Name: שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: למד להשתמש במערכת TetON לביטוי גני ממוקד ברקמות ב-Danio rerio. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני התחדשות בזנב דג הזברה באמצעות דוקסיציקלין ואימונופלואורסצנציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים כריסטה האזה, דוריס וובר ובריג&#39;יט Korte לקבלת סיוע טכני. עבודה במעבדה וייגינגר נתמכת על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, אנחנו 4223 / 4-1 ועל ידי Gesellschaft für דויטשה Kardiologie באמצעות אוסקר-לאפ-Stipendium וקלאוס-גיאורג אונד Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.

<ol><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1%2FStat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).</li>
<li>Tryon, R. C., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+kit+ligand+a+functional+expression+reveals+lineage-specific+competence+to+promote+melanocyte+rescue+in+the+mutant+regenerating+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin.</a> PloS one. 9 (7), e102317(2014).</li>
<li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+defines+organizing+centers+that+orchestrate+growth+and+differentiation+of+the+regenerating+zebrafish+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin.</a> Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).</li>
<li>Huang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+a+myocardium-specific+transgene+in+zebrafish+transgenic+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines.</a> Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).</li>
<li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+2A+peptides+allow+expression+of+multiple+proteins+from+a+single+ORF+in+transgenic+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos.</a> Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Bussmann, J., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+BAC+selection+for+tol2-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PloS one. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+journal+%2F+National+Research+Council%2C+Institute+of+Laboratory+Animal+Resources%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610(2007).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).</li>
<li>Grabher, C., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganuclease+and+transposon+mediated+transgenesis+in+medaka%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

יש דג הזברה המבוגר יכולת מדהימה להתחדש בהצלחה רב איברים ואיברים פנימיים. הבנה מעמיקה של המנגנונים המולקולריים ותאיים המעורבים דורשת ניתוח רקמות הספציפיות של פונקציות גן ומסלולי איתות. לקראת זה, מערכת טיטון מספקת כלי יעיל לביטוי גנים מבוקר spatiotemporally בדג זברה עוברית ובוגרת. בונה מערכת טיטון והמתודולוגיה שתוארה בכתב היד הזה כבר השתמשו בהצלחה במחקר שנערך לאחרונה במעבדה שלנו 3. הנושאים נוספים הבאים יש לשקול בעת הקמת מערכת טיטון: <p class="jove_content" style=";tex...

דג הזברה הוא אורגניזם מודל חוליות מבוסס היטב ללמוד היבטים רבים של פיתוח, פיזיולוגיה, מחלות, והתחדשות. עם האימוץ הגובר של דג הזברה כמודל לתהליכי פוסט-עובריים ביולוגיים, כלים ניסיוניים למניפולציה של ביטוי גנים או מסלולי איתות מושרה, רקמות ספציפיות הפכו חשוב יותר ויותר. במיוחד, מחקרים לאיברים והתחדשות תוספת בדג זברה מבוגרת סובלים ממחסור בכלים לניתוח של דרישות מרחב ובזמן של מסלולי איתות בתהליכי התחדשות אלה. נכון לעכשיו, שלוש מערכות שונות שימשו להשגת ביטוי מותנה, רקמות ספציפיות גנים בהתחדשות איברים של דג הזברה מבוגרת: מערכת טיטון מערכת Cre-לקס, ביטוי פסיפס של transgenes מושרה חום-הלם באמצעות transgenesis הגופנית בתיווך transposon, ו1 -3. טיטון מתייחס לגרסה של טטרציקלין-המשךמערכת התגלגלה תעתיק הפעלה, שבו הביטוי מופעל בנוכחות טטרציקלין האנטיביוטיקה או נגזרת, למשל דוקסיציקלין. מערכת Cre-לקס, כפי שעד כה השתמש בדגים בוגרים, מסתמכת על recombinase שליטת טמוקסיפן Cre (CreERT2), הביטוי שהוא מוגבל במרחב על ידי גורמי רגולציה רקמות ספציפיות. ההסרה מונעת-Cre של קלטת STOP מאפשרת ביטוי של הגן של עניין מונע על ידי אמרגן שצריכה להיות פעיל בכל סוגי התאים 1. יצירה בתיווך transposon של transgenes הגופני הביע mosaically מספקת מערכת לביטוי transgene מושרה בשושלות תאים בודדות. הזרקה של עוברי דג הזברה עם transposon Tol2 נושא גן של עניין בשליטת תעתיק של תוצאות אמרגן הלם חום באנשי chimeric בדרך כלל נושאים את הגן רק בשושלות תאים נפרדות של איבר התחדשות 2. בעוד שני המערכות מאפשרות לרקמות SPE המותנהביטוי גני cific, מערכת Cre-לקס הוא לא הפיכה, ואת האסטרטגיה באמצעות תיוג משובט מבוסס transposon סובלת מהטבע סטוכסטיים שלה. לפיכך, אנו ואחרים לאחרונה מותאמים מערכות מהונדסים טיטון לשימוש בדג זברה, המאפשרות באופן זמני וביטוי גנים במרחב שבשליטה שהוא במתכונן בנוסף ו3-5 הפיכים. מערכת טיטון משמשת כאן כוללת קו מהונדס נהג (TetActivator) שבדוקסיציקלין (DOX) activator תעתיק -inducible (שיפור transactivator ההפוך טטרציקלין, irtTA, Teta הקצר) הוא תחת שליטה של ​​רצפים רגולטוריים הגנומי רקמות ספציפיות. שנית, היא דורשת קו מגיב מהונדס (TetResponder) שמטפח גן של עניין בשליטת תעתיק של מפעיל טטרציקלין; (איור 1 א) (אלמנט תגובת ט TetRE). לפיכך, השימוש בשילובים מסוימים של קווי TetActivator וTetResponder מאפשר לרקמות ספציפיות מותנותמניפולציה פיק של ביטוי גנים. יש לנו לאחרונה ניצלתי את מערכת טיטון לחקור לפונקציות רקמות הספציפיות של איתות / בטא קטנין Wnt במבוגרי התחדשות זנב דג הזברה סנפיר 3. בפרוטוקול המתואר כאן אנו מתארים את זרימת עבודה להקמה ושימוש במערכת טיטון בדג זברה, בפרט ללימודים של התחדשות סנפיר. זה כולל הוראות מפורטות על איך ליצור קווי TetActivator וTetResponder מהונדסים יציבים ופרוטוקול לזירוז transgene בעוברים ודג זברה מבוגרת. יתר על כן, אנו מתארים טכניקות לאימות ביטוי רקמות ספציפיות גנים בלהתחדש הסנפיר, כולל פרוטוקול להכנת cryosections של סנפירי דג הזברה מבוגרים. בנוסף, אנו דנים שיקולים לעיצוב של transgene TetActivator, הבחירה של שיטת transgenesis, וזיהוי של ביטוי TetResponder. לפיכך, המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לשמש כתכניתלהגדרה-עד מערכת טיטון פונקציונלית בדג הזברה להשיג ביטוי מותנה רקמות ספציפיות גן, אשר יכול להיות מיושם על כל רקמות של עניין. יצרנו וקטור TetActivator מאפשר לאני-SCEI או דור תיווך Tol2 של קווי TetActivator יציבים באמצעות רצפים רגולטוריים הגנומי קצרים (שברים משפר; מסד נתוני פלסמיד מעבדה וייגינגר לא 1,247;. איור 1). מבנה זה מכיל קלטת TetActivator בהיקף של גרסת המוטציה M2 של תחום זה מדכא את ההפוך ט התמזגו עם תחום נגזרים 3F transactivation VP16 וירוס הרפס סימפלקס [irtTAM2 (3F)]. ביטוי של TetActivator (Teta) יכול להיות במעקב בקלות שכן הוא עם AmCyan fluorophore מאותה מסגרת קריאה פתוחה הביע שיתוף; פפטיד p2a מתווך דילוג ריבוזומלי, שאמור לגרום לייצור של תטא וAmCyan חלבונים נפרדים של 1: 5,6 יחס 1. המבנה מכיל גם poylinker 5 &#39;של Tקלטת etActivator כדי להקל על החדרה של רצפים רגולטוריים הגנומי של עניין באמצעות שיטות שיבוט קונבנציונליות. בנוסף, יצרנו מבנה המורכב של הקלטת מעל תיארה TetActivator בתוספת קלטת בחירת Kanamycin (מסד נתונים פלסמיד מעבדה וייגינגר לא 1,180;. איור 1 ג), שבו ניתן recombined לתוך כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) המכילה אזור הגנומי גדול ( בדרך כלל לקודון ההתחלה של גן הביטוי שתבנית היא לחיקוי על ידי transgene). שני המבנים זמינים מהמעבדה וייגינגר על פי דרישה.

<table><tbody><tr><td>קופסאות גידול</td><td>Aqua Schwarz</td><td>AquaBox 1</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי מורכב</td><td>למשל, Leica, Zeiss</td><td>משתנה עם היצרן</td><td>כדי לצלם קטעי רקמה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>למשל, Leica, Zeiss</td><td>משתנה עם היצרן</td><td>כדי לצלם קטעי רקמה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>למשל, Leica, Thermo-Scientific</td><td>משתנה עם יצרן</td><td>להקפאה</td></tr><tr><td>4', 6- דיאמידינו-2-פנילינודול (Dapi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>השתמש ב-1/5,000 ב-PBS להדמיה של גרעינים</td></tr><tr><td>דוקסיציקלין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9891</td><td>הכינו מלאי ב-50% EtOH ב-50 מ"ג/מ"ל (97 מ"מ) עבור אינדוקציה של TetResponder</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>4% (w/v) paraformaldehyde ב-PBS, pH 7.5 לקיבוע</td></tr><tr><td>1x תמיסת מלח פוספט-חוצץ (PBS)</td><td></td><td></td> <td>1.7 מ"מ KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5</td></tr><tr><td>1x מי מלח פוספט-בופר + טווין 20 (PBT)</td><td></td><td></td> <td>1x PBS עם 0.1% Tween 20</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus שקופיות מיקרוסקופ הידבקות</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>1014356190</td><td>לאיסוף קטעי רקמות</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו</td><td>למשל, Leica, Zeiss</td><td>משתנה עם היצרן</td><td>עבור גנוטיפ מבוסס פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>למשל, Biorad, Applied Biosystems</td><td>משתנה עם היצרן</td><td>עבור גנוטיפ מבוסס PCR</td></tr><tr><td>מדיום הקפאת רקמות (TFM)</td> <td>Triangel Biomedical Sciences</td><td>TFM-C</td><td>להטמעת רקמות דגימות</td></tr><tr><td>טריקאין (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>לשימוש בהרדמה ב-1 מ"ג/מ"ל במדיום עוברי E3</td></tr></tbody></table>

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

דג הזברה הפך לאורגניזם מודל חשוב מאוד לחקר התפתחות בעלי חוליות, פיזיולוגיה, מחלות והתחדשות רקמות. הבנה מעמיקה של המנגנונים המולקולריים והתאים המעורבים דורשת כלים ניסיוניים המאפשרים מניפולציה ספציפית לרקמה של ביטוי גנים או מסלולי איתות. לכן, אנחנו ואחרים התאמנו לאחרונה את מערכת TetON לשימוש בדגי זברה. מערכת TetON מאפשרת ביטוי גנים מבוקר זמנית ומרחבית ולאחרונה השתמשנו בכלי זה כדי לחקור פונקציות ספציפיות לרקמות של איתות Wnt/beta-catenin במהלך התחדשות סנפיר זנב דג הזברה. כאן אנו מתארים את זרימת העבודה לשימוש במערכת TetON להשגת ביטוי גנים ספציפי לרקמה בסנפיר הזנב המתחדש של דג הזברה הבוגר. זה כולל יצירת קווי TetActivator ו-TetResponder טרנסגניים יציבים, אינדוקציה טרנסגנית וטכניקות לאימות ביטוי גנים ספציפיים לרקמה בהתחדשות הסנפיר. לפיכך, פרוטוקול זה משמש כתוכנית להקמת מערכת TetON פונקציונלית בדגי הזברה והשימוש בה לאחר מכן, במיוחד לחקר התחדשות סנפירים.

להקים מערכת טיטון פונקציונלית לביטוי רקמות ספציפי גנים מושרה, TetActivator המהונדס וקווי TetResponder צריכה להיות שנוצר (איור 1 א). המטרה זו מושגת על ידי microinjecting TetActivator (איור 1 ב - C) או TetResponder (איור 1E) בונה לעוברי דג הזברה מוקדמים ואינטגרציה נבט-שורה שלאחר מכן. יכולים גם להיות שנוצרו מבני TetActivator פונקציונליים על ידי שיבוט של רצפים קצרים רגולציה (אלמנטים משפר) במעלה הזרם של קלטת TetActivat...

כאן אנו מתארים את זרימת העבודה לשימוש במערכת TetON להשגת ביטוי גנים ספציפי לרקמה בסנפיר הזנב המתחדש של דג הזברה הבוגר.

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להקים מערכת TED-on תפקודית בדגי zebrafish כדי להשיג ביטוי גנטי מותנה וספציפי לרקמה, כפי שמוצג בסרטון זה בזנב הנregenerating. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת קווי טרנסגנים של Tet activator המבטאים מפעיל שעתוק הניתן להשראה על ידי טטרהציקלין המסומן ב-am cyan ברקמה הרלוונטית, וקווי Tet responder המכילים גן עניין עם תג ype תחת בקרה של אלמנטים המגיבים ל-Tet. לאחר מכן, מוקמים שילובים ספציפיים של דגי טרנסגנים כפולים מסוג Tet activator ו-Tet responder.לאחר מכן, ביטוי של טרנסגן Tet responder ספציפי לרקמה מושרה באמצעות מתן doxycycline. לבסוף, ביטוי הטרנסגן Tet responder מאומת על ידי הכנת חתכי רקמה של סנפירים שעברו רגנרציה. בשלב הסופי, נעזרים באימונופלואורסצנציה כדי להדמיות של ביטוי הטרנסגן Tet responder הספציפי לרקמה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון ביטוי גנים המושרה על ידי הלם תרמי, הוא שמערכת זו מאפשרת ביטוי גנים הניתן להשראה ולהפיכה באופן ספציפי לרקמה. שיטה זו יכולה לסייע בהשגת הבנה מעמיקה יותר של רשתות השליחויות המולקולריות המנחות את התחדשות סנפיר הדג, שכן היא מאפשרת ניתוח של מסלולי השליחויות ותפקוד גנים ברקמות בודדות. בעוד שאנו משתמשים בטכנולוגיה זו כדי לחקור התחדשות סנפיר של דגי זברה, היא יכולה להועיל גם בהקשרים רבים אחרים הדורשים מניפול

use-teton-system-to-study-molecular-mechanisms-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים שיטה תנאי מציאה ביטוי של חלבון המטרה במהלך רגנרציה דג הזברה למבוגרים סנפיר. טכניקה זו כוללת מיקרו הזרקה ו electroporating oligonucleotide morpholinos antisense לרקמת סנפיר, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של חלבון בשלבים שונים של התחדשות סנפיר, כולל ריפוי פצעים, יצירת blastema, ואת תוצאה רגנרטיבית.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך למבוגרים התחדשות זנב סנפיר דג הזברה

לאחר חיתוך רוחב השדרה, יש דג הזברה מבוגר התאוששות תפקודית על ידי שישה שבועות לאחר פציעה. כדי לנצל את שקיפות זחל והתאוששות מהירה יותר, אנו מציגים שיטה לtransecting חוט השדרה הזחל. לאחר חיתוך רוחב, אנו צופים התאוששות חושית מתחילים ב 2 ימים שלאחר פציעה, ותנועת C-עיקול על ידי 3 ימים לאחר פציעה.

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

שיטה להתאמה הפוכה גנטית לדג זברה כדי להעריך את תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות והומאוסטזיס פיסיולוגי כגון התחדשות רקמות באמצעות זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי.

הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה

כדי לשפוך אור על המנגנונים התאיים והמולקולריים של נוירוגנזה והתחדשות בוגרים של דג הזברה, פיתחנו פרוטוקול לניתוח פולשני הגורם לפציעות מכניות בטלנצפלון הבוגר של דג הזברה וניטור לאחר מכן של שינויים בחצי הכדור הדקירה על ידי אימונוהיסטוכימיה או הכלאה באתר.

פציעה דקירת פצע של דג הזברה telencephalon מבוגרים: שיטה לחקר המוח של בעלי החוליות Neurogenesis והתחדשות

כאן אנו מציגים שיטה אמינה לחקר התחדשות כליות במבוגרים על ידי גרימת פגיעה כלייתית חריפה על ידי הזרקת גנטמיצין. אנו מראים כי הפציעה תלויה במינון הגנטמיצין ובטמפרטורת הסביבה באמצעות הכלאה באתרה כדי לתייג lhx1a+ מפתח נפרונים חדשים.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

אנו מציגים פרוטוקול ללכידת הדינמיקה של התחדשות סנפיר זנב זחל דג הזברה בקנה מידה של רקמה שלמה באמצעות סטריאומיקרוסקופיה מבוססת שדה בהיר. טכניקה זו מאפשרת ללכוד את דינמיקת ההתחדשות ברזולוציית תא בודד. ניתן להתאים מתודולוגיה זו לכל סטריאומיקרוסקופ המצויד במצלמת CCD ותוכנת זמן-lapse.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות, אשר לקויים במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, וזה גורם לחוסר היכולת של השריר להתחדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

מודל מכני של פגיעה מוחית בדגי זברה בוגרים מתואר כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המווסתים את יכולת ההתחדשות הגבוהה שלהם. השיטה מסבירה יצירת פציעת פצע דקירה בטקטום האופטי של מינים רבים של דגים קטנים כדי להעריך את התגובות הרגנרטיביות באמצעות אימונוסטיישן פלואורסצנטי.

מודל פציעת פצע דקירה של הטקטום האופטי הבוגר באמצעות דגי זברה ומדאקה לניתוח השוואתי של יכולת התחדשות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לגרימת פציעות ספציפיות לרקמות ולשחזור גבוה בזחלי דגי זברה באמצעות מערכת נגע בלייזר בשילוב עם פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית לטיפול בזחלים.

פציעות חצי אוטומטיות מבוקרות הנגרמות בלייזר לחקר התחדשות חוט השדרה בזחלי דגי זברה

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתלת תאים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בעוברים ובזחלים של דגי זברה בכל שלב בין יום אחד לשבעה ימים לפחות לאחר ההפריה.

השתלת תאים ברזולוציה גבוהה בדגי זברה עובריים וזחלים

למד להשתמש במערכת TetON לביטוי גני ממוקד ברקמות ב-Danio rerio. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני התחדשות בזנב דג הזברה באמצעות דוקסיציקלין ואימונופלואורסצנציה.

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

גלה סרטונים נוספים