טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לסנתז ולאפיין ננו-חלקיקים של חיסון מבוססי ליפידים, ולהעריך את יכולתם לעורר התרחבות של לימפוציטים T ציטוטוקסיים ספציפיים לאנטיגן in vivo. דבר זה מושג על ידי הנדסה של וסיקולות רב-שכבתיות מקושרות בין-שכבתיות המחקות פתוגנים, או I CMVs, הטוענות במקביל אנטיגן ואדג'ובנט עבור חיסון של עכברים נאיביים. אלו יעברו העברה אדופטיבית של תאי T חיוביים ל-CD8 ספציפיים לאנטיגן המבטאים לוציפראז.

בשלב השני, ההתרחבות של תאי T חיוביים ל-CD eight ספציפיים לאנטיגן מוערכת באמצעות דימות in vivo של בעל החיים כולו. תאים חד גרעיים מדם פריפריאלי (PBMCs) שנקצרו מהבעלי החיים שחוסנו ב-ICMV נצבעים לאחר מכן באמצעות טטראמרים המסומנים פלואורסצנטית ונבדקים בציטומטריה של זרימה כדי לכמת את השכיחות של תאי T חיוביים ל-CD eight אנדוגניים שספציפיים לאנטיגן בתוך המדורה המערכתית. לבסוף, ניתן להשתמש בדימות ביו-לומינסנטי כדי לעקוב אחר ההתרחבות של לימפוציטים T ציטוטוקסיים ספציפיים לאנטיגן בתגובה לחיסון בננו-חלקיקים.

שיטות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מקדימות מרכזיות בתכנון חיסונים, כגון מהו היקף התרחבותם של לימפוציטים T ציטוטוקסיים וכיצד תאים אלו נדלקים לרקמות שונות בתגובה לחיסון באמצעות ננו-חלקיקים? היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניתוח תאי T in-situ לאחר נתיחה של הרקמה, הוא שדימות in vivo של תגובת תאי TT אינו פולשני, ובכך הוא מאפשר ניטור לאורך זמן של אותה חיה. התחילו בערבוב של יחס מולרי של אחד לאחד של DOPC ו-MPB בתוך כלורופורם, תוך שמירה על כמות ליפידים כוללת של 1.26 µm לכל סדרה בתוך מבחנה מזכוכית בנפח 20 mL.

בשלב הבא, הוסיפו מטען ליפופילי לתמיסת הליפידים בריכוז הרצוי ונקו את התמיסה באמצעות גז חנקן יבש במיוחד כדי להסיר לחלוטין את הממס האורגני. הניחו את הדגימה תחת ואקום למשך לילה. למחרת בבוקר, הוסיפו 200 µL של BTP בריכוז 10 mM המכיל את המטען המסיס במים הרלוונטי כדי להידרט את שכבת הליפידים; ערבבו את התמיסה שהתקבלה במערבל (vortex) למשך 10 שניות כל 10 דקות, למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו את התוכן לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL.

לאחר מכן, הניחו את המבחנה באמבט קרח תחת סוניקציה רציפה בהגדרת עוצמה של 40% באמצעות ראש סוניקטור של 125 watt ו-20 kilohertz. לאחר חמש דקות, הוסיפו למבחנה ארבעה µL של DTT בריכוז 150 millimolar, ערבבו באמצעות וורטקס וסובבו את הדגימה במיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, ערבבו 40 µL של calcium chloride בריכוז 200 millimolar לתוך הדגימה, ולאחר מכן בצעו קישור צולב (cross-linking) של שכבות הליפידים המכילות MPB עם DTT בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.

בסיום הדגירה, סובבו את התמיסה שלוש פעמים ב-200 µL של מים מזוקקים פעמיים במהלך הסבוב השני והשלישי, כדי להסיר מהנוזל העליון (supernatant) את שאריות calcium chloride, DTT שלא הגיב וחומרי מטען שאינם עטופים. לאחר הסבוב האחרון, נשעה את ה-I CMVs ב-100 µL של pegol שהוכן טרי למשך 30 דקות ב-37 °C. לאחר מכן, שטפו את הוזיקולות פעמיים נוספות במים מזוקקים פעמיים.

יש להחזיר את המשקע הסופי לתמיסת PBS ולאחסן את ה-ICMV בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כדי לאפיין את החלקיקים, ערבבו את תמיסת ה-ICMV הקרה לפני דילול של מנת דגימה קטנה לנפח כולל של מיליליטר אחד של מים מזוקקים פעמיים. לאחר מכן, הניחו את ה-ICMVs בתא Zeta Sizer והשתמשו במערכת למדידת פיזור אור דינמי ופוטנציאל זטא כדי למדוד את גודל החלקיקים, מדד הפולידיספרסיות (poly dispersity index) ואת פוטנציאל הזטא של הדגימות בהתאם להוראות היצרן.

כדי לבודד תאי T חיוביים ל-CD8 המבטאים לוציפראז וספציפיים ל-ova, ראשית קצרו את הטחולים מעכברי OT one טרנסגניים ללוציפראז. הניחו את הרקמות ב-5 mL של PBS קר בקרח ו-2% FBS, ולאחר מכן העבירו אותן למנדף תרביות רקמה.

השתמשו בבוכנה של מזרק של 3 milliliters כדי לרסק עד שלושה טחולים בבת אחת דרך מסננת של 70 micron לתוך מבחנה קונית של 15 milliliters. שטפו את הבוכנה ואת המסננת באמצעות PBS ו-2%FBS. לאחר מכן, הגדילו את הנפח הכולל של תרחיף התאים ל-10 milliliters לכל טחול.

קבעו את מספר התאים הכולל ולאחר מכן סובבו את התאים במסבב (spin down). לאחר מכן, השתמשו בערכה מסחרית לברירה מגנטית שלילית כדי לבודד את תאי הטימוס החיוביים ל-CD8 בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, שטפו את תאי ה-T ב-PBS.

ספרו אותם והדגירו בין 2 ל-3 כפול 10 בחזקת 5 תאים ב-20 microliters של נוגדן חוסם mouse CD 1632. לאחר 10 דקות, הוסיפו לתאים 20 microliters של נוגדן anti CD eight APC למשך 30 דקות והעריכו את טהרתה של אוכלוסיית תאי ה-T החיוביים ל-CD eight שבודדו באמצעות חרוזי מגנט על ידי ציטומטריה של זרימה. לאחר מכן, העבירו באופן אדופטיבי בין 1 ל-10 כפול 10 בחזקת 5 תאי OT1 luciferase CD eight positive T לתוך עכברים נאיביים גלחים אלבינו C 57 black six, ב-200 microliters של PBS באמצעות הזרקה תוך-ורידית לווריד הזנב. 24 שעות לאחר מכן, ניתן את החיסון במספר הימים המתאים לאחר החיסון.

הזריק לבעלי החיים 150 milligrams per kilogram של Lucifer לאחר 10 דקות, וקלוט את אות הביולומינסנס למשך חמש עד 10 דקות באמצעות מערכת דימוי של בעל חיים שלם כדי להדמיות תאי T חיוביים ל-CD8 של OT one Lucifer, במטרה לקבוע את מספר תאי ה-T חיוביים ל-CD8 ספציפיים לאנטיגן במועד המתאים. לאחר החיסון, אסוף כ-100 microliters של דם מהעכברים המחוסנים באמצעות טכניקת דימום תת-מנדibulרית לתוך מבחנה מצופה ב-potassium EDTA, והפוך את המבחנה מספר פעמים כדי למנוע קרישה. לאחר מכן, העבר 100 microliters של דם למבחנה למיקרו-צנטריפוגה והוסף מיליליטר אחד של CK lysis buffer.

לאחר שתיים עד שלוש דקות, סבב את התאים בצנטריפוגה והסר את הנוזל העליון (supernatant). שטוף את ה-pbmc שנותרו ב-1 mL של באפר fax וחסום את הקישור הלא-ספציפי עם CD 1632 כפי שהודגם acab. לאחר 10 דקות, חלק את תרחיף התאים למבחנות fax בעלות תחתית עגולה בנפח של 4 mL והוסף לכל דגימה 20 µL של תמיסת H two KB over tetramer syn fecal PE בהתאם למפרט היצרן.

לאחר 30 דקות על קרח, הוסף 20 µL של תערובת הנוגדנים המתאימה לכל דגימה ניסיונית, ואת הנוגדנים הבקרים הבודדים של fluoro four לכל tetramer של תג fluoro four או לנוגדן המתאים בכל דגימת בקרה. לבסוף, לאחר דגירה נוספת של 20 דקות, שטוף את כל הדגימות ב-fax buffer, השהה מחדש את המשקעים ב-fax buffer המועשר ב-DPI, ובצע ניתוח של הדגימות באמצעות ציטומטריה של זרימה. CMVs הטעונים יחד עם אנטיגנים של חלבוני fluoro four וצבעים ליפופיליים פלואורסצנטיים מאפשרים ויזואליזציה של העברת האנטיגן והננו-חלקיקים in vivo. לדוגמה, דימות במיקרוסקופיה קונפוקלית מעיד כי אנטיגן מסיס שהועבר תת-עורית בבסיס הזנב, מגיע לקשרי הלימפה המנקזים בתוך ארבע שעות מהמתן ומפונה תוך 24 שעות.

לעומת זאת, I CMVs בעמוס יתר מזוהים תחילה בפריפריה של קשרי הלימפה המנקזים תוך 24 שעות מהמתן, עם הצטברות מתמשכת המובילה למשקע גדול של ova I CMVs בתוך רקמת הלימפה המנקזת. ביום הרביעי, למעשה, הדמיית ביו-לומינסנציה של עכברי C 57 BL six שקיבלו העברה אדופטיבית של OT one Luciferase CD eight positive T cells ביום החיסון, מראה רמה מינימלית של רקע של OT one luciferase tcell ביום הרביעי לאחר החיסון. עם זאת, עכברים שחוסנו עם ova MPI CMVs מראים אות ביו-לומינסנציה חזק בתוך קשרי הלימפה המפשעיים המנקזים.

עכוברים שחוסנו ב-ova מסיס, לעומת זאת, מראים התרחבות מופחתת משמעותית של תאי T חיוביים ל-CD8 מסוג OT-I בתוך קשרי הלימפה המנקזים. עכברים נוספים שחוסנו ב-ova מסיס וב-MPLA ללא העברה אדופטיבית של תאי T ספציפיים לאנטיגן אינם מראים התרחבות ניכרת של תאי T חיוביים ל-CD8 הספציפיים ל-ova, כפי שעולה מניטור שבועי של ה-pbmc. עם זאת, חיסון ב-ICMV מעורר תגובה חזקה יותר ואנדוגנית של תאי T חיוביים ל-CD8, המגיעה לשיא של 28% של תאי T חיוביים ל-syNFecta tetramer בתוך תא הלמפת CD8-positive בקרב ה-pbmc עד היום ה-41. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מסנתזים ננו-חלקיקים מבוססי ליפידים, מבצעים חיסונים, ומדמינים ומכמתים את התרחבות ה-CTL in vivo.

ניתן לשנות שיטות אלו עוד יותר כדי לחשוף מידע נוסף על תגובת ה-CTL. לדוגמה, ניתן להשלים את בדיקת הצביעה של תאי T באמצעות סמנים נוספים כגון CD 1 27, BCL two ו-K lrg one כדי להעריך את פנוטיפ הזיכרון של התאים.