שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להקים מערכת TED-on תפקודית בדגי zebrafish כדי להשיג ביטוי גנטי מותנה וספציפי לרקמה, כפי שמוצג בסרטון זה בזנב הנregenerating. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת קווי טרנסגנים של Tet activator המבטאים מפעיל שעתוק הניתן להשראה על ידי טטרהציקלין המסומן ב-am cyan ברקמה הרלוונטית, וקווי Tet responder המכילים גן עניין עם תג ype תחת בקרה של אלמנטים המגיבים ל-Tet. לאחר מכן, מוקמים שילובים ספציפיים של דגי טרנסגנים כפולים מסוג Tet activator ו-Tet responder.

לאחר מכן, ביטוי של טרנסגן Tet responder ספציפי לרקמה מושרה באמצעות מתן doxycycline. לבסוף, ביטוי הטרנסגן Tet responder מאומת על ידי הכנת חתכי רקמה של סנפירים שעברו רגנרציה. בשלב הסופי, נעזרים באימונופלואורסצנציה כדי להדמיות של ביטוי הטרנסגן Tet responder הספציפי לרקמה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון ביטוי גנים המושרה על ידי הלם תרמי, הוא שמערכת זו מאפשרת ביטוי גנים הניתן להשראה ולהפיכה באופן ספציפי לרקמה. שיטה זו יכולה לסייע בהשגת הבנה מעמיקה יותר של רשתות השליחויות המולקולריות המנחות את התחדשות סנפיר הדג, שכן היא מאפשרת ניתוח של מסלולי השליחויות ותפקוד גנים ברקמות בודדות. בעוד שאנו משתמשים בטכנולוגיה זו כדי לחקור התחדשות סנפיר של דגי זברה, היא יכולה להועיל גם בהקשרים רבים אחרים הדורשים מניפולציה של תפקוד גנים באופן ספציפי לרקמה.

לאחר יצירת קווי דגים של Tet responder בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש לבחון את האינטגרציה לקו הנבט ואת יכולת ההשראה של הגן החוצה (transgene) על ידי הזווגה של דגי G zero בודדים עם קו Tet activator שהוקם בעבר. לאחר מכן, יש לאסוף עוברים ולגדל אותם עד לשלב שבו ניתן להעריך את השראת ה-Tet responder. הכין תמיסת סטוק של 2000 x doxycycline באמצעות 50% ethanol להמסת ה-doxycycline כדי להגיע לריכוז של 50 mg/mL.

יש לאחסן מנות של docks בהגנה מאור בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכין מצע עיב embryos E3 המכיל docks בריכוז סופי של 25 µg/mL. לאחר מכן, שפוך את מרבית מצע ה-E3 מהעיברים.

החליפו את הנוזל ב-dos המכיל מצע E3 והחזירו את העוברים לטמפרטורה של 28.5 °C למשך שש שעות לפחות. לאחר הדגירה, השתמשו במיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי כדי לסרוק את העוברים לאיתור פלואורסצנציית Y pet. הקימו מספר קווי Tet responder טרנסגניים יציבים מהמייסדים שזוהו זה עתה.

בחרו שורות הגורמות לאינדוקציה חזקה ומראות פסיפס (mosaicism) מועט בתוך תחום הביטוי הצפוי, וכן שונות מועטה בין עוברים בודדים. לאחר ביסוס שורות הדגים של Tet activator ו-Tet responder, הצליבו נשאי Tet activator עם נשאי Tet responder כדי להפיק דגים טראנסגניים כפולים. בחרו עוברים הנושאים את הטראנסגן של Tet activator באמצעות סריקה של פלואורסצנציית am cyan במיקרוסקופ סטריאואסקופי, וגדלו עוברים חיוביים ל-am cyan עד לבגרות.

זהו דגים בוגרים טרנסגניים כפולים הנושאים את ה-Tet responder בנוסף ל-Tet activator באמצעות גנוטיפינג מבוסס PCR או על ידי יכולתם להשרות ביטוי של ה-Tet Responder ברקמה הרלוונטית כדי לבצע Tail Fin Tation. הרדם דגי זברה בוגרים בכלי כימי מלא במי דגים המכילים 160 micrograms per milliliter של trica. כאשר הדג מפסיק לנוע, השתמש בפינצטה כדי להעבירו בזהירות לצלחת פטרי הפוכה והשתמש בסכין מנתחים כדי לבצע קטיעה חלקית של סנפיר הזנב לטיפול ב-docs. הכן תיבות רבייה עם ליטר אחד של מי מערכת דגים המכילים 25 micrograms per milliliter של doxycycline.

כביקורת שלילית, הוסיפו 250 microliters של אתנול במקום doxycycline למכלי הרבייה המכילים ליטר אחד של מי מערכת דגים; העבירו עד 10 דגים טרנסגניים כפולים לכל מכלי רבייה והניחו את המכלים בחושך כדי להפחית את רמת הלחץ. לאחר מינימום של שש שעות, הרדימו והעבירו את הדגים שעברו טיפול לצלחת מצופה ב-aros רטוב, והשתמשו בפינצטה כדי לפרוש את הזנב. לבסוף, תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה, סננו את הדגים כדי לבחון הופעה של Y PET בתוך הרקמה המתחדשת.

לאחר מכן ניתן להשתמש בדגים לטיפולים נוספים או להחזירם למערכת גידול הדגים כדי להפסיק את השראת הטרנסגן של ה-responder בעקבות קטיעה חלקית של הסנפיר וטיפול ב-docs. קטוע שוב את נשגבי הסנפיר בנקודה הנמצאת כארבעה עד חמישה מקטעים גרמיים פרוקסימלית למישור הקטיעה הראשוני, ובנקודת זמן התלויה במערך הניסוי שלך, כפי שתואר קודם לכן בסרטון זה. בעזרת פינצטה ובמגע עם חלק הגדם של הרקמה בלבד, הנח בזהירות את נשגבי הרקמה בצורה שטוחה בתוך צלחת פטרי קטנה המכילה 4% weight per volume של PFA ב-PBS, וקבע אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את הנשגבים פעמיים לפני העברתם ל-0.5 molar E-D-T-A-P-B-S לצורך דה-קלציפיקציה של המטריקס הגרמי בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה. לאחר מכן, הדגר את הנשגבים בסדרה של סוכרוז ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בכל שלב, ולבסוף בחלקים שווים של 30% sucrose PBS ותווך הקפאת רקמה למשך 30 דקות נוספות.

העבירו את הסנפירים לתווך הקפאת רקמות והדגירו בטמפרטורה של 4 °C למשך שעתיים לפחות. לאחר מכן, הניחו תבניות הקפאה (cryo molds) על זכוכית כיסוי של מיקרוסקופ ומלאו אותן בתווך הקפאת רקמות. העבירו את הרגנרטים אל תבניות ההקפאה וכוונו את הרקמה כדי לקבל חתכיםlongitudinal או transverse.

יש לוודא שהנבט (regenerate) ישר כדי להקל על ביצוע החיתוכים. העבירו את תבניות הקריו (cryo molds) יחד עם זכוכית המיקרוסקופ למגש מתכת המונח על שכבת קרח יבש כדי להתחיל בתהליך ההקפאה. כאשר המדיום מוצק, העבירו את תבניות הקריו חזרה לטמפרטורת החדר כדי לאפשר למדיום להפשיר בממשק שבין המדיום לפלסטיק.

לאחר מכן, בעזרת מכשיר כגון עט, דחפו את הבלוק הקפוא אל מחוץ לתבנית הקריו (cryo mold) ואחסנו בטמפרטורה של 80°C- עד לביצוע חיתוך באמצעות מיקרוטום קריו (cryo microtome). אספו חתכים בעובי 10 עד 14 µm על גבי שלגשייות מיקרוסקופ עם שכבת היצמדות ואחסנו את השלגשייות בטמפרטורה של 20°C- עד למועד השימוש. כדי לאפיין את ביטוי ה-Tet responder בחתכי סנפיר, טפלו בחתכים ב-100%MEOH שקוירר לטמפרטורה של 20°C- למשך 30 דקות.

הסר בזהירות את הנוזל באמצעות נייר סופג. לאחר מכן, שטוף את החתכים פעמיים ב-PBT ופעם אחת ב-PBS למשך חמש דקות בכל פעם. דגור את החתכים למשך 10 דקות ב-dappy לפני שטיפה פעמיים ב-PBS למשך 10 דקות בכל פעם.

לאחר מכן, השתמשו בחומר קיבוע Antifade ובזכוכית כיסוי כדי לקבע את הדגימות לפני ביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקאלית או בשדה רחב (wide field) לצילום הדגימות, לאחר שהוקמה מערכת TET פונקציונלית בדגי zebrafish. ניתן להשתמש במערכת זו כדי לבחון תפקוד של גנים או מסלולי איתות ברקמות בודדות. כפי שמוצג כאן, אקטיבטור TET המונע על ידי מקדם HER 4.3 משרה ביטוי של רספונדר TED רק בתת-קבוצה של רקמות הרגנראט; פלואורסצנציית YFP מזוהה בבלאסטמה הפרוקסימלית הפרוליפרטיבית, בעוד שבבלאסטמה הדיסטלית ובאפידרמיס אין ביטוי.

ביטוי של המעכב WNT beta-Catenin המכונה axin 1 בדומיין HER 4.3 המכיל את התאים הפרוליפרטיביים של הבלסטמה, באופן מפתיע, אינו משפיע על פרוליפרציה של תאי רגנרציה. נתון זה מרמז כי סיגנל Wnt beta-catenin בבלסטמה הפרוקסימלית הפרוליפרטיבית אינו ממלא תפקיד חיוני בבקרת הפרוליפרציה של תאי הבלסטמה. לעומת זאת, שימוש בקו Tet activator המונע על ידי פרומוטור ubiquitin להשראת ביטוי של axin 1 בכל רקמות הרגנרט של הסנפיר מפריע באופן משמעותי לפרוליפרציה של תאי רגנרציה.

בנוסף, ביטוי של axon one בדומיין HER 4.3, שאינו כולל אוסטאובלסטים, מפריע באופן משמעותי ליצירת עצם ברגנראט. לפיכך, הפרעה ספציפית לרקמה של סיגנלינג wind באמצעות מערכת TE on חושפת תפקידים עקיפים בלתי צפויים של סיגנלינג wind בבקרת פרוליפרציה של תאים ורגנרציה של עצם. לאחר השליטה בשיטה זו, ניתן להשתמש בה לביטוי גנים מודע ומכוון בכל רקמה רצויה.

יישמנו בהצלחה שיטה זו כדי לבחון תפקודי רקמה ספציפיים של סיגנלינג ניקוטין במיטת הרוח בסנפיר הזנב המתחדש של דג S. שימוש בשיטה זו יסייע להשגת הבנה מקיפה יותר של הגורמים המולקולריים המסדירים את התחדשות הרקמה.