Name: פלייט מדרגי 96-גם בהתבסס iPSC תרבות וייצור באמצעות מערכת רובוטית טיפול נוזל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: למד שיטה רובוטית לתרבות תאי גזע iPSC בפלטות 96-בארים לייצור קרדיאומיוציטים. הפרוטוקול מאפשר הרחבה מדרגית עם שמירה על פלוריפוטנטיות ויציבות כרומוזומית לטיפולים רегенרטיביים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקי NIH, R44 GM087784 וR01 HL109505. מחברים מודים לצוות הטכני וOEM בGilson, INC לתמיכה טכנית מורחבת.

המחברים MKC, MJG, EEB, NJD וRO הם או היו בזמנם של עובדי פיתוח של InvivoSciences, INC שהגו ופיתחו את הפרוטוקולים רובוטית שתוארו כאן. TW הוא CSO לInvivoSciences INC. SH הנו עובד Gilson INC.

<html> במחקר הנוכחי פיתחנו שיטה של ​​תרבות רובוטיות לייצור iPSC שממזערת וממכן האכלה והמעבר בפורמט צלחת 96-היטב גם בעת מאפשרת קנה מידה עד יעילה. רובוט טיפול נוזלי שימש להאכיל באופן שגרתי מושבות iPSC ומעברם במרווחים זמן קבועים על ידי ניתוק האנזימטית. הרובוט גם לתכנת לייצר צלחות מצופים ג&#39;ל מטריקס ולבצע שיפוע צפיפות זריעה. כאשר פיברובלסטים וiPSCs שומן נגזר היו בתרבית במערכת זו ליותר מ -20 קטעים, כ -3 חודשים, pluripotency נשמר, כמו היו karyotypes היציב. שני שורות התאים היו מסוגלים בידול לשריר לב. יחד, האוסף של פרוטוקולים שתואר כאן מאפשר למשתמשים עם ניסיון מועט מאוד בתאי גזע תרבות, או גישה מוגבלת לציוד תרבות מיוחד, לתאי גזע תרבות ולהשיג ייצור תאים גבוה או רב-קו טיפול עם מינימאלית עבודה ועלות. s = &quot;jove_content&quot;&gt; הפרוטוקולים רובוטית המפורטים כאן מספקים שיטה לקנה מידה עד חסכוני של ייצור וטיפול iPSC. יתרון אחד הוא התרבות של תאי גזע להרחבה בפורמט המבוסס צלחת הוקמה הפגין כאן והעבר 44,47 - 49 כדי לשמור על pluripotency. בעוד פורמטים אחרים של תאי pluripotent תשואת תרבות תאי גזע מדרגי 20,23,29 שיטה מבוססת צלחת זה דורש בעצם לא חל שינוי בפורמט התרבות, כמו adaption להשעיה, שימוש בכימיקלים או antifoaming שימוש ממושך של מעכבי Rho-kinase 20. שיטה מבוססת צלחת זו ולכן במהירות, וצפויה יכולה, להכיל קווים חדשים, כי תנאי התרבות דומים. ככל שהשימוש בiPSCs לדוגמנות מחלה מגביר 4,6,19,50, קווי iPSC חדשים נוצרים באופן רציף. הטכניקות המתוארות כאן הן מתאימות ביותר לקווי תרבות חדשה במדיום לעוצמת שמע גבוה ותפוקה בגלל המחסום למעבר אל הפורמט הוא lאוו. זה נכון גם לעבודה והציוד הדרוש כדי לשמור על המושבות. לבסוף, בגלל הפורמט והטיפול דומים לסביבה המשמשת לחישוב ולאמת קווי iPSC, ביצועי תרבות, כגון בידול מכוון, עשוי להיות צפויים יותר. איור 8 ממחיש אסטרטגיה אחת לקנה מידה מייצור תאי גזע ב96-גם צלחות. צלחת אחת (מחזור 0) משמשת לזרע רובוט 12 צלחות חדשות, גידול של פי 12 (מחזור 0-1). אחרי כמה ימים של האכלה, אחד משנים עשר הצלחות הוא passaged זרע קבוצה נוספת של שנים עשר צלחות (מחזור 1 למחזור 2). הצלחות עשר שנותרו זמינות כעת לשימושים אחרים ומייצגות את רכיב הייצור של המערכת. בקצב הזה, מעבר של צלחת אחת יספק 11 צלחות בכל מחזור, או כל 3-4 ימים. מתודולוגיה זו וניתן לשנותם יותר כאשר צלחות מרובות passaged כפי שמוצגות במעבר מהמחזור 2 למחזור 3. במחזור 3, שתי צלחותתמיד נהג לשמור על המושבה והזרע 24 צלחות חדשות. 22 צלחות הנותרות אז זמינות לשימוש לאחר כל מחזור מעבר. בכל נקודה במחזור תחזוקת המשתמש יכול זרע יותר צלחות להגדיל את הייצור. דוגמא אחת תהיה מעבר לכל עמודה לשני מחזורי צמיחה. המעבר הראשון ממיר צלחת אחת לשנתי עשר צלחות, וכל אחד מעשר הצלחות משמש לזרע 144 צלחות. במקרה זה, משתמש מתחיל עם צלחת אחת ואחרי שני מעברים, או על 1.5-2 שבועות של תרבות, יש 144 צלחות. לדוגמא, קווי iPSC פיברובלסטים ושומן להניב כ 25-75,000,000 תאים לכל צלחת 96-היטב כאשר מוכנים למעבר. 144 צלחות לכן יכולות לייצג על 4-7 x 10 9 תאים. מהו נטל העבודה לביצוע 144 96-גם צלחות רובוט? אחת המטרות לעבודה זו הייתה הפקת תאי גזע להרחבה שצמצמה עבודה בהשוואה ל( צלחת כלומר, 6 היטב) מסורתית נובע תרבית תאים. ACC הרובוטomplishes זה על ידי הקלה בצורך להתמודד מבחינה פיזית כל צלחת במהלך ההאכלה וpassaging. בעוד קשקשי ייצור צלחת 96-היטב באופן ליניארי כמו שזה יהיה ב6-גם צלחות מסורתיות, זמן טכנאי מבלה בעבודה עם הצלחות הוא פחות משמעותי באמצעות תרבות רובוטית. יעילות הייצור של תרבות רובוטית נגזרת מהבדל זה (איור 9). נמצא טכנאים יכולים להסיר 6-גם צלחת מן החממה, לבדוק את זה במיקרוסקופ, אז לשאוב ולהאכיל את הצלחת בכ -3.5 דקות. לשם השוואה, טכנאים לבלות כ -30 שניות הסרת צלחת 96-היטב מהחממה ובודקים אותו במיקרוסקופ לצפיפות וזיהום לפני הצבתו על הרובוט. עם פרוטוקול האכלה מורחב דומה לזה שתואר לעיל, ניתן לטעון שש 96-גם צלחות והפד, אשר לוקחת כ -21 דקות, או 3.5 דקות לכל צלחת. סה&quot;כ הזמן שחלף כדי להאכיל את הצלחת הוא השוואה בין הרובוטIC ושיטות ידניות, אלא יד להאכיל 6 צלחות טכנאי נדרש לכל 21 דקות ואילו הטכנאי מבלה רק 3 דקות טיפול שש הצלחות לרובוט (בדיקת 30 שניות לכל צלחת). כאיור 9 מופעים, זמן טכנאי מבלה טיפול 144 צלחות באמצעות הרובוט הוא כ -1.2 שעות לעומת 8 שעות באופן ידני והרובוט לעולם לא יעשה טעות טיפול הצלחות או העברת נוזלים. שיטות תרבות iPSC 96-היטב המתוארות כאן לספק פלטפורמה צייתנית למשימות הקרנה מורכבות. מכיוון שכל גם הוא זהה מבחינה גנטית וזרע באותו צפיפות מאותו המאגר הראשוני, יכול להיות מופץ משתנה בין הצלחת ומתוחזק על ידי הרובוט עם מאגרים זמינים מסחרי להפריד תנאים. זה יהיה שימושי עבור ניסויים כגון פיתוח צמיחת תאי גזע תקשורת 34,35,47, בדיקות מצע או מצב התרבות ומחקרי רעילות ניצול תאי גזע51. מאז כל שורת תאי גזע היא ייחודית במונחים של דרישות גודל מושבה והמעבר אופטימליות, ניתן להשתמש במערכת זו לווסת צפיפות זריעה, תדירות האכלה וטיפול מעבר על ידי מניפולציה של העמודות שנקטפו, התסיסה המכנית במהלך מעבר ותדירות ההאכלה. Iterating דרך המשתנים הללו יאפשר למשתמש למצוא במהירות סט של תנאים מתאימים לתרבות של קו חדש או לפתח טכניקות תרבות חדשות. מערכת רובוטית היא גם מסוגלת לשמור על 96 מושבות תאי גזע מקבילות אך עצמאיות. כאשר iPSC נגזרים מהתאים סומטיים או משובט לאחר מניפולציה גנטית, רבים שיבוטים מקבילים מוקרנים להניב קווי iPSC פוטנציאליים. ברגע שתאים בודדים הם זורעים לתוך 96-גם צלחות, מערכת זו יכולה להאכיל ומעבר 96-גם צלחות שמירה כל מושבה הפרדה. זה מאפשר תפוקה גבוהה מאוד בעת בחירת שיבוטים פוטנציאל ומבטל את הקושי בculturing הפיזי 96 קווים מקבילים. שיטה זו גםllows בקנה המידה גדול ייצור של כל שיבוט כך חומר שכבר זמין לניתוח מקביל. לבסוף, אנו רואים שילוב טכניקות אלה התרבות עם מערכת סחר צלחת רובוטית המספקת צלחות ומהחממה מאפשרת תרבות אוטומטית לחלוטין. זה יכול להיות מושלם עם יותר רובוטיקה המורכבת המאפשרת להרחבה גדולה יותר מאז הפרוטוקולים הבסיסיים שתוארו כאן הם להעברה למערכות אחרות המבוססות צלחת. השלבים הקריטיים הראשונים כדי לטפל בפרוטוקולים הם אלה המונעים ולבדוק לזיהום כגון צעדים 1.5 ו -4.2. זיהום, כפי שפורט לעיל, ניתן להימנע בהצלחה אם טכניקה סטרילית טובה ושכל ישר מנוצלים. זה הכרחי, ללא קשר לפורמט תרבות תאי גזע, שצק המפעיל לזיהום ועושה זאת בפרוטוקול זה בצעדים שצוינו יהיה להפחית באופן משמעותי את הסיכון לזיהום. יישום ג&#39;ל מטריקס הנכון הוא ESS שניצעד ential להצלחה הכוללת של פרוטוקול זה. ללא ציפוי כראוי 96-גם הצלחות, תאי הגזע לא יגדלו. בעיה נפוצה אחת היא ציפוי גם לא שלם. ניסיון הוכיח כי בועות אוויר, משיכה אלקטרוסטטית ופעולת נימים לעכב ציפוי גם מלא. הצעד מראש ההרטבה (1.6) פותח כדי לשפר את הציפוי גם תחתון באופן משמעותי ולא צריך לדלג עליו. צעד ההרטבה מראש זה מופיע כדי להפחית את הידרופוביות לכאורה של צלחת 96-היטב פלסטיק כך שכאשר ציפוי ג&#39;ל מטריקס מיושם הוא מופץ באופן שווה על פני גם תחתי ודפנות. מומלץ גם לטפוח בעדינות 96-גם הצלחות נגד יד נקייה מצופה פעם אחת כדי להבטיח הפצת פתרון ג&#39;ל מטריקס אפילו תאית. הפרמטרים הניתוק הם גם חשובים כדי לייעל. דגירה ממושכת עם אנזים או מגיב ניתוק מבוסס EDTA תגרום תאים בודדים שיכולה או לא יכולה להיות המטרה במעבר. לכן, המפעילצריך להקדיש תשומת לב מיוחדת לאופן שזמן ניתוק, כוח טחינה דקה, וחזר שוב ושוב לשטוף להשפיע מורפולוגיה מושבה ובריאות ולהתאים בהתאם. הבנת המגבלות לטכניקות המתוארות כאן הן בעל חשיבות עליונה לפעולה מוצלחת. כמו בכל הגדרת תרבות תאים אחרת, השימוש בלוחות 96-גם מהווה סיכון לזיהום גבוה יחסית. כפי שתואר לעיל, טכנאי הוא טיפול בכל צלחת במהלך ההאכלה וpassaging; לדוגמא, בעת פתיחת המכסה, לשים את הצלחת על מיטת הרובוט, ולבדוק את הצלחת על המיקרוסקופ. לכן, כאמור, לאחר שלב 1.5, זה הכרחי שלא לגעת בחלק הפנימי של כל מכסה צלחת או לחשוף את החלק הזה לכל משטח מזוהם כמו בלוקים המשופעים חימום או סיכות אנכיות על המיטה. במהלך פיתוח פרוטוקול מגבלה זו התגלתה והייתה המניע לפיתוח מתלה להחזיק מכסים בצלחת כדי לשמור על סטריליות. כמו כן, מאגרי השוקת, טיפים pipet וoאספקת יס על מיטת רובוט טיפול הנוזלית הן מקורות פוטנציאליים לזיהום, כי הם פתוחים לסביבה ומטופלים על ידי הטכנאי. לכן, טכניקה סטרילית טובה צריכה להיות מיושמת כמו צמצום תנועות על פני חומרי תרבות חשופים או נוזלים פתוחים. מגבלה נוספת היא שכאשר הפרוטוקול בקנה מידה גדול, מבחינה ויזואלית בודק כל גם של&gt; 100 96-גם צלחות היא מסורבל. זה יכול להיות מטופלים על ידי חזותי בודק את כל הצלחת לסימנים של זיהום, כגון תקשורת עכורה, לזהות בארות חשודות. לקנה מידה עד עתיד, שימוש במיקרוסקופ ומחוון של צמיחת תאים וזיהום פוטנציאלי אוטומטיים ישולב. לסיכום, 96-גם הפלטפורמה מבוססת התפוקה גבוהה שתוארה כאן מציעה שיטה לשחזור, איכות גבוהה לתרבות תאי גזע והפקה בפורמט צלחת. שיטה זו מקטינה את הניסיון הנדרש, זמן דרוש ועבודת ציוד הייעודי לגזע תוך תרבית תאיםשמירה על היתרונות של תרבות חסיד מסורתית.

השימוש בתאים אנושיים הנגרם pluripotent גזע (iPSCs) גדל באופן משמעותי מאז גזירתם בשינה 2007 1 לבדיקת מתחם, רפואת רגנרטיבית ומודלים מחלה 2-6. דרישה זו מגיעה מהיכולת של iPSC להניב מספר גדול של תאי pluripotent שיכול להיות מובחן לתוך תאים סומטיים בכמות שאין כמותו. טכניקות בידול מכוונים לשפר 7-10 ופיתוח של תאים אנושיים או דוגמנות רקמה וטיפול בתאים מגביר 11-14, כך גם הדרישה לייצור המוני של iPSCs באיכות גבוהה. הוא ציטט נרחב שבין מחלות אחרות, אוטם שריר לב או החלפה פונקציונלית ב-תא ידרוש מאות מיליון למליארד iPSC נגזר תאים סומטיים 15-18. דוגמנות רקמת 3D יתר על כן, מורכבת יותר ויותר לגילוי תרופות ולאherapy ידרוש מספר גדול של תאים 9,13,19. בכל דוגמאות הללו, מוגדרים, אחידים וiPSCs לשחזור חייב להיות זמין ופשוט כדי לייצר. על מנת לייצר גזע biopharmaceutics תא נגזר ותאים להנדסה והשתלת רקמות, טכנולוגיית תא-ייצור חסכוני היא חיונית. ייצור בקנה מידה של iPSCs התמקד בתרבות השעיה 20 - 25 או השעיה עם השימוש במצעי microcarrier 26-28 גם בגלל טכניקות אלה פרוסות בהצלחה בקנה מידה גדולה שאינו iPSC ייצור מבוסס,, האיקריוטים. מספר קבוצות הפגינו מערכות תרבות השעיה שתנבנה תאי גזע pluripotent 20,21,23,24,29. עם זאת, גישות אלה לנצל מערכות יקרות ומורכבות לא זמינות לחוקרים לפתח תוכניות בידול רומן, נהיגה הנדסת רקמות ועושה Laboratמחקר בקנה מידה אורי. יתר על כן, תרבויות iPSC השעיה וmicrocarrier דורשות הסתגלות וטכניקות או כימיקלים לא מצאו בתרבות iPSC חסיד מסורתית כגון שימוש רצוף של מעכבי Rho-קינאז, סוכני antifoaming וסינון להסדיר צבירה. לחץ פיזי לתאים שכיח יותר בתרבות השעיה, שהוצג על ידי תסיסה מכאנית, כמו גם במהלך התנגשות microcarrier. נושאים אלה מגבילים את יכולת החיזוי והמהירות שבה נוצר זה עתה נובע יכול להיות מתורבת שורות תאים בתרחיף. אחרים פיתחו מערכות טיפול צלחת רובוטית המחקות טכניקות תרבות צלחת 30,31 אבל פלטפורמות אלה דורשים השקעות משמעותיות לציוד ומומחיות לפעול בנוסף לאתגרים הבסיסיים הקשורים לתרבות תאי גזע. העבודה הבאה מתארת ​​את הפיתוח ותרגול של מערכת תרבות iPSC מדרגי שמנצל נוזל עצמאי, סטנדרטי ערוץ 8-רובוטיתצלחות מטפל ו96-היטב. שיטה זו נועדה לגשר בקנה מידה המעבדה תרבות iPSC וייצור iPSC בנפח גבוה (למשל, 10 7-1.5 x 10 9 תאים לכל שבוע לטכנאי) המאפשרים פיתוח טכנולוגיות אלה iPSC חדשים בקנה מידה בקלות את הייצור ללא השקעות בחומרה או בעבודה גדולה. שיטה זו היא זולה יחסית להגדיר, דורשת לא מעט ניסיון תרבות תאי גזע, תכנות או הנדסה, יש לו טביעת ציוד קטנה ללא הצורך במכסת מנוע תרבית תאים ייעודי, ומשתמשת בציוד תרבית תאים סטנדרטי כדי לאפשר בינוני עד גבוהה תפוקה האוטומטית ייצור תאים. המטרה הייתה לפתח מערכת מסוגלת תרבות תאי גזע להרחבה שיכולה להיות מנוצלת על ידי מעבדות חדשות לבלום תרבית תאים, אלה שימצאו במדריך טיפוח מחסום לפיתוח הרעיונות שלהם או אלה שרוצים אמצעי חסכוני לייצר מספר גדול של תאי גזע. הפלטפורמה שהוצגה כאן מסירה השפעת טכנאי בגזע תרבות תא ומנרמל את נהלי האכלה ומעבר כדי לאפשר ייצור תאי גזע עולה בקנה אחד.

<table><tbody><tr><td>צלחות 96 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3596</td><td>96 בארות; נפח באר: 360&nbsp; &#956; l; שטח גידול תאים: 0.32&nbsp; cm2; עטוף בנפרד</td></tr><tr><td>שוקת סוסון ים</td><td>SeahorseBio</td><td>201308-100</td><td>מאגר 4 חלק שקוף פולי פרופלן 73 מ"ל 25/Cs</td></tr><tr><td>טיפים גילסון</td><td>F167023</td><td></td><td>10 מתלים גילסון 96 טיפים D200 טיפים</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12500062</td><td>אבקת DMEM/F12. יש להשעות את הבקבוק ב-1 ליטר מים מטוהרים בדרגת תרבית תאים ומסנן סטרילי.</td></tr><tr><td>גורם גדילה מופחת Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>המכונה "ג'ל מטריצה חוץ-תאית" בטקסט. מטריגל GFR, 10&nbsp; ml</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5857</td><td>mTeSR1 ערכה מלאה לתחזוקת hES.</td></tr><tr><td>ערכת E8 Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td>TeSR-E8 לתחזוקת hESC/hiPSC</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>AdooQ BioScience</td><td>A11001-50</td><td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>ACCUTASE</td><td>המכונה "מגיב דיסוציאציה פרוטאוליטי וקולגנוליטי" בטקסט. אקוטאז 500&nbsp; מ"ל תמיסת תאים סטריליים</td></tr><tr><td>PBS</td><td>פישר</td><td>SH30256FS</td><td>PBS ללא Ca Mg 500&nbsp; ml, 6/pk</td></tr><tr><td>Gilson PIPETMAX Gilson</td><td></td><td>PIPETMAX</td><td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td></tr></tbody></table>

פלייט מדרגי 96-גם בהתבסס ipsc תרבות וייצור באמצעות מערכת רובוטית טיפול נוזל

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

קידום המשיך בתרבית תאי גזע pluripotent סוגר את הפער בין הספסל והמיטה לשימוש בתאים אלה ברפואת רגנרטיבית, גילוי תרופות ובדיקות בטיחות. על מנת לייצר גזע biopharmaceutics תא נגזר ותאים להנדסה והשתלת רקמות, טכנולוגיית תא-ייצור חסכוני היא חיונית. תחזוקה של pluripotency וביצועים יציבים של תאים ביישומים במורד הזרם (לדוגמא, התמיינות תאים) לאורך הזמן היא בעל חשיבות עליונה לייצור תאים בקנה מידה גדול. עם זאת, זה יכול להיות קשה להשגה במיוחד אם הם תאים בתרבית באופן ידני שבו המפעיל יכול להציג את ההשתנות משמעותית, כמו גם להיות יקר בקנה המידה-עד. כדי לאפשר תפוקה גבוהה, ייצור תאי גזע בקנה מידה גדולה ולהסיר פרוטוקולי תרבות תאי גזע רומן השפעת המפעיל באמצעות ספסל העליון רב-ערוצי נוזל טיפול רובוט פותחו הדורשים מעורבות טכנאי מינימאלית או ניסיון. עםתאים אלה אנושי פרוטוקולים מושרה גזע pluripotent (iPSCs) היו בתרבית בתנאים ללא מזין ישירות ממניות קפוא ונשמרו ב96-גם צלחות. בהתאם לשורת תאים ושיעור בהיקף של עד רצויה, המפעיל יכול בקלות לקבוע מתי מעבר מבוסס על סדרה של תמונות המראות את צפיפות המושבה האופטימלית לפיצול. אז ריאגנטים הצורך מוכנים לבצע פיצול מושבה לצלחות חדשות בלי צעד צנטריפוגה. אחרי 20 קטעים (~ 3 חודשים), שני קווי iPSC נשמרו karyotypes היציב, הביעו סמנים של תאי גזע, ומובחנים לשריר לב עם יעילות גבוהה. המערכת יכולה לבצע הקרנת תפוקה גבוהה הבאה של פרוטוקולים חדשים בידול או מניפולציה גנטית נועדו ל96-גם צלחות. טכנולוגיה זו תפחית את נטל העבודה וטכני לייצר מספר גדול של תאי גזע זהים למספר עצום של יישומים.

הפרוטוקולים המתוארים מאפשרים למעבדות לבצע תרבית תאי גזע ניתנת להרחבה בתפוקה גבוהה עם עלות השקעה מינימלית של עבודה, ניסיון וציוד באמצעות רובוט טיפול בנוזלים הניתן לתכנות וצלחות של 96 בארות. iPSCs שעברו יותר מ-20 פעמים במערכת זו שמרו על פלוריפוטנטיות, קריוטיפים נורמליים והתמיינו לקרדיומיוציטים.

פלייט מדרגי 96-גם בהתבסס iPSC תרבות וייצור באמצעות מערכת רובוטית טיפול נוזל

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להקים באופן הדיר תרבית תאים פלוריפוטנטיים ניתנת להרחבה. דבר זה מושג תחילה באמצעות שימוש ברובוט לטיפול בנוזלים שתוכנת מראש להזרעת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בצפיפויות משתנות. בשלב השני, בלוחית של 96 בארות, מזוהות באופן חזותי הבארות בעלות צפיפויות מושבות אופטימליות לצורך אריזה.תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים המושרים נזרעים לאחר מכן בצלחות חדשות לצורך הזנה אוטומטית ואריזה נוספת. בסופו של דבר, הליך זה מאפשר את בחירת צפיפויות הזריעה המיטביות להרביית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מושרים לצורך התמיינותם הסופית לתאי שריר לב (cardiomyocytes). השלכותיה של טכניקה זו חולשות לעבר פיתוח טיפולים רגנרטיביים ומותאמים אישית בקנה מידה בינוני.רובוט לתרבית תאי גזע פוטנטים של URI מתאים לייצור של כמה מאות מיליוני תאי גזע פוטנטים של URI תוך מספר ימים, אותם ניתן להבדיל לאחר מכן לתאים שונים לצורך בדיקת תרופות מותאמת אישית או לטיפול בהשתלת תאים ורקמות. למרות ששיטה זו יושמה לסריקת צפיפויות זריעה להרחבה אופטימלית של תרבית תאים פלוריפוטנטיים, ניתן להשתמש בה גם לאופטימיזציה וזיהוי של פרוטוקולי בידל חדשים לסוגי תאים שונים אחרים. את הפרוטוקול ידגים מדען רוקחות, ניל דיילי מהמעבדה שלי. לפני תחילת תהליך ההזנה, בדקו את פלטת 96 הבארים של מושבות תאי הגזע לאיתור זיהומים וכדי לוודא שצפיפות מושבת התאים נמוכה מצפיפות המעבר האידיאלית.אם התאים במצב טוב, הניחו את הפלטה במקום המיועד לה. מקמו אותה על המסילה בעלת השיפוע בטמפרטורה של 37 degrees Celsius של רובוט טיפול בנוזלים, והעמיסו את רשת הקצות במקום המיועד לה. השתמשו בקצות פיפטה של 200 microliter בטמפרטורת החדר.מקמו תבנית עם ארבעה בארות (four well trough) בעמדת מיקום שתיים ומלאו את בארה שלוש של התבנית בשמונה מיליליטר של מצע גידול תאי גזע טרי בטמפרטורת החדר, ללא מעכב RO kinase. לאחר מכן, העבירו את הפלטה למסגרת החזקת הפלטות, ובאמצעות לוח הבקרה הרובוטי בחרו ברצף ב-"Run the protocol colony feed one plate" ולאחר מכן ב-"next", ואז לחצו על "test run" כדי להשתמש באשף ההדרכה שלב-אחר-שלב לבדיקה מוקדמת של התוכנית שנבחרה. כאשר הפרוטוקול מאושר, בחרו ב-"run protocol". לאחר ההאכלה, הוציאו את פלטת 96 הבארות של מושבות תאי הגזע.לאחר מכן, רשמו את פרטי אירוע ההאכלה על מכסה הפלטה והחזירו אותה לאינקובטור לתרביות תאים למשך 24 שעות, עד להאכלה או למעבר התאים הבא. בחירת הבאר לפיצול תלויה בצפיפות המושבה. מספר ימים לאחר הגדרת מדרג צפיפות זריעה בפלטה זו, ניתן לראות באר שהיא צפופה מדי לפיצול, באר בעלת צפיפות אידיאלית לפיצול, ובאר דלילה מדי למעבר לאחר מספר מחזורי האכלה.יש לוודא כי המרווח בין רוב המושבות בלוחית 96 הבארות הוא 25% מקוטר המושבה הסמוכה, אחרת הזנה מאוחרת יותר תגרום למושבות לגדול אחת לתוך השנייה. לאחר מכן, אם המושבה אינה מזוהמת, יש להניח את הלוחית במעמד (bed). מקמו שלושה על השיפוע של 37 מעלות וטענו את מתקן הקצוות (tip rack) במעמד.מקמו במיקום one טיפים של פיפט בנפח 200 microliter בטמפרטורת החדר. מקמו תבנית עם ארבעה בארות (trough) במיקום bed position two, ולאחר מכן, תוך השארת בארה ארבע ריקה, העבירו 8.5 milliliters של מצע גידול לתאי גזע המועשר במעכב rho kinase Y 2 7 6 3 2 לבארה שלוש, 3.5 milliliters של רכיב לפירוק פרוטאוליתי וקולגנוליתי בריכוז 30% לבארה שתיים, ו-4.5 milliliters של PBS לבארה אחת.במיקום הבא, הניחו פלטת 96 בארות חדשה, מחוממת מראש ב-37 °C ומצופה בג'ל של extracellular matrix, בעמדה חמש, והעבירו את מכסי הפלטות הישנים והחדשים למסגרת מחזיקי המכסים. כעת, השתמשו במסך המגע של בקר הרובוט כדי לבחור ברצף "run a protocol colony split one to 12 column one", ולאחר מכן ב-"next". לאחר מכן, בחרו ב-"test run" כדי להשתמש באשף ההדרכה שלב-אחרי-שלב לבדיקת תוכנית נבחרת, ולאחר מכן ב-"run protocol".בסיום פרוטוקול המעבר, הוצא את שני המדחים. סמן את המדח החדש עם המידע הרלוונטי והחזר את המדחים לאינקובטור. במשך 24 שעות; התאים והמושבות אמורים להיצמד למדח בתוך שעתיים עד שלוש שעות לאחר הפיצול, והם ייראו פרוסים מאוד בשל נוכחותו של מעכב ה-RO kinase.לאחר ההאכלה הראשונה ללא מעכב RO kinase, התאים יתרכזו ויפגינו את מורפולוגיית תאי הגזע האופיינית מסוג cobblestone. חריגות כרומוסומליות נצפות לעיתים קרובות במהלך תרבית תאי גזע, אך הן עשויות שלא להשפיע על התפלגות סמני פלוריפוטנטיות כפי שמוצג בתמונות אלו; אכן, ניתוח קריוטיפ של תאים שגודלו לפי הפרוטוקול שהודגם זה עתה גילה כי לשני קווי תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים שעברו מעבר רובוטי היו 46 כרומוזומים תקינים, מה שמרמז ששיטת התרבית הרובוטית לא גרמה לחוסר יציבות כרומוסומלית מעבר למה שעשוי להתרחש באופן רגיל. כדי לבחון סמני ביטוי גנים מבוססים של תאי גזע בקווי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שגודלו באופן רובוטי, נאסף גם ה-RNA הכולל.שני קווי תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האינדוקביליים בניסוי זה הפגינו ביטוי דומה של סמני פלוריפוטנטיות, בעוד שהקרדיומיוציטים שהבדילו מכל קו לא הפגינו זאת, וכך גם קו נפרד של פיברובלאסטים מהעור האנושי. יתרה מכך, כאשר שני קווי תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האינדוקביליים הובדלו לקרדיומיוציטים, הם הפגינו יצירה ברורה של סרקומרים. יחד, נתונים אלו מצביעים על כך ששלושה חודשים ויותר מ-20 מעברים של תרבית רובוטית הביאו לתאים תקינים מבחינה כרומזומלית המפגינים תוכנית שעתוק העולה בקנה אחד עם פלוריפוטנטיות, ואשר היו מסוגלים גם להבדיל לקרדיומיוציטים.לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו עם הבנה טובה של האופן שבו משתמשים ברובוט לטיפול בנוזלים זה או ברובוט דומה כדי לגדל תאי pluripotents באופן ניתן להרחבה (scalable).

scalable-96-well-plate-based-ipsc-culture-production-using-robotic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בניה של ספריה fosmid עם הדנ"א הגנומי הסביבה מבודדים רצף העומק האנכי של פיורד hypoxic עונתיות מתואר. הספרייה שיבוט המתקבל הוא הרים את 384 גם צלחות בארכיון עבור סידור במורד וסינון תפקודית על ידי יישום של מערכת המושבה אוטומטיות קטיף.

הכנס גדול הסביבה הגנום ספריית הפקה

ניתוח כמותי כושר (QFA) היא סדרה משלימה של שיטות ניסיוניות חישובית לאומדן fitnesses התרבות חיידקים. QFA מעריך את ההשפעה של מוטציות גנטיות, תרופות או טיפולים אחרים החלים על הצמיחה חיידק. ניסויים דרוג מניתוח מרוכז של תרבויות בודדות לאלפי תרבויות מקבילות יכול להיות מתוכנן.

כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

מוצג פרוטוקול להדפסה רובוטית של ספרואידים של תאים סרטניים בפורמט צלחת של 96 בארות בתפוקה גבוהה באמצעות מערכת דו-פאזית מימית.

הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות תאים בודדים עם פלטפורמה מיקרופלואידית, המשתמשת בתפיסת עיצוב מיקרו-באר חדשה כדי לאפשר בידוד תא בודד ביעילות גבוהה ותרבית משובטת לטווח ארוך.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

מערכות אוטומטיות, פרוטוקולים עבור הכנת כמות גדולה של מסכי שגרתית ו nanoliter טיפות התגבשות לניסויים דיפוזיה אדי תיאר, דנו.

אוטומטית פרוטוקולים עבור התגבשות Macromolecular במעבדה MRC של הביולוגיה המולקולרית

פרוטוקול מפורט עבור הפעולה בו-זמניות של תרביות תאים מקבילים 48 בתנאים מגוונים במערכת microbioreactor מוצג. תהליך התרבות תאים, קציר וניתוח כייל נוגדנים הבאים מתוארים.

השימוש תפוקה גבוהה אוטומטית Microbioreactor מערכת לייצור של מודל IgG1 בתאים צ'ו

פרוטוקול זה משמש כמדריך מקיף לערבוב סטנדרטי וניתן לשחזור של חומרים צמיגים עם טכנולוגיית אוטומציה חדשנית בקוד פתוח. הוראות מפורטות ניתנות על פעולתה של תחנת עבודה בקוד פתוח שפותחה לאחרונה, על השימוש במעצב פרוטוקול קוד פתוח ועל האימות והאימות לזיהוי תערובות הניתנות לשחזור.

פלטפורמת טכנולוגיית קוד פתוח לייצור דגמי תרבות תלת-ממדית מבוססי הידרוג'ל באופן אוטומטי ומתוקנן

אנו מראים את האוטומציה של תרבויות תאי גזע פלורופוטנטיים (hiPSC) הנגרמים על ידי בני אדם ובדיונים עצביים התואמים להדמיה וניתוח אוטומטיים.

ייצור אוטומטי של נוירונים קורטיים קורטיים ודופאמין נגזר תאי גזע המושרה על ידי תאי גזע אנושיים עם ניטור משולב של תאים חיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למערכת תרבית תאים אוטומטית. מערכת תרבית אוטומטית זו מפחיתה את העבודה ומועילה למשתמשים, כולל חוקרים שאינם בקיאים בטיפול בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS), החל מתחזוקה של תאי iPS ועד התמיינות לסוגים שונים של תאים.

מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

פרוטוקול זה מתעד את הייצור וההרכבה של SPOT, פלטפורמת תרבית מבוססת פיגומים בתפוקה גבוהה, בפורמטים של 96 ו-384 בארות. הוא גם מפרט את תהליך הזריעה של SPOT, הן ידני והן באמצעות מטפל בנוזלים זמין מסחרית.

ייצור ניתן לשחזור של SPOT כפלטפורמת תרבות מבוססת פיגומים בתפוקה גבוהה

למד שיטה רובוטית לתרבות תאי גזע iPSC בפלטות 96-בארים לייצור קרדיאומיוציטים. הפרוטוקול מאפשר הרחבה מדרגית עם שמירה על פלוריפוטנטיות ויציבות כרומוזומית לטיפולים רегенרטיביים.

פלייט מדרגי 96-גם בהתבסס iPSC תרבות וייצור באמצעות מערכת רובוטית טיפול נוזל

גלה סרטונים נוספים