Name: שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: למד להשתמש במערכת TetON לביטוי גני ממוקד ברקמות ב-Danio rerio. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני התחדשות בזנב דג הזברה באמצעות דוקסיציקלין ואימונופלואורסצנציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים כריסטה האזה, דוריס וובר ובריג&#39;יט Korte לקבלת סיוע טכני. עבודה במעבדה וייגינגר נתמכת על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, אנחנו 4223 / 4-1 ועל ידי Gesellschaft für דויטשה Kardiologie באמצעות אוסקר-לאפ-Stipendium וקלאוס-גיאורג אונד Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.

<ol><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1%2FStat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).</li>
<li>Tryon, R. C., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+kit+ligand+a+functional+expression+reveals+lineage-specific+competence+to+promote+melanocyte+rescue+in+the+mutant+regenerating+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin.</a> PloS one. 9 (7), e102317(2014).</li>
<li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+defines+organizing+centers+that+orchestrate+growth+and+differentiation+of+the+regenerating+zebrafish+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin.</a> Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).</li>
<li>Huang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+a+myocardium-specific+transgene+in+zebrafish+transgenic+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines.</a> Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).</li>
<li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+2A+peptides+allow+expression+of+multiple+proteins+from+a+single+ORF+in+transgenic+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos.</a> Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Bussmann, J., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+BAC+selection+for+tol2-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PloS one. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+journal+%2F+National+Research+Council%2C+Institute+of+Laboratory+Animal+Resources%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610(2007).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).</li>
<li>Grabher, C., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganuclease+and+transposon+mediated+transgenesis+in+medaka%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

יש דג הזברה המבוגר יכולת מדהימה להתחדש בהצלחה רב איברים ואיברים פנימיים. הבנה מעמיקה של המנגנונים המולקולריים ותאיים המעורבים דורשת ניתוח רקמות הספציפיות של פונקציות גן ומסלולי איתות. לקראת זה, מערכת טיטון מספקת כלי יעיל לביטוי גנים מבוקר spatiotemporally בדג זברה עוברית ובוגרת. בונה מערכת טיטון והמתודולוגיה שתוארה בכתב היד הזה כבר השתמשו בהצלחה במחקר שנערך לאחרונה במעבדה שלנו 3. הנושאים נוספים הבאים יש לשקול בעת הקמת מערכת טיטון: <p class="jove_content" style=";tex...

דג הזברה הוא אורגניזם מודל חוליות מבוסס היטב ללמוד היבטים רבים של פיתוח, פיזיולוגיה, מחלות, והתחדשות. עם האימוץ הגובר של דג הזברה כמודל לתהליכי פוסט-עובריים ביולוגיים, כלים ניסיוניים למניפולציה של ביטוי גנים או מסלולי איתות מושרה, רקמות ספציפיות הפכו חשוב יותר ויותר. במיוחד, מחקרים לאיברים והתחדשות תוספת בדג זברה מבוגרת סובלים ממחסור בכלים לניתוח של דרישות מרחב ובזמן של מסלולי איתות בתהליכי התחדשות אלה. נכון לעכשיו, שלוש מערכות שונות שימשו להשגת ביטוי מותנה, רקמות ספציפיות גנים בהתחדשות איברים של דג הזברה מבוגרת: מערכת טיטון מערכת Cre-לקס, ביטוי פסיפס של transgenes מושרה חום-הלם באמצעות transgenesis הגופנית בתיווך transposon, ו1 -3. טיטון מתייחס לגרסה של טטרציקלין-המשךמערכת התגלגלה תעתיק הפעלה, שבו הביטוי מופעל בנוכחות טטרציקלין האנטיביוטיקה או נגזרת, למשל דוקסיציקלין. מערכת Cre-לקס, כפי שעד כה השתמש בדגים בוגרים, מסתמכת על recombinase שליטת טמוקסיפן Cre (CreERT2), הביטוי שהוא מוגבל במרחב על ידי גורמי רגולציה רקמות ספציפיות. ההסרה מונעת-Cre של קלטת STOP מאפשרת ביטוי של הגן של עניין מונע על ידי אמרגן שצריכה להיות פעיל בכל סוגי התאים 1. יצירה בתיווך transposon של transgenes הגופני הביע mosaically מספקת מערכת לביטוי transgene מושרה בשושלות תאים בודדות. הזרקה של עוברי דג הזברה עם transposon Tol2 נושא גן של עניין בשליטת תעתיק של תוצאות אמרגן הלם חום באנשי chimeric בדרך כלל נושאים את הגן רק בשושלות תאים נפרדות של איבר התחדשות 2. בעוד שני המערכות מאפשרות לרקמות SPE המותנהביטוי גני cific, מערכת Cre-לקס הוא לא הפיכה, ואת האסטרטגיה באמצעות תיוג משובט מבוסס transposon סובלת מהטבע סטוכסטיים שלה. לפיכך, אנו ואחרים לאחרונה מותאמים מערכות מהונדסים טיטון לשימוש בדג זברה, המאפשרות באופן זמני וביטוי גנים במרחב שבשליטה שהוא במתכונן בנוסף ו3-5 הפיכים. מערכת טיטון משמשת כאן כוללת קו מהונדס נהג (TetActivator) שבדוקסיציקלין (DOX) activator תעתיק -inducible (שיפור transactivator ההפוך טטרציקלין, irtTA, Teta הקצר) הוא תחת שליטה של ​​רצפים רגולטוריים הגנומי רקמות ספציפיות. שנית, היא דורשת קו מגיב מהונדס (TetResponder) שמטפח גן של עניין בשליטת תעתיק של מפעיל טטרציקלין; (איור 1 א) (אלמנט תגובת ט TetRE). לפיכך, השימוש בשילובים מסוימים של קווי TetActivator וTetResponder מאפשר לרקמות ספציפיות מותנותמניפולציה פיק של ביטוי גנים. יש לנו לאחרונה ניצלתי את מערכת טיטון לחקור לפונקציות רקמות הספציפיות של איתות / בטא קטנין Wnt במבוגרי התחדשות זנב דג הזברה סנפיר 3. בפרוטוקול המתואר כאן אנו מתארים את זרימת עבודה להקמה ושימוש במערכת טיטון בדג זברה, בפרט ללימודים של התחדשות סנפיר. זה כולל הוראות מפורטות על איך ליצור קווי TetActivator וTetResponder מהונדסים יציבים ופרוטוקול לזירוז transgene בעוברים ודג זברה מבוגרת. יתר על כן, אנו מתארים טכניקות לאימות ביטוי רקמות ספציפיות גנים בלהתחדש הסנפיר, כולל פרוטוקול להכנת cryosections של סנפירי דג הזברה מבוגרים. בנוסף, אנו דנים שיקולים לעיצוב של transgene TetActivator, הבחירה של שיטת transgenesis, וזיהוי של ביטוי TetResponder. לפיכך, המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לשמש כתכניתלהגדרה-עד מערכת טיטון פונקציונלית בדג הזברה להשיג ביטוי מותנה רקמות ספציפיות גן, אשר יכול להיות מיושם על כל רקמות של עניין. יצרנו וקטור TetActivator מאפשר לאני-SCEI או דור תיווך Tol2 של קווי TetActivator יציבים באמצעות רצפים רגולטוריים הגנומי קצרים (שברים משפר; מסד נתוני פלסמיד מעבדה וייגינגר לא 1,247;. איור 1). מבנה זה מכיל קלטת TetActivator בהיקף של גרסת המוטציה M2 של תחום זה מדכא את ההפוך ט התמזגו עם תחום נגזרים 3F transactivation VP16 וירוס הרפס סימפלקס [irtTAM2 (3F)]. ביטוי של TetActivator (Teta) יכול להיות במעקב בקלות שכן הוא עם AmCyan fluorophore מאותה מסגרת קריאה פתוחה הביע שיתוף; פפטיד p2a מתווך דילוג ריבוזומלי, שאמור לגרום לייצור של תטא וAmCyan חלבונים נפרדים של 1: 5,6 יחס 1. המבנה מכיל גם poylinker 5 &#39;של Tקלטת etActivator כדי להקל על החדרה של רצפים רגולטוריים הגנומי של עניין באמצעות שיטות שיבוט קונבנציונליות. בנוסף, יצרנו מבנה המורכב של הקלטת מעל תיארה TetActivator בתוספת קלטת בחירת Kanamycin (מסד נתונים פלסמיד מעבדה וייגינגר לא 1,180;. איור 1 ג), שבו ניתן recombined לתוך כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) המכילה אזור הגנומי גדול ( בדרך כלל לקודון ההתחלה של גן הביטוי שתבנית היא לחיקוי על ידי transgene). שני המבנים זמינים מהמעבדה וייגינגר על פי דרישה.

<table><tbody><tr><td>קופסאות גידול</td><td>Aqua Schwarz</td><td>AquaBox 1</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי מורכב</td><td>למשל, Leica, Zeiss</td><td>משתנה עם היצרן</td><td>כדי לצלם קטעי רקמה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>למשל, Leica, Zeiss</td><td>משתנה עם היצרן</td><td>כדי לצלם קטעי רקמה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>למשל, Leica, Thermo-Scientific</td><td>משתנה עם יצרן</td><td>להקפאה</td></tr><tr><td>4', 6- דיאמידינו-2-פנילינודול (Dapi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>השתמש ב-1/5,000 ב-PBS להדמיה של גרעינים</td></tr><tr><td>דוקסיציקלין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9891</td><td>הכינו מלאי ב-50% EtOH ב-50 מ"ג/מ"ל (97 מ"מ) עבור אינדוקציה של TetResponder</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>4% (w/v) paraformaldehyde ב-PBS, pH 7.5 לקיבוע</td></tr><tr><td>1x תמיסת מלח פוספט-חוצץ (PBS)</td><td></td><td></td> <td>1.7 מ"מ KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5</td></tr><tr><td>1x מי מלח פוספט-בופר + טווין 20 (PBT)</td><td></td><td></td> <td>1x PBS עם 0.1% Tween 20</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus שקופיות מיקרוסקופ הידבקות</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>1014356190</td><td>לאיסוף קטעי רקמות</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו</td><td>למשל, Leica, Zeiss</td><td>משתנה עם היצרן</td><td>עבור גנוטיפ מבוסס פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>למשל, Biorad, Applied Biosystems</td><td>משתנה עם היצרן</td><td>עבור גנוטיפ מבוסס PCR</td></tr><tr><td>מדיום הקפאת רקמות (TFM)</td> <td>Triangel Biomedical Sciences</td><td>TFM-C</td><td>להטמעת רקמות דגימות</td></tr><tr><td>טריקאין (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>לשימוש בהרדמה ב-1 מ"ג/מ"ל במדיום עוברי E3</td></tr></tbody></table>

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

דג הזברה הפך לאורגניזם מודל חשוב מאוד לחקר התפתחות בעלי חוליות, פיזיולוגיה, מחלות והתחדשות רקמות. הבנה מעמיקה של המנגנונים המולקולריים והתאים המעורבים דורשת כלים ניסיוניים המאפשרים מניפולציה ספציפית לרקמה של ביטוי גנים או מסלולי איתות. לכן, אנחנו ואחרים התאמנו לאחרונה את מערכת TetON לשימוש בדגי זברה. מערכת TetON מאפשרת ביטוי גנים מבוקר זמנית ומרחבית ולאחרונה השתמשנו בכלי זה כדי לחקור פונקציות ספציפיות לרקמות של איתות Wnt/beta-catenin במהלך התחדשות סנפיר זנב דג הזברה. כאן אנו מתארים את זרימת העבודה לשימוש במערכת TetON להשגת ביטוי גנים ספציפי לרקמה בסנפיר הזנב המתחדש של דג הזברה הבוגר. זה כולל יצירת קווי TetActivator ו-TetResponder טרנסגניים יציבים, אינדוקציה טרנסגנית וטכניקות לאימות ביטוי גנים ספציפיים לרקמה בהתחדשות הסנפיר. לפיכך, פרוטוקול זה משמש כתוכנית להקמת מערכת TetON פונקציונלית בדגי הזברה והשימוש בה לאחר מכן, במיוחד לחקר התחדשות סנפירים.

להקים מערכת טיטון פונקציונלית לביטוי רקמות ספציפי גנים מושרה, TetActivator המהונדס וקווי TetResponder צריכה להיות שנוצר (איור 1 א). המטרה זו מושגת על ידי microinjecting TetActivator (איור 1 ב - C) או TetResponder (איור 1E) בונה לעוברי דג הזברה מוקדמים ואינטגרציה נבט-שורה שלאחר מכן. יכולים גם להיות שנוצרו מבני TetActivator פונקציונליים על ידי שיבוט של רצפים קצרים רגולציה (אלמנטים משפר) במעלה הזרם של קלטת TetActivat...

כאן אנו מתארים את זרימת העבודה לשימוש במערכת TetON להשגת ביטוי גנים ספציפי לרקמה בסנפיר הזנב המתחדש של דג הזברה הבוגר.

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להקים מערכת TED-on תפקודית בדגי zebrafish כדי להשיג ביטוי גנטי מותנה וספציפי לרקמה, כפי שמוצג בסרטון זה בזנב הנregenerating. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת קווי טרנסגנים של Tet activator המבטאים מפעיל שעתוק הניתן להשראה על ידי טטרהציקלין המסומן ב-am cyan ברקמה הרלוונטית, וקווי Tet responder המכילים גן עניין עם תג ype תחת בקרה של אלמנטים המגיבים ל-Tet. לאחר מכן, מוקמים שילובים ספציפיים של דגי טרנסגנים כפולים מסוג Tet activator ו-Tet responder.לאחר מכן, ביטוי של טרנסגן Tet responder ספציפי לרקמה מושרה באמצעות מתן doxycycline. לבסוף, ביטוי הטרנסגן Tet responder מאומת על ידי הכנת חתכי רקמה של סנפירים שעברו רגנרציה. בשלב הסופי, נעזרים באימונופלואורסצנציה כדי להדמיות של ביטוי הטרנסגן Tet responder הספציפי לרקמה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון ביטוי גנים המושרה על ידי הלם תרמי, הוא שמערכת זו מאפשרת ביטוי גנים הניתן להשראה ולהפיכה באופן ספציפי לרקמה. שיטה זו יכולה לסייע בהשגת הבנה מעמיקה יותר של רשתות השליחויות המולקולריות המנחות את התחדשות סנפיר הדג, שכן היא מאפשרת ניתוח של מסלולי השליחויות ותפקוד גנים ברקמות בודדות. בעוד שאנו משתמשים בטכנולוגיה זו כדי לחקור התחדשות סנפיר של דגי זברה, היא יכולה להועיל גם בהקשרים רבים אחרים הדורשים מניפולציה של תפקוד גנים באופן ספציפי לרקמה.לאחר יצירת קווי דגים של Tet responder בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש לבחון את האינטגרציה לקו הנבט ואת יכולת ההשראה של הגן החוצה (transgene) על ידי הזווגה של דגי G zero בודדים עם קו Tet activator שהוקם בעבר. לאחר מכן, יש לאסוף עוברים ולגדל אותם עד לשלב שבו ניתן להעריך את השראת ה-Tet responder. הכין תמיסת סטוק של 2000 x doxycycline באמצעות 50% ethanol להמסת ה-doxycycline כדי להגיע לריכוז של 50 mg/mL.יש לאחסן מנות של docks בהגנה מאור בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכין מצע עיב embryos E3 המכיל docks בריכוז סופי של 25 µg/mL. לאחר מכן, שפוך את מרבית מצע ה-E3 מהעיברים.החליפו את הנוזל ב-dos המכיל מצע E3 והחזירו את העוברים לטמפרטורה של 28.5 °C למשך שש שעות לפחות. לאחר הדגירה, השתמשו במיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי כדי לסרוק את העוברים לאיתור פלואורסצנציית Y pet. הקימו מספר קווי Tet responder טרנסגניים יציבים מהמייסדים שזוהו זה עתה.בחרו שורות הגורמות לאינדוקציה חזקה ומראות פסיפס (mosaicism) מועט בתוך תחום הביטוי הצפוי, וכן שונות מועטה בין עוברים בודדים. לאחר ביסוס שורות הדגים של Tet activator ו-Tet responder, הצליבו נשאי Tet activator עם נשאי Tet responder כדי להפיק דגים טראנסגניים כפולים. בחרו עוברים הנושאים את הטראנסגן של Tet activator באמצעות סריקה של פלואורסצנציית am cyan במיקרוסקופ סטריאואסקופי, וגדלו עוברים חיוביים ל-am cyan עד לבגרות.זהו דגים בוגרים טרנסגניים כפולים הנושאים את ה-Tet responder בנוסף ל-Tet activator באמצעות גנוטיפינג מבוסס PCR או על ידי יכולתם להשרות ביטוי של ה-Tet Responder ברקמה הרלוונטית כדי לבצע Tail Fin Tation. הרדם דגי זברה בוגרים בכלי כימי מלא במי דגים המכילים 160 micrograms per milliliter של trica. כאשר הדג מפסיק לנוע, השתמש בפינצטה כדי להעבירו בזהירות לצלחת פטרי הפוכה והשתמש בסכין מנתחים כדי לבצע קטיעה חלקית של סנפיר הזנב לטיפול ב-docs. הכן תיבות רבייה עם ליטר אחד של מי מערכת דגים המכילים 25 micrograms per milliliter של doxycycline.כביקורת שלילית, הוסיפו 250 microliters של אתנול במקום doxycycline למכלי הרבייה המכילים ליטר אחד של מי מערכת דגים; העבירו עד 10 דגים טרנסגניים כפולים לכל מכלי רבייה והניחו את המכלים בחושך כדי להפחית את רמת הלחץ. לאחר מינימום של שש שעות, הרדימו והעבירו את הדגים שעברו טיפול לצלחת מצופה ב-aros רטוב, והשתמשו בפינצטה כדי לפרוש את הזנב. לבסוף, תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה, סננו את הדגים כדי לבחון הופעה של Y PET בתוך הרקמה המתחדשת.לאחר מכן ניתן להשתמש בדגים לטיפולים נוספים או להחזירם למערכת גידול הדגים כדי להפסיק את השראת הטרנסגן של ה-responder בעקבות קטיעה חלקית של הסנפיר וטיפול ב-docs. קטוע שוב את נשגבי הסנפיר בנקודה הנמצאת כארבעה עד חמישה מקטעים גרמיים פרוקסימלית למישור הקטיעה הראשוני, ובנקודת זמן התלויה במערך הניסוי שלך, כפי שתואר קודם לכן בסרטון זה. בעזרת פינצטה ובמגע עם חלק הגדם של הרקמה בלבד, הנח בזהירות את נשגבי הרקמה בצורה שטוחה בתוך צלחת פטרי קטנה המכילה 4% weight per volume של PFA ב-PBS, וקבע אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את הנשגבים פעמיים לפני העברתם ל-0.5 molar E-D-T-A-P-B-S לצורך דה-קלציפיקציה של המטריקס הגרמי בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה. לאחר מכן, הדגר את הנשגבים בסדרה של סוכרוז ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בכל שלב, ולבסוף בחלקים שווים של 30% sucrose PBS ותווך הקפאת רקמה למשך 30 דקות נוספות.העבירו את הסנפירים לתווך הקפאת רקמות והדגירו בטמפרטורה של 4 °C למשך שעתיים לפחות. לאחר מכן, הניחו תבניות הקפאה (cryo molds) על זכוכית כיסוי של מיקרוסקופ ומלאו אותן בתווך הקפאת רקמות. העבירו את הרגנרטים אל תבניות ההקפאה וכוונו את הרקמה כדי לקבל חתכיםlongitudinal או transverse.יש לוודא שהנבט (regenerate) ישר כדי להקל על ביצוע החיתוכים. העבירו את תבניות הקריו (cryo molds) יחד עם זכוכית המיקרוסקופ למגש מתכת המונח על שכבת קרח יבש כדי להתחיל בתהליך ההקפאה. כאשר המדיום מוצק, העבירו את תבניות הקריו חזרה לטמפרטורת החדר כדי לאפשר למדיום להפשיר בממשק שבין המדיום לפלסטיק.לאחר מכן, בעזרת מכשיר כגון עט, דחפו את הבלוק הקפוא אל מחוץ לתבנית הקריו (cryo mold) ואחסנו בטמפרטורה של 80°C- עד לביצוע חיתוך באמצעות מיקרוטום קריו (cryo microtome). אספו חתכים בעובי 10 עד 14 µm על גבי שלגשייות מיקרוסקופ עם שכבת היצמדות ואחסנו את השלגשייות בטמפרטורה של 20°C- עד למועד השימוש. כדי לאפיין את ביטוי ה-Tet responder בחתכי סנפיר, טפלו בחתכים ב-100%MEOH שקוירר לטמפרטורה של 20°C- למשך 30 דקות.הסר בזהירות את הנוזל באמצעות נייר סופג. לאחר מכן, שטוף את החתכים פעמיים ב-PBT ופעם אחת ב-PBS למשך חמש דקות בכל פעם. דגור את החתכים למשך 10 דקות ב-dappy לפני שטיפה פעמיים ב-PBS למשך 10 דקות בכל פעם.לאחר מכן, השתמשו בחומר קיבוע Antifade ובזכוכית כיסוי כדי לקבע את הדגימות לפני ביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקאלית או בשדה רחב (wide field) לצילום הדגימות, לאחר שהוקמה מערכת TET פונקציונלית בדגי zebrafish. ניתן להשתמש במערכת זו כדי לבחון תפקוד של גנים או מסלולי איתות ברקמות בודדות. כפי שמוצג כאן, אקטיבטור TET המונע על ידי מקדם HER 4.3 משרה ביטוי של רספונדר TED רק בתת-קבוצה של רקמות הרגנראט; פלואורסצנציית YFP מזוהה בבלאסטמה הפרוקסימלית הפרוליפרטיבית, בעוד שבבלאסטמה הדיסטלית ובאפידרמיס אין ביטוי.ביטוי של המעכב WNT beta-Catenin המכונה axin 1 בדומיין HER 4.3 המכיל את התאים הפרוליפרטיביים של הבלסטמה, באופן מפתיע, אינו משפיע על פרוליפרציה של תאי רגנרציה. נתון זה מרמז כי סיגנל Wnt beta-catenin בבלסטמה הפרוקסימלית הפרוליפרטיבית אינו ממלא תפקיד חיוני בבקרת הפרוליפרציה של תאי הבלסטמה. לעומת זאת, שימוש בקו Tet activator המונע על ידי פרומוטור ubiquitin להשראת ביטוי של axin 1 בכל רקמות הרגנרט של הסנפיר מפריע באופן משמעותי לפרוליפרציה של תאי רגנרציה.בנוסף, ביטוי של axon one בדומיין HER 4.3, שאינו כולל אוסטאובלסטים, מפריע באופן משמעותי ליצירת עצם ברגנראט. לפיכך, הפרעה ספציפית לרקמה של סיגנלינג wind באמצעות מערכת TE on חושפת תפקידים עקיפים בלתי צפויים של סיגנלינג wind בבקרת פרוליפרציה של תאים ורגנרציה של עצם. לאחר השליטה בשיטה זו, ניתן להשתמש בה לביטוי גנים מודע ומכוון בכל רקמה רצויה.יישמנו בהצלחה שיטה זו כדי לבחון תפקודי רקמה ספציפיים של סיגנלינג ניקוטין במיטת הרוח בסנפיר הזנב המתחדש של דג S. שימוש בשיטה זו יסייע להשגת הבנה מקיפה יותר של הגורמים המולקולריים המסדירים את התחדשות הרקמה.

use-teton-system-to-study-molecular-mechanisms-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים שיטה תנאי מציאה ביטוי של חלבון המטרה במהלך רגנרציה דג הזברה למבוגרים סנפיר. טכניקה זו כוללת מיקרו הזרקה ו electroporating oligonucleotide morpholinos antisense לרקמת סנפיר, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של חלבון בשלבים שונים של התחדשות סנפיר, כולל ריפוי פצעים, יצירת blastema, ואת תוצאה רגנרטיבית.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך למבוגרים התחדשות זנב סנפיר דג הזברה

השיטה שהוצגה כאן מהווה פגיעה המדויקת של עוברי דג זברה לחיות עם פעימות ליזר באנרגיה גבוהה ועל ניתוח בדיעבד של פגיעות אלה וההתאוששות שלהם עם זמן. אנו גם מראים איך שכותרת גנטית בודדה או קבוצות של תאי שריר שלד יכולות להיות במעקב בזמן ואחרי ניזק מושרה אור ליזר.

פגיעת הליזר הביא על שריר שלד עוברי דג זברה

לאחר חיתוך רוחב השדרה, יש דג הזברה מבוגר התאוששות תפקודית על ידי שישה שבועות לאחר פציעה. כדי לנצל את שקיפות זחל והתאוששות מהירה יותר, אנו מציגים שיטה לtransecting חוט השדרה הזחל. לאחר חיתוך רוחב, אנו צופים התאוששות חושית מתחילים ב 2 ימים שלאחר פציעה, ותנועת C-עיקול על ידי 3 ימים לאחר פציעה.

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

שיטה להתאמה הפוכה גנטית לדג זברה כדי להעריך את תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות והומאוסטזיס פיסיולוגי כגון התחדשות רקמות באמצעות זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי.

הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה

כדי לשפוך אור על המנגנונים התאיים והמולקולריים של נוירוגנזה והתחדשות בוגרים של דג הזברה, פיתחנו פרוטוקול לניתוח פולשני הגורם לפציעות מכניות בטלנצפלון הבוגר של דג הזברה וניטור לאחר מכן של שינויים בחצי הכדור הדקירה על ידי אימונוהיסטוכימיה או הכלאה באתר.

פציעה דקירת פצע של דג הזברה telencephalon מבוגרים: שיטה לחקר המוח של בעלי החוליות Neurogenesis והתחדשות

כאן אנו מציגים שיטה אמינה לחקר התחדשות כליות במבוגרים על ידי גרימת פגיעה כלייתית חריפה על ידי הזרקת גנטמיצין. אנו מראים כי הפציעה תלויה במינון הגנטמיצין ובטמפרטורת הסביבה באמצעות הכלאה באתרה כדי לתייג lhx1a+ מפתח נפרונים חדשים.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

אנו מציגים פרוטוקול ללכידת הדינמיקה של התחדשות סנפיר זנב זחל דג הזברה בקנה מידה של רקמה שלמה באמצעות סטריאומיקרוסקופיה מבוססת שדה בהיר. טכניקה זו מאפשרת ללכוד את דינמיקת ההתחדשות ברזולוציית תא בודד. ניתן להתאים מתודולוגיה זו לכל סטריאומיקרוסקופ המצויד במצלמת CCD ותוכנת זמן-lapse.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות, אשר לקויים במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, וזה גורם לחוסר היכולת של השריר להתחדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

מודל מכני של פגיעה מוחית בדגי זברה בוגרים מתואר כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המווסתים את יכולת ההתחדשות הגבוהה שלהם. השיטה מסבירה יצירת פציעת פצע דקירה בטקטום האופטי של מינים רבים של דגים קטנים כדי להעריך את התגובות הרגנרטיביות באמצעות אימונוסטיישן פלואורסצנטי.

מודל פציעת פצע דקירה של הטקטום האופטי הבוגר באמצעות דגי זברה ומדאקה לניתוח השוואתי של יכולת התחדשות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לגרימת פציעות ספציפיות לרקמות ולשחזור גבוה בזחלי דגי זברה באמצעות מערכת נגע בלייזר בשילוב עם פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית לטיפול בזחלים.

פציעות חצי אוטומטיות מבוקרות הנגרמות בלייזר לחקר התחדשות חוט השדרה בזחלי דגי זברה

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתלת תאים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בעוברים ובזחלים של דגי זברה בכל שלב בין יום אחד לשבעה ימים לפחות לאחר ההפריה.

השתלת תאים ברזולוציה גבוהה בדגי זברה עובריים וזחלים

למד להשתמש במערכת TetON לביטוי גני ממוקד ברקמות ב-Danio rerio. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני התחדשות בזנב דג הזברה באמצעות דוקסיציקלין ואימונופלואורסצנציה.

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

גלה סרטונים נוספים