Name: יישום של ה- DNA ספציפי הכתם מתיל הירוק בתיוג פלורסנט של עוברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: למדו שימוש במתיל גרין לתיוג גרעיני פלורסנטי בעוברי דגי זברה. שיטה זו מאפשרת הדמיה עמוקה של דגימות ביולוגיות עבות במיקרוסקופיית קונפוקל לייזר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות ל-Patxi Jaso על הפקת הסרטון, PEDECIBA ו-Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII) למימון חלקי.

<html> 1. טיהור של הצבע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה מימית 4% מתיל ירוק על ידי המסת 0.4 גרם של אבקת כתם ב 10 מיליליטר מים מזוקקים. מערבבים היטב עד פירוקה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מכסה המנוע קטר-, לערבב אותו עם לפחות 2 חלקים של כלורופורם. חשוב לבדוק מראש אם הצינורות הם כלורופורם עמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב וצנטריפוגות 1 דקות XG ב 2000 כדי להאיץ הפרדת שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, שלב מימי עליון עם מתיל ירוק ושלב אורגני נמוך עם כלורופורם וסגול גביש המזהם הרגילה מתקבלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את השלב העליון וחזור על שלב זה עד שלב תחתון מופיע נטול לחלוטין של סגול גביש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף, בשלב העליון הוא התאושש ומדולל במים לריכוז סופי של 2% מתיל ירוק. פתרון מניות זה הוא יציב על שולחן העבודה במשך חודשים ולא צריך להיות מוגן מפני אור. </li></ol>&quot;Jove_title&quot;&gt; 2. פלורסנט גרעיני מכתים של כל הפריטים עוברי דג הזברה באמצעות תיל ירוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את עוברי פורמלדהיד% הלילה ב 4 (מparaformaldehyde) בופר פוספט (PBS). הערה: זה יכול לקחת בין כמה שעות ללילה בהתאם לעובי של העוברים. בדוגמא, אנו קבועים לאחר הפריה עוברי דג הזברה (hpf) 48 שעות לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העוברים שלוש פעמים PBS-T (1% Triton X-100 ב PBS) במשך 5 דקות. הריכוז הגבוה של חומר ניקוי permeabilizes לציפורן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1: פתרון 10,000 ירוק מתיל (2% ממניות פתרון) בPBS-T: 5,000-1. הנוכחות של חומר ניקוי במהלך הדגירה היא שימושית עבור דגימות עבות, כגון עוברי דג הזברה וזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר בפתרון במשך לפחות 6 שעות על 4 מעלות צלזיוס, עם נדנדה עדינה. שוב, העובי של העובר הוא פרמטר הכיול לאורכו של הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העוברים 3 times עם PBS למשך 30 דקות כדי להסיר את עודפי חומר הניקוי. הקרינה ירוקה מתיל היא רק ביטוי כאשר חייב DNA, ומכאן רקע מהמולקולה מאוגד הוא זניח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בשקופית נחפרה או קאמרי תוצרת בית עם פתרון הרכבה (גליצרול 75%, 0.1 מ &#39;טריס · HCl pH 8). הערה: אם ההכתמה הגרעינית היא שיש לבצע לאחר immunolabeling, ירוק מתיל יכול להיות משולב לפתרון ההרכבה בריכוז העבודה, ללא צורך לשטוף אותו משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות בקירור או להתחיל הדמיה באופן מיידי. לבצע הדמיה עם confocal סריקת לייזר (או הקרינה אחרת) מיקרוסקופ עם עירור ב 633 ננומטר ומסנני פליטה שנקבעו לרישום ב650-750 ננומטר בהתחשב בכך שתיל פליטה ירוקה מגיעה למקסימום שלה ב677 ננומטר. הערה: אנו מספקים נתונים שנמדדו בפרופיל הפליטה הירוק מתיל, כדי להיות טעון לתוך תוכנת הרכישה, כחומר משלים. </li></ol> 3. פלורסנט הגרעיני Staining של כל הפריטים צ&#39;יק עוברים באמצעות מתיל ירוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביצי תרנגולת מופרות לשלב של עניין. תקן את עוברי הלילה בפורמלין 4% (מparaformaldehyde) PBS ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף עוברים 3 פעמים ב PBS-T לשעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1: פתרון 10,000 ירוק מתיל (2% ממניות פתרון) בPBS-T: 5,000-1. דגירה עובר בפתרון מכתים הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את העוברים 3 פעמים ב PBS, 1 שעה כל אחד. הר בתא עם גליצרול 75%, 0.1 מ &#39;טריס, pH 8. </li></ol> 4. ההדמיה שכותרתו fluorescently גרעינים בעוברים רכוב שלמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא הדמיה על ידי דבק כמה שכבות של קלטת חשמל על שקופיות מיקרוסקופ ובזהירות לחתוך חור לתוכו עם אזמל למקם את העוברים בתוך. זה ימנע מעוברי הריסוק במהלך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את העוברים לחדר ההדמיה ולמלא את התא לראש עם גליצרול 75%, 0.1 מ &#39;טריס HCl, pH = 8 להיווצרות בועת חלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים בcoverslip # 0 הימנעות או ביטול עולה על גדותיו בינוניות. לאטום אותו עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות של הדגימה במיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסנן 633 עירור או קו לייזר. הערה: מסנני פליטה צריכים לכסות את מקסימום 677 פליטה ירוקה מתיל. </li></ol>

<ol><li>Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+imaging+in+three+dimensions%3A+a+unique+tool+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research.</a> Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).</li>
<li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI%3A+a+DNA-specific+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic%22%5BJournal%5D)">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).</li>
<li>Latt, S. A., Stetten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+studies+on+33258+Hoechst+and+related+bisbenzimidazole+dyes+useful+for+fluorescent+detection+of+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).</li>
<li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TO-PRO-3+iodide%3A+a+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li>
<li>Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemistry+on+Xenopus+embryos+using+far-red+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes.</a> Trends in genetics. 11 (1), 9(1995).</li>
<li>Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+low+cost%2C+and+highly+efficient+fluorescent+DNA+labeling+method+using+methyl+green%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green.</a> Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).</li>
<li>Kim, S. K., Nordén, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+green.+A+DNA+major-groove+binding+drug%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Methyl green. A DNA major-groove binding drug.</a> FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).</li>
<li>Nordén, B., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+methyl+green+to+deoxyribonucleic+acid+analyzed+by+linear+dichroism%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism.</a> Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).</li>
<li>Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methyl+green-pyronin+Y+procedures+using+pure+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes.</a> The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).</li>
<li>Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+comprehensive+cell+lineage+reconstructions+in+complex+organisms+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy.</a> Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).</li>
<li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+in+thick+tissue+layers+by+linear+or+nonlinear+long-wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Applied%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation.</a> Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ההתפתחות המתקדמת של טכניקות מיקרוסקופיה בעשורים האחרונים, עם דגש מיוחד על וריאציות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הובילה לאפשרות לחקור את הדינמיקה והמבנה של דגימות רקמה שלמות, כולל עוברים שלמים10,11. מגבלה עיקרית אחת הייתה, עם זאת, הזמינות של פלואורופורים באיכות טובה שניתן להשתמש בהם כדי לצבוע באופן ישיר ומהיר מבנים תת-תאיים. 
כתמי ה-DNA הפלואורסצנטיים הנפוצים ביותר, כגון DAPI או Hoechst, נרגשים באור UV ופולטים באזור הכחול של הספקטרום הנראה2,3, מה שהופך אותם לבלתי מתאימים ל...

צביעה פלואורסצנטית של DNA משמשת באופן נרחב ושגרתי הן במחקר ביולוגי והן באבחון קליני, בין אם למחקר מפורט של מבנה גרעיני וכרומוזומי, לצביעה נגדית של רקמות ותאים או לחקר פרמטרים של מחזור התא1. למרות שקיימים מספר כתמי DNA, הנפוצים ביותר היו אלה הנרגשים מאור UV ופולטים בכחול, המתאימים למערכות שלושת המסננים הרגילות המשמשות ברוב המיקרוסקופים האפיפלואורסצנטיים הקונבנציונליים בשילוב עם פלואורופורים פולטים ירוק וכתום-אדום, כגון חלבונים פלואורסצנטיים או מולקולות קטנות המחוברות לנוגדנים. מבין כתמי ה-DNA הפולטים כחול אלה, הנפוצים ביותר הם חומרי קשירת חריץ מינוריים DAPI ו-Hoechst2,3. עם זאת, השילוב של מגוון רחב של קווי פליטת לייזר וזיהוי ספקטרלי במיקרוסקופים סורקים בלייזר, אפשר לחוקרים לבחור להשתמש בכתמים גרעיניים הפולטים אדום רחוק כגון פרופידיום יודיד (PI) או TO-PRO3 4. יתרונם של כתמים אלה הוא שהם מתגברים על בעיית האוטופלואורסצנציה המצויה בתאים ורקמות רבים, במיוחד בעוברים5, אך לרבים מהם יש בעיות שונות כגון פרופילי פליטה רחבים או רגישות רבה לפוטו-הלבנה6.
החוקר השוויצרי פרידריך מישר גילה את הדנ"א בשנת 1869, והפיק אותו מגרעיני תאי דם לבנים המצויים במוגלה. הוא קרא לו נוקליאין, וכמה שנים מאוחר יותר הראה שהוא יוצר משקעים עם הכתם החדש יחסית מתיל ירוק. מתיל ירוק מורכב משלוש טבעות אנילין, בדרגות שונות של מתילציה, ויש לו שני מטענים חיוביים המאפשרים לו להיקשר חזק לחריץ העיקרי של DNA7,8. צביעת DNA על ידי מתיל גרין הוכחה בשלב מוקדם מאוד כספציפית, מה שהוביל לפיתוח על ידי Unna ו-Pappenheim של כתם משולב עם פירונין, המסמן באופן ספציפי RNA. מתיל ירוק-פירונין נמצא מאז בשימוש נרחב בטכניקה היסטולוגית שגרתית9.
עד לאחרונה, מעט מאוד היה ידוע על התכונות הפלואורסצנטיות של מתיל ירוק. עם זאת, עבודתנו הקודמת חשפה כמה מהיתרונות הספקטרליים של מתיל ירוק6 כגון העירור שלו ב-633 ננומטר, הסטה נוחה של סטוקס, פליטתו בחלק הקרוב לאינפרא אדום של הספקטרום האלקטרומגנטי, יציבות פוטו-יציבות גבוהה יותר מכתמי DNA זמינים מסחרית עם תכונות ספקטרליות דומות ובעלות נמוכה מאוד. זו הסיבה שהחלטנו לבדוק את השימוש בו כזיקה גבוהה מאוד ותווית פלואורסצנטית ספציפית לדנ"א על רקמות עובריות ובעוברים שלמים. יתר על כן, עד כה בוצע צביעה גרעינית מתיל ירוק ב-pH נמוך, מה שהקשה על השילוב עם צביעת נוגדנים. מטרת השיטה המפורטת כאן היא ליצור פרוטוקול לצביעת DNA גרעיני פלואורסצנטי המתגבר על אי הנוחות הנ"ל על ידי ביצוע הליך הצביעה ב-pH פיזיולוגי, ובכך הופך אותו לכתם נגד מתאים לתיוג חיסוני על חלקים ורקמות שלמות.

<table><tbody><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>מתיל ירוק</td><td>Dr. G. Gr&uuml; bler</td><td></td><td>נבדק גם Sigma-Aldrich 323829, שהוא פרפורמלדהיד ללא סגול קריסטל</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>סריקת לייזר מיקרוסקופיה קונפוקלית Leica TCS-SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&ndash; טטרמתילרודמין B איזותיוציאנט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td> P1951&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' 372978</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810 R</td><td>eppendorf</td><td>5811 000.010&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מחליק</td><td>Esco אופטיקה</td><td>R525025</td><td></td></tr></tbody></table>

יישום של ה- dna ספציפי הכתם מתיל הירוק בתיוג פלורסנט של עוברים

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

מתיל ירוק ידוע זה מכבר ככתם היסטולוגי בעל זיקה ספציפית ל-DNA, אם כי תכונותיו הפלואורסצנטיות נותרו לא נחקרו עד לאחרונה. במאמר זה, אנו מדגימים את השיטה להכנת תמיסת מלאי מימית מתיל ירוק, שכאשר היא מדוללת יכולה לשמש כתווית גרעינית פלואורסצנטית נוחה מאוד לתאים ורקמות קבועות. נהלים קלים לתיוג עוברי דג זברה ואפרוח שלמים מפורטים, ומוצגות דוגמאות לתמונות המתקבלות. מתיל ירוק נרגש באופן מקסימלי על ידי אור אדום, ב-633 ננומטר, ופולט בספקטרום חד יחסית שמגיע לשיא של 677 ננומטר. הוא זול מאוד, לא רעיל, יציב מאוד בתמיסה ועמיד מאוד בפני פוטו-הלבנה כאשר הוא קשור ל-DNA. הפליטה האדומה שלו מאפשרת הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של גרעינים בדגימות עבות. לבסוף, פרוטוקול צביעת מתיל ירוק זה תואם להליכי צביעת תאים אחרים, כגון תיוג נוגדנים, או תיוג חוטי אקטין עם פלואורופור מצומד.

הכתמה גרעינית של דגימות עבות. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מאפשר להשגת צביעה הומוגנית של מבנים עמוקים בכל עוברים. טופס גרעיני 48 hpf עוברי דג הזברה עדשת פיתוח הומוגנית מסומנים (איור 1). צביעת DNA ירוקה מתיל מאפשרת אפליה של הבדלים מורפולוגיים תלויים מחזור התא כגון זיהוי של דמויות mitotic או גרעינים אפופטוטיים (איור 2 א). מבני Subnuclear ברזולוציה גבוהה ניכרים גם כפי שמוצגים לגרעיני א...

מתוארת שיטה לצביעה פלואורסצנטית של חומר ביולוגי קבוע עם תווית ה-DNA הספציפית מתיל ירוק. מתיל ירוק משמש בתמיסה מימית מדוללת ועמיד מאוד בפני פוטוהלבנה. הפליטה האדומה הרחוקה שלו מאפשרת הדמיה עמוקה של דגימות, מה שהופך אותו למתאים במיוחד לעוברים שלמים.

יישום של ה- DNA ספציפי הכתם מתיל הירוק בתיוג פלורסנט של עוברים

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

בסרטון זה, נדגים כיצד ניתן להשתמש בצבע ההיסטולוגי הנפוץ מאוד מתיל גרין (methyl green) כסמן גרעיני נוח ביותר במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, עם יישומים מיוחדים במיקרוסקופיה קונפוקלית בלייזר של דגימות ביולוגיות עבות, כגון עוברים שלמים. לאחר הצגה קצרה של מתיל גרין כצבע ספציפי ל-DNA, נתאר את השיטה להכנת תמיסות מלאי ותמיסות עבודה לצביעה פלואורסצנטית. לאחר מכן, נציג את ההליך הניסויי להשגת צביעה גרעינית ונציג מספר עוברים של דגים ודוגמאות לתמונות קונפוקליות שהתקבלו.לבסוף, יוצגו וינושלו תכונותיו הפיזיקו-כימיות המצוינות של methyl green. פרדי מישה גילה את ה-DNA בשנת 1869 והראה מספר שנים מאוחר יותר כי הוא יוצר משקעים עם צבע אנליטי חדש יחסית, methyl green. ל-methyl green יש שני מטענים חיוביים המאפשרים לו אינטראקציה חזקה עם ה-DNA בחריץ המאור (major groove), תוך קישור מועדף לאזורים עשירים ב-G.השימוש הנרחב ביותר במתיל גרין (methyl green) היה שילובו בתמיסה אפיתית עם צבע ה-RNA פירנין (pyronine), שיטה שפותחה על ידי UNA ו-Poppen Heim בתחילת המאה ה-20. עם זאת, בוצע מעט מאוד ניתוח של התכונות הפלואורסצנטיות של מתיל גרין, וזו הסיבה שהחלטנו לבחון את האפשרות להשתמש בו כסמן פלואורסצנטי בעל זיקה גבוהה וספציפיות עבור DNA בתאים.מתיל גרין (Methyl green) הוא צבע מתאן בעל שבע קבוצות מתיל. קבוצה שביעית זו עלולה ללכת לאיבוד בקלות, והצבע חוזר להיות קריסטל ויולט (crystal violet). מסיבה זו, תהיה כמות מסוימת של קריסטל ויולט מעורבבת עם המתיל גרין כדי למנוע היווצרות גבישים.ניתן לשטוף תמיסת methyl green סגולה בעזרת כלורופורם כדי למצות את ה-crystal violet. כפי שנראה מיד, למטרה זו נכין תמיסת 4%ACU תחת מנדף כימיים. נערבב אותה עם לפחות שני חלקים של כלורופורם ונבצע צנטריפוגה כדי להאיץ את הפרדת הפאזות.לאחר הצנטריפוגציה, מתקבל פאזה מימית עם methyl green ופאזה אורגנית תחתונה עם chloroform ו-crystal violet. אספנו את הפאזה העליונה וחזרנו על הפעולה עד שהפאזה התחתונה נראתה שקופה. לבסוף, הפאזה העליונה נאספת ומדוללת.תמיסה זו יציבה על משטח העבודה למשך חודשים. כעת נראה כיצד להמשיך בכיסוי של כל ה-MO בשכבת העובריים עם meth green. לצורך מיקרוסקופיה קונפוקלית, נשתמש בעוברי דגים עם שקיפות גבוהה.כדוגמה, השג עוברים של דגי זברה ושטוף את השאריות בעזרת מסננת. הדגר אותם עד לשלב הרצוי במי אקווריום או בתווך עוברים. הסר את ה-corium באמצעות פינצטה עדינה, וקבע את העוברים ב-4% formaldehyde למשך מספר שעות או למשך הלילה.לאחר מכן, שטפו את העוברים ב-PBST מספר פעמים. הכינו תמיסת עבודה של methyl green על ידי דילול של תמיסת המלאי פי 5 עד 10,000 ב-PBST. דגרו את העוברים בתמיסה למשך שלוש שעות לפחות בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4°C.בדוגמה זו, תתקבלו תמונות קונפוקאליות במיקרוסקופ קונפוקאלי המצויד בגלאים ספקטרליים. עירור מקסימלי מושג באמצעות לייזר של 633 nanometer והגלאי מכוון לטווח רחב באזור האדום של הספקטרום הנראה.הפליטה של Methyl green red מאפשרת לקבל דימוי גרעיני באיכות גבוהה גם מדגימות עמוקות, כגון עוברים שלמים, עם אובדן אות מינימלי. סדרה ראשונה זו מראה רשתית של דג זברה שגרעיניה נצבעו בצבע DNA מוכר למטרות הצגת ה-three. לאחר דקה אחת אנו מבצעים זום-אאוט.אזור סריקת ABL הופך לנראה כאשר אנו מבצעים את אותו ניסוי עם methyl green, ולא נצפה הבהרה ניכרת. בסדרה הבאה, אנו מציגים תוצאות מייצגות למה שניתן להשיג באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן: תא במצב מיטוזה מאפידרמיס של דג זברה שבו ניתן להבחין בדמויות מיטוטיות, וגרעין IIC מאותו דגימה שבו ניתן לראות את המבנה הגרעיני.שחזור תלת-ממדי של חלק מתא אפידרמי של זחלי zebrafish המסומן ב-methyl green amalin; מבט פנורמי יותר של צורות גרעיניות שונות בתוך רשתית של דג zebrafish בגיל 48 שעות לאחר ההפריה. הצגנו כאן דרך פשוטה להכנת צבע DNA פלואורסצנטי זול במיוחד שניתן להשתמש בו לסמון גרעינים. למרות שהצגנו זאת רק כדוגמה, קיימות אפשרויות רבות נוספות. ניתן להחיל טכניקה זו על עוברים או רקמות, הן בשיטת whole mount והן בחתכים.ניתן להשתמש בו גם לצביעת DNA בג'לים ולמדדי DNA בתמיסה באמצעות פוטומטריה.

application-dna-specific-stain-methyl-green-fluorescent-labeling

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

אנו מציגים טכניקה לסימון תאי עצב בודדים במערכת העצבים המרכזית (CNS)...

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

אנו מתארים סדרה של שיטות להזריק צבעים, וקטורי DNA, וירוסים, ותאים במטרה לעקוב אחר שני גורל התא והפנוטיפ של תאי אנדוגני והמורכבים שמקורם בתאים עובריים או pluripotent בעוברי עכברים ביום עוברי (E) 9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח.

תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי

עובר Xenopus laevis ממשיך להיות שימושי במיוחד בחקר ההתפתחות המוקדמת בשל גודלו הגדול וקלות המניפולציה שלו.   מסופק פרוטוקול פשוט לפרוטוקול הכלאה של הרכבה שלמה באתרו שניתן להשתמש בו בזיהוי איברים ספציפיים במערכת מודל זו.

הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול ב<em&gt; Xenopus</em

מבוא של מולקולות קטנות לעובר דרוזופילה הפיתוח מציע פוטנציאל גדול לאפיון פעילות ביולוגית של תרכובות רומן, סמים ורעלים כמו גם לחיטוט מסלולים התפתחותיים בסיסיים. שיטות שתוארו במסמך זה מתארים את שלבים שלהתגבר על מחסומים טבעיים לגישה זו, המרחיב את התועלת של מודל עובר דרוזופילה.

שיטה של ​​permeabilization של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים למבחנים של מולקולה קטנה פעילות

אנו מדווחים כאן הביטוי חזק ויעיל של חלבוני ניאון לאחר הזרקת mRNA לביציות מופרה של lanceolatum מיתרני הראש. הפיתוח של טכניקת microinjection בchordate בסיס זה יסלול את הדרך למרחיקה לכת חידושים טכניים במערכת מודל מתפתח זה, לרבות בתחום ההדמיה vivo ומניפולציות גנטיות ספציפית.

ביטוי של חלבונים ניאון ב Lanceolatum מיתרני הראש על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

הדמית morphogenesis של עוברי חרק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון הפכה מדינה של האמנות. פרוטוקול זה מתאר ומשווה שלוש טכניקות הרכבה מתאימות עובר Tribolium castaneum, מציג שני קווים מהונדסים רומן מחוייט גם מתאים הדמיה חיה, דן בקרות איכות חיוניות ומציין מגבלות ניסוי נוכחיות.

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; עובר

הפרוטוקול מתאר את התיוג הספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים עם כתם של דנ א הזמין מסחרית, רכישת סדרה של לשגות בזמן של תאים בעלי תווית חיה על-ידי מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה גבוהה (SR-SIM), ומעקב אוטומטי של תנועה נוקלאואידית.

תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים לזמן-מיקרוסקופ תאורה מובנה לפקיעה

בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים הם תנועתיים. באופן עקרוני, ניתן לדמות אותם בשידור חי באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, אך קליפת הביצית מונעת יישום ישיר על העובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להציג בדיקות כאלה באמצעות מיקרו-איניג'קציה, ולאחר מכן לנתח תנועת אברונים בתפזורת באמצעות ולוסימטריה של תמונת חלקיקים.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

אנו מתארים שיטות להמחשת שעתוק ראשוני במהלך הפעלת הגנום הזיגוטי בתאים בודדים במהלך העובר המוקדם.

המחשת הפעלת הגנום הזיגוטי בתאים בודדים של עוברים מוקדמים

למדו שימוש במתיל גרין לתיוג גרעיני פלורסנטי בעוברי דגי זברה. שיטה זו מאפשרת הדמיה עמוקה של דגימות ביולוגיות עבות במיקרוסקופיית קונפוקל לייזר.

יישום של ה- DNA ספציפי הכתם מתיל הירוק בתיוג פלורסנט של עוברים

גלה סרטונים נוספים