &quot;ההדפסה&quot; עם המערכת דו-שלב המימי. טיפ פיפטה עמוס ההשעיה התא בשלב המימי DE...

מוצג פרוטוקול להדפסה רובוטית של ספרואידים של תאים סרטניים בפורמט צלחת של 96 בארות בתפוקה גבוהה באמצעות מערכת דו-פאזית מימית.

הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור pH של תאי סרטן בפורמט סטנדרטי של סריקה רחבה (high throughput), במטרה להשתמש בהם בבדיקות של תרופות נוגדות סרטן. דבר זה מושג תחילה על ידי המסת שני פולימרים, פוליאתילן גליקול ודקסטראן, במצע גידול תאים בריכוזים שנקבעו מראש, ליצירת מערכת מימית דו-פאזית תקינה. השלב השני הוא הכנת התאים הרלוונטיים בצפיפות תאים כפולה מהצפיפות הרצויה, וערבוב ת сусפנסיית התאים עם נפח שווה של הפאזה המימית של הדקסטראן.לאחר מכן, מלאו פלטה בעלת 96 בארות בפאזה המימית של polyethylene glycol והניחו טיפות בנפח של פחות ממיקרוליטר של פאזת dextran המכילה תאים לתוך הבארות באמצעות רובוט לטיפול בנוזלים. השלב הבא הוא אישור היווצרות הספרואידים בפלטות בעלות 96 הבארות לאחר 24 שעות של אינקובציה, והוספה ישירה של תרופות אנטי-סרטניות רלוונטיות לבארות. לבסוף, נעשה שימוש במבחן חיוניות סטנדרטי התואם לקורא פלטות כדי להראות את אחוז החיוניות של הספרואידים שטופלו בתרופה, בנורמליזציה מול ספרואידים שאינם מטופלים כביקורת.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטת הטיפה התלויה (hanging drop) או גישת הבארים המיוצרות במיקרו-פבריקציה, הוא שאינה דורשת פלטות או התקנים מותאמים אישית ומאפשרת יצירה של ספירות ובדיקת תרופות בסביבת סריקה רחבה (high throughput). שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח במחקר הסרטן ולהאיץ את הגילוי של תרופות כימותרפיות נגד סרטן. ההשלכות של טכניקה זו חולות על הטיפול בסרטן, שכן היא מאפשרת סריקה רחבה של תרכובים כימיים באמצעות מודלים של גידולים רלוונטיים יותר, במטרה לזהות תרופות חדשות נגד סרטן.אנשים שאינם מכירים שיטה זו יוכלו להכין בנוחות סטרואידים של תאי סרטן ופלטות מיקרו-בארים, ולבצע בקלות ניסויי טיפול בתרופות תוך שימוש בציוד מעבדה סטנדרטי ובכלים רובוטיים. כדי להתחיל, שקלו 0.5 גרם של polyethylene glycol והוסיפו אותם ל-9.5 מיליליטר של מצע גידול מלא בתוך מבחנה קונית סטרילית של 15 מיליליטר. ערבבו את התערובת במכשיר וורטקס במשך דקה אחת כדי להכין 10 מיליליטר של פאזה מימית של polyethylene glycol בריכוז של 5% משקל לנפח. לאחר מכן, שקלו 0.128 גרם של dextran והוסיפו אותם ל-0.87.הוסף שני מיליליטר של מצע גידול מלא לשפרויר מיקרו-צנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מיליליטר. ערבב את התערובת במערבל Vortex למשך דקה אחת כדי להכין מיליליטר אחד של פאזה מימיים של dextran בריכוז 12.8% משקל לנפח. הנח הן את תמיסאות ה-polyethylene glycol והן את תמיסאות ה-dextran במקלח מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.כדי לסייע בהמסה מלאה. ודאו שהפקקים נשארים מעל מפלס המים כדי למנוע זיהום אפשרי לאחר שעה אחת. הסירו את תמיסת הפנים של הפוליאתילן גליקול והעבירו אותה למזרק פלסטיק סטרילי של 5 mL.סננו את התמיסה דרך מסנן מזרקה עם נקבי 0.2 micron כדי להסיר זיהומים. שמרו הן את תמיסות הפאזה של הפוליאתילן גליקול והן את אלו של הדקסטראן בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius למשך עד 24 שעות לפני השימוש. גדלו תאי סרטן רלוונטיים, כגון קו תאי סרטן השד M-D-A-M-B 1 57, עד להגעה ל-90 עד 100% התמזגות (confluent).לאחר מכן, קצרו את התאים באמצעות טכניקות סטנדרטיות וספרו את התוצר באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer); השביו את המשקע לריכוז של 50 מיליון תאים למיליליטר בתערובת של מחצית מצע גידול ומחצית תמיסת strand. דבר זה מבטיח צפיפות של כ-15,000 תאים לטיפה של 0.3 µL. העבירו 50 µL של פאזה מים של 5% polyethylene glycol מסוננת לכל באר בלוח 96 באערים לא-נדבקים שעובד מראש עם onic כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. ניתן להוסיף את ה-polyethylene glycol באופן ידני באמצעות פיפט רב-ערוצי או באופן רובוטי באמצעות מערכת לטיפול בנוזלים. ערבבו את תרחיף התאים על ידי פיפטור עדין למעלה ולמטה כדי להשביעם.השעה תאים ששקעו עם הזמן. הוסף 20 µL מהתמיה לכל באר שנייה בעמודה אחת של פלטה בעלת 384 באערים. לאחר מכן, הפעל את מערכת הטיפול בנוזלים (liquid handler) ובצע איפוס (home) לראש הפיפטינג.כדי לרשום את הקואורדינטות, מקם את פלטת המקור, פלטת היעד וקופסאות הראשים של הפיפטה במיקומים מוגדרים על תחנת העבודה של מערכת העברת הנוזלים. באמצעות מערכת העברת הנוזלים האוטומטית, בחר נפח ערבוב, בערך שליש מנפח תרחיף התאים, וטען עמודה אחת של חביות מראש הפיפטור של מערכת העברת הנוזלים עם ראשי פיפטה לערבוב מתחנת העבודה. השתמש במערכת העברת הנוזלים כדי לערבב את תרחיף התאים בפלטת המקור בעלת 384 בארות.לאחר מכן, השליכו את הטיפים לקופסת טיפים ריקה. בשלב הבא, טענו עמודה אחת של חביות מרأس הפיפטור בטיפים לפיפטה לדיספנסינג של 10 µL. השתמשו במערכת לטיפול בנוזלים כדי לשאוב 0.3 µL של תרחיף התאים מלוח המקור לתוך כל טיפ פיפטה.לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים לבארות של עמודה אחת בלוח היעד, המכילה 50 µL של פאזה של 5% polyethylene glycol. השתמשו בגובה הפצה של 0.5 mm והפיצו את הטיפה בקצב זרימה של 1 µL לשנייה או פחות. חזרו על תהליך זה עד שכל העמודות בלוח היעד יכילו תאים. עם סיום הפעולה, הוציאו בזהירות את לוח היעד מתחנת העבודה והדריכו את התאים בסביבה לחית בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 24 שעות לפני כל טיפול תרופתי.אישור חזותי של היווצרות סטרואידים בכל באער של פלטת 96 באערים לאחר 24 שעות בתרבית. השתמשו בדילול סדרתי להכנת התרופה הנבדקת, כגון cisplatin, לצורך הבדיקה. דללו את תמיסת המקור של התרופה לתוך מדיום התרבית כך שכל דילול יהיה בפי שניים מהריכוז הסופי הרצוי.ניתן לבחון עד חמישה ריכוזים שונים לכל פלטה בעלת 96 בארות; הוסף 50 µL של תמיסת התרופה אל פאזת הפוליאתילן גליקול של כל בארה. השתמש בשתי עמודות של שמונה בארות לכל קבוצת טיפול, כולל קבוצת ביקורת שבה מתווסף מצע גידול בלבד.דגרו את הסטרואידים עם התרופה למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide, תוך הגנה מאור. לאחר 48 שעות, הכינו דילולות תרופה טריות וחדשו את התרופה על ידי הוספה של 50 µL נוספים של מצע המכיל תרופה טריה בריכוז הרצוי. דגרו את ה-PHE למשך 48 שעות נוספות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide, תוך הגנה מאור.בשלב הבא, הוסיפו לכל באר ריאגנט לבדיקת חיוניות תאים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף, והדגירו את הפלטה במשך שש שעות ב-37 °C וב-5% carbon dioxide תוך הגנה מאור. עם סיום הבדיקה, הכניסו את הפלטה לקורא מיקרופלטות ומדדו את האות הפלואורסצנטי באורכי גל של 560 ו-590 nanometers לעירור ופליטה, בהתאמה. סריקה בסביבה של תפוקה גבוהה של תרופות נגד סרטן דורשת דרך הדירה ליצירת מאות ספרואידים בגודל אחיד.הגרף המוצג כאן מדגיש את השחזוריות של שיטה זו ליצירת ספרואידים. בפלטת 96 בארות סטנדרטית, נמצא קוטר ממוצע של 332 microns עם סטיית תקן של פחות מ-10%. נמצא כי השונות בקוטרי הספרואידים אופיינית להתפלגות נורמלית. כאשר הספרואידים נחשפו למשך ארבעה ימים לריכוזים שונים של cisplatin, תרופה כימותרפית קלינית, הם הראו תגובה תלוית-מינון לטיפולים.נמצא כי ריכוז התרופה עבור המינון הקטלני של 50% (LD₅₀) הוא 4.67 Micromolar. טיפול בתרופה בריכוזים קטלניים הוביל לפירוק של תאי סרטן. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים אותה תוך כשעתיים. במהלך ביצוע הפרוצדורה, חשוב לזכור לבדוק במהירות את היווצרות השלב המימי הדו-פאזי לפני המעבר לניסויי הדפסת סטרואידים. לאחר פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון חיתוך קריו-סקציוני, צביעה אימונוהיסטוכימית של דגימות סטרואידים ובדיקות ביולוגיות נוספות, וזאת במטרה להשיב על שאלות נוספות הנוגעים למטרות המולקולריות של תרופות בסטרואידים של תאי סרטן.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להקים תרביות תלת-ממדיות (3D) של תאי סרטן בדרך נוחה, ולבצע בדיקות תרופות בשיטה של סריקה רחבה (high throughput) באמצעות פלטות ומכשירים סטנדרטיים.

robotic-production-cancer-cell-spheroids-with-an-aqueous-two-phase

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנחנו מציגים את פרוטוקול לדור של מספרים גדולים (אלפים למאות אלפים) של-וגודל הספרואידים אחידים בשליטת הרכב גידול, באמצעות צלחות microwell זמינות מסחרי.

ייצור של מספר הגדול של spheroids גידול מבוקר גודל באמצעות צלחות microwell

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מהיר וגמיש ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים של תאים באמצעות צבירת תאים. זה מותאם בקלות לסוגי תאים מרובים ומתאים לשימוש במגוון יישומים כולל נדידת תאים, פלישה או מבחני אנויקיס, ולהדמיה וכימות אינטראקציות בין תאים-מטריצות.

שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית

אנו מתארים את התפתחות מודל מבוסס ספרואיד, תלת מימדי במבחנה זה מאפשר לנו לבדוק הסטנדרטי העכשווי של משטרי טיפול ניסיוני עבור הראש והצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים בשורות תאים, מכוון הערכת טיפול רגישות והתנגדות על ראשי תאים אנושיים דגימות בעתיד.

טיפול בדיקות במודל תרבות המבוסס ספרואיד Cell תלת-ממד עבור קרצינומה של תאים קשקשיים בצוואר ואחראי

במגוון רחב של מחלות אינדיקציות, דגמים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית מתנהג הסמים מפותחת, מיושמים לתוך גילוי תוכניות. המערכת החדשה דגם המתוארים כאן מדגים איך תלת מימדי הגידול יכול להיות תרבותי ולא הוקרן תפוקה גבוהה 1536-ובכן צלחת מערכת מבוססת לחיפוש תרופות חדשות אונקולוגיה spheroids.

מהדור בתפוקה גבוהה תלת מימדי הגידול Spheroids להקרנה סמים

פרוטוקול זה תוכנן כדי להעריך immunotherapeutic cytotoxicity T-cell (המכונית T-cell) שנותבו מחדש נגד 3D מובנות תאים סרטניים (spheroids) בזמן אמת.

וזמינותו הרג ספרואיד על-ידי תאי T המכונית

פרוטוקול זה מתאר את הדור של מטופלים שמקורם בחולים, וניתוח במורד הזרם כולל כימות של התפשטות, בדיקות ציטורעילות, הזרמת cy, כתמים והדמיה מיקוד, על מנת להעריך את התרופה פוטנציאל המועמדים כtherapeutics אנטינאופלסטית. פרוטוקול זה תומך ברפואה מדויקת עם זיהוי תרופות ספציפיות לכל מטופל ולשלב המחלה.

החולה הפיזיולוגי הנגזרות 3D Spheroids עבור הקרנת תרופות אנטי-נאופלסטית כדי למקד את תאי גזע הסרטן

פרוטוקול זה מפרט שיטה לייצור של שלושה סוגים שונים של כדוריות באופן שהופך אותם מתאימים להקרנה וניתוח תוכן גבוה בקנה מידה גדול. בנוסף, מוצגות דוגמאות המראים כיצד ניתן לנתח אותם ברמות של כדורי ותאים בודדים.

שיטה איתנה לייצור בקנה מידה גדול של כדורים ליישומי סינון וניתוח בעלי תוכן גבוה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר יצירת מודלים תלת-ממדיים של תרביות גידול מתאי סרטן ראשוניים והערכת רגישותם לתרופות באמצעות בדיקות כדאיות תאים ובדיקות מיקרוסקופיות.

קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות

אנו מציגים פרוטוקול לגידול ספרואידים בעלי יכולת שחזור גבוהה ואפיונם הפנוטיפי באמצעות לכידת תמונה ופרוטאומיקה.

ניתוח פנוטיפי חצי אוטומטי של תרביות תאים ספרואידים תלת-ממדיים פונקציונליים

מאמר זה מדגים שיטה סטנדרטית לבניית ספרואידים תלת מימדיים של גידולים. כמו כן מתוארת אסטרטגיה לתצפית ספרואידית וניתוח למידה עמוקה מבוססת תמונה באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית.

יצירת ספרואידים תלת ממדיים להערכת תרופות

במאמר זה, אנו מתארים שיטות שונות ליצירת ספרואידים רב-תאיים לביצוע מעקב אחר מיקרוסקופ תאים חיים מרובי פרמטרים. באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי לכל החיים (FLIM), אוטופלואורסצנטיות תאית, צבעי צביעה וננו-חלקיקים, מודגמת הגישה לניתוח מטבוליזם של תאים, היפוקסיה ומוות תאי בסרטן תלת-ממדי חי (3D) ובספרואידים שמקורם בתאי גזע.

ייצור ומיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של תאים חיים מרובי פרמטרים (FLIM) של ספרואידים רב-תאיים

למדו הדפסה רובוטית של תאי סרטן ספירואידים במערכת מימית דו-שלבית לבדיקת סמים נוגדי סרטן בפורמט 96-באר. שיטה זו מאפשרת סינון בקיבול גבוה של תרכובות כימיות.

הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים

גלה סרטונים נוספים