Name: אדם תפקודי כבד שימור ושחזור על ידי אמצעי Subnormothermic מכונת זלוף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: למדו שיטת שימור כבד אנושי באמצעות מכונת זלוף בטמפרטורה תת-נורמותרמית של 21 מעלות צלזיוס. שיטה זו מאפשרת הערכת תפקוד ושחזור מטבולי של האיבר לפני השתלה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון מהמכון הלאומי האמריקאי לבריאות (מעניק R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 וDK103500 F32), CIMIT פרויקט מס &#39;12-1732 ובתי החולים Shriners לילדים הוא הודה בהכרת תודה. ברצוננו להודות בהכרת תודה בנק האיברים ניו אינגלנד לתמיכה בעבודה זו.

השימוש ברקמה אנושית חייב להיבדק על ידי מועצה לביקורת מוסדית (IRB) או שווה ערך. העבודה המתוארת כאן אושרה והכריזה פטור על ידי בית החולים הכללי מסצ&#39;וסטס Institutional Review Board (מס &#39;2011P001496). 1. פתרון הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סביבה נקיה מחיידקים להוסיף תוספים לפנול E בינונית &#39;וויליאמס אדומה ללא כפי שמתוארת בטבלה 1. הפתרון צריך להיות מוכנים טרי לפני השימוש. אינסולין יש להוסיף רק לפני השימוש. </li></ol> 2. חזרה הכנת טבלה של הכבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים קערת איבר מלאת קרח על פני השטח סטרילי, עטוף. הסר את הכבד מהתיבה, והשאיר אותו בשקית של פתרון שימור קר. שמור את הכבד בעיקר מתחת למים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את העורק הכבד (HA), אשר יהיה ממוקם דיסטלי לתיקון אב העורקים. לנתח בחינם העורק לחשוף סניפי חתך שונים לאורכו באמצעות מספריים מצנבאום. disse בזהירותct כל אורכו של העורק כדי למנוע ניתוק כלי שמספק את הכבד. אין לחתוך או לקשור ענפים שאין להם סוף גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור את כל סניפי העורקים לא מספקים את הכבד באמצעות תפר משי החל גודל 0 עד 4-0, תלוי בגודל של כלי השיט. סניפים קרובים, כי הם קצרים מדי כדי לקשור או חורים בעורק עם תפר של 7-0 prolene. עניבה וחתכה את עורקי הקיבה הטחול ושמאל קרובים למקור שלהם בתא מטען צליאק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תיקון אב העורקים על ידי חיתוך גזע צליאק ישירות תחת התיקון. Cannulate תא מטען צליאק באמצעות צינורית אב העורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את וריד השער (PV) ובוטות לנתח את זה בחינם. לקשור את כל סניפים וcannulate PV עם המגזר מוכן בגודל 24 צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר חלקים של סרעפת מהווריד הנבוב suprahepatic, בלי לחתוך את הווריד עצמו. יצוא ממתנקז הווריד הנבוב ישירות לתוך תא האיבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך 2 ti מלא היקףדגימות ssue (אורך מ&quot;מ 2-3) מקצה של צינור המרה המשותפת; הצמד להקפיא אחד בחנקן נוזלי (חנות ב -80 ° C) ולאחסן האחרים ב 10% שנאגרו פורמלין, לרקמות וניתוח היסטולוגית, בהתאמה. Cannulate צינור מרה המשותף עם צינורית הכלי וצינור ניקוז עשוי מצינורות oxygenator הקרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות ולקשור את צינור פיברוזיס עם עניבת משי 0. צינור פיברוזיס נמצא בין צינור המרה המשותפת וכיס המרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את צינורות הסומק מוגדרים שקיות קרות כקרח של תמיסת הרטמן (LR) וראש צינורות, הסרת כל האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את זרימת הווסת על צינור הסומק לטפטוף איטי. לפני חיבור צינור הסומק לצינורית וריד שער, לחסום את וריד השער עם אצבעות בhilum ולמלא את הצינורית ווריד עם סומק כדי להסיר את האוויר מוריד השער. לא להעלות את השקית יותר מ -20 סנטימטרים מעל הגובה של הכבד במהלך שטיפה קרה, כדי למנוע לחץ מופרז עלוריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך בקצרה הסומק לחסום את PV בנקודה הנמוכה ביותר. לבחון את PV להדלפות. ניתן לסגור את סניפי כלי כפי שתוארו לעיל. לשטוף את הכבד באמצעות PV עם סך של 2 L של LR קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.10, 2.11 לHA עם 1 ליטר של LR. </li></ol> 3. לקרקע מערכת SNMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש מכשיר זלוף על ידי הוספת 2 L של perfusate (21 ° C) לקערת האיבר ומתחיל את המכשיר לראש צינורות. בצע את ההוראות של המכשיר כדי להתכונן לזלוף, קביעת הטמפרטורה ל -21 מעלות צלזיוס. התחל עם לחצים של 3 מ&quot;מ כספית ו -30 מ&quot;מ כספית בPV וHA, בהתאמה. פתח את מיכל הדלק ולהגדיר לזרימה של 3 L / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקחת דגימת דם משני גז זרימת HA וPV על ידי ציור מדגם 0.3 מיליליטר מנמלי המדגם ומפעיל אותו במכונה ניתוח גז דם על פי הוראות היצרן. לאשר חמצון נאות (PO 2&gt; 700 מ&quot;מ כספית) ו- pH (7.35-7.45). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הכבד המחובר לקחת דגימת 1.0 מיליליטר של perfusate כב= 0 מדידה בצינור Eppendorf ולאחסן ב -80 ° C. חותך שתי ± 250 ביופסיות טריז מ&quot;ג מהכבד עם להב פלדה בעל להב אחד; הצמד להקפיא אחד בחנקן נוזלי (חנות ב -80 ° C) ולאחסן האחרים ב 10% שנאגרו פורמלין. לשקול את הכבד לפני זלוף. </li></ol> 4. אדם הכבד זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הכבד למכשיר. חבר את זרימת PV לצינורית PV, לאחר הסרת אוויר מPV כמו בשלב 2.10. חבר את HA באופן דומה. PV להגדיר ולחץ HA עד 3 ו -30 מ&quot;מ כספית. הכבד צריך להיות כמעט שקוע בperfusate. לכסות את כל משטחים יבשים, כולל כלי יבוא, עם גזה סטרילית רטובה על מנת למנוע התייבשות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו לטמיון צינורות מרה לתוך מיכל איסוף. ודא פתיחת ניקוז המרה היא ברמה של הכבד או נמוך כדי לאפשר מרה לרוץ out באופן חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת יעד שיעורים הם 275-325 מיליליטר / min.kg ו50-100 מיליליטר / min.kg לPV וHA בהתאמה פעם הכבד התחמם עד 21 ° C. מאז כל כבד מגיב בצורה שונה לזלוף, לפקח על הזרימה צמודה במהלך דקות הראשונות. להגדיל או להקטין את הלחץ על אחד מהכולים אם ספיקות היעד לא הגיעו. לא יעלה על 50 מ&quot;מ כספית בHA ו -5 מ&quot;מ כספית על PV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לקחת דגימות מרקמת כבד, perfusate והמרה בהעדפת החוקרים. אנו ממליצים על מינימום מדגם משטר האוסף הבא במהלך זלוף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביופסיות רקמות, n = 2 x 250 מ&quot;ג, בכל שעה. אחסון: הצמד להקפיא אחד בחנקן נוזל חנות ב -80 לטווח ארוך C °. בנוסף, לקחת ביופסיה נוספת לפני ואחרי זלוף ולתקן ב 10% שנאגרו פורמלין (n = 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות perfusate, n = 2x 1 מיליליטר, כל 15 דקות לשעה הראשונה וכל 30 דקות לאחר מכן. לצייר דגימות מinf PVנמל מדגם נמוך. אחסון: -80 ° C לטווח ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח גז דם של PV וזרימת HA, ויצוא וריד נבוב. n = 3 x 0.3 מיליליטר, בכל 30 דקות. לצייר דגימות משני PV ויציאות מדגם HA. צייר מדגם 0.3 מיליליטר מהווריד הנבוב על ידי החדרת מזרק לתוך הווריד ולהפעיל ישירות במנתח גז דם. השתמש בתפוקה כדי להבטיח חמצון וpH מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצור מיצי מרה, n = 1 מיליליטר x 1, כל שעה. מבחינה ויזואלית לכמת ייצור מיצי מרה בכל שעה ולקחת דגימה מיכל האיסוף. לחדש את המכל לאחר דגימה. אחסון: קרח יבש ו-80 ° C לטווח ארוך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך זלוף במשך 3 שעות. ניטור הלחץ, pH וחמצון ולקיחת דגימות לאורך כל דרך. התאם אותו pH על ידי הוספת סודה לשתייה לperfusate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של זלוף לקחת דגימות הסופיות בעוד הכבד הוא להיות perfused. נתק את הכבד ולהסיר את צינורית צינור מרה. קח 2 דגימות רקמה שלאחר טפטוף שלצינור מרה כפי שתואר קודם לאחסון ב -80 ° C וב 10% שנאגרו פורמלין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הכבד האנושי הבא הנחיות רשות Biohazard הנכון. </li></ol>

<ol><li>Merion, R. M., Pelletier, S. J., Goodrich, N., Englesbe, M. J., Delmonico, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donation+after+cardiac+death+as+a+strategy+to+increase+deceased+donor+liver+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Donation after cardiac death as a strategy to increase deceased donor liver availability.</a> Ann Surg. 244 (4), 555-562 (2006).</li>
<li>Guarrera, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+machine+preservation+facilitates+successful+transplantation+of+%27orphan%27+extended+criteria+donor+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Hypothermic machine preservation facilitates successful transplantation of 'orphan' extended criteria donor livers.</a> Am J Transplant. 15, 161-169 (2015).</li>
<li>Dutkowski, P., Schlegel, A., de Oliveira, M., Müllhaupt, B., Clavien, P. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HOPE+for+human+liver+grafts+obtained+from+donors+after+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">HOPE for human liver grafts obtained from donors after cardiac death.</a> J Hepatol. 60 (4), 765-772 (2013).</li>
<li>Dutkowski, P., Clavien, P. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solutions+to+Shortage+of+Liver+Grafts+for+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Solutions to Shortage of Liver Grafts for Transplantation.</a> Br J Surg. 101 (7), 739-774 (2014).</li>
<li>Vogel, T., Brockmann, J. G., Friend, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex-vivo+Normothermic+Liver+Perfusion%3A+An+Update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Ex-vivo Normothermic Liver Perfusion: An Update.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 167-172 (2010).</li>
<li>Monbaliu, D., Brassil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+Perfusion+of+the+Liver%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Machine Perfusion of the Liver: Past, Present, and Future.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 160-166 (2010).</li>
<li>Matsuno, M., Uchida, K., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Machine+Perfusion+Preservation+of+Liver+Grafts+From+Donation+After+Cardiac+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Impact of Machine Perfusion Preservation of Liver Grafts From Donation After Cardiac Death.</a> Transplant Proc. 46 (4), 1099-1103 (2014).</li>
<li>Schlegel, A., Dutkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hypothermic+machine+perfusion+in+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Int%22%5BJournal%5D)">Role of hypothermic machine perfusion in liver transplantation.</a> Transplant Int. , (2014).</li>
<li>Op den Dries, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+normothermic+machine+perfusion+and+viability+testing+of+discarded+human+donor+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers.</a> Am J Transplant. 13, 1327-1335 (2013).</li>
<li>Bruinsma, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+prophylaxis+in+%28sub%29normothermic+organ+preservation%3A+In+vitro+efficacy+and+toxicity+of+cephalosporins%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Antibiotic prophylaxis in (sub)normothermic organ preservation: In vitro efficacy and toxicity of cephalosporins.</a> Transplantation. 95 (8), 1064-1069 (2013).</li>
<li>Post, I. C., Dirkes, M. C., Heger, M., Bezemer, R., van't Leven, J., van Gulik, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+flow+and+pressure+management+in+machine+perfusion+systems+for+organ+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Optimal flow and pressure management in machine perfusion systems for organ preservation.</a> Ann Biomed Eng. 40 (12), 2698-2707 (2012).</li>
<li>Post, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+preservation+at+hypothermic+to+normothermic+conditions+using+clinical+and+experimental+organ+preservation+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell preservation at hypothermic to normothermic conditions using clinical and experimental organ preservation solutions.</a> Exp Cell Res. 319 (17), 2501-2513 (2013).</li>
<li>Klein, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+Donation+and+Utilization+in+the+United+States%2C+1999-2008%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Organ Donation and Utilization in the United States, 1999-2008.</a> Am J Transplant. 10 (4), 973-986 (2010).</li>
<li>Jay, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Increased+Costs+of+Donation+After+Cardiac+Death+Liver+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">The Increased Costs of Donation After Cardiac Death Liver Transplantation.</a> Ann Surg. 251 (4), 743-748 (2010).</li>
<li>Seehofer, D., Eurich, D., Veltzke-Schlieker, W., Neuhaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+Complications+After+Liver+Transplantation%3A+Old+Problems+and+New+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Biliary Complications After Liver Transplantation: Old Problems and New Challenges.</a> Am J Transplant. 13, 253-265 (2013).</li>
<li>Morrissey, P., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donation+After+Circulatory+Death%3A+Current+Practices%2C+Ongoing+Challenges+and+Potential+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donation After Circulatory Death: Current Practices, Ongoing Challenges and Potential Improvement.</a> Transplantation. 97 (3), 258-264 (2014).</li>
<li>Verdonk, R., Buis, C., Porte, R., Haagsma, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+complications+after+liver+transplantation%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Biliary complications after liver transplantation: A review.</a> Scand J Gastroenterol. 41, Suppl 243. 89-101 (2006).</li>
<li>Pine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+Transplantation+Following+Donation+After+Cardiac+Death%3A+An+Analysis+Using+Matched+Pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transpl%22%5BJournal%5D)">Liver Transplantation Following Donation After Cardiac Death: An Analysis Using Matched Pairs.</a> Liver Transpl. 15 (9), 1072-1082 (2009).</li>
<li>Sutton, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Criteria+for+viability+assessment+of+discarded+human+donor+livers+during+ex+vivo+normothermic+machine+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Criteria for viability assessment of discarded human donor livers during ex vivo normothermic machine perfusion.</a> PLoS One. 11, e110642(2014).</li>
<li>Bruinsma, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnormothermic+Machine+Perfusion+for+Ex+Vivo+Preservation+and+Recovery+of+the+Human+Liver+for+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Subnormothermic Machine Perfusion for Ex Vivo Preservation and Recovery of the Human Liver for Transplantation.</a> Am J Transplant. 14, 1400-1409 (2014).</li>
<li>Bruinsma, B. G., Yarmush, M. L., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organomatics+and+organometrics%3A+Novel+platforms+for+long-term+whole-organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Organomatics and organometrics: Novel platforms for long-term whole-organ culture.</a> Technology. 02 (1), 13-22 (2014).</li>
<li>Berendsen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+subnormothermic+machine+perfusion+system+restores+ischemically+damaged+liver+grafts+in+a+rat+model+of+orthotopic+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Res%22%5BJournal%5D)">A simplified subnormothermic machine perfusion system restores ischemically damaged liver grafts in a rat model of orthotopic liver transplantation.</a> Transplant Res. 1 (1), 6(2012).</li>
</ol>

בני הזוג. BE Uygun, K Uygun וYarmush הם ממציאים בפטנט שרלוונטי למחקר זה (WO / 2011 / 002,926), ובני הזוג. BE Uygun, K Uygun וYarmush הם ממציאים בפטנט שרלוונטי למחקר זה (WO / 2011/35223). בני הזוג. יש לי K Uygun וBruinsma בקשת פטנט זמני הקשורים לעבודה זו. יש לי ד&quot;ר K Uygun ולהיות Uygun אינטרס כלכלי בפתרוני איברים, חברה מתמקדת בפיתוח טכנולוגית שימור איברים. ד&quot;ר K Uygun ולהיות האינטרסים של Uygun מנוהלים על ידי MGH והשותפים HealthCare בהתאם לסכסוך שלהם על מדיניות ריבית.

בניסיון לשחזר את הכבדים נפצעו במהלך איסכמיה פיתחנו מערכת SNMP שיכול להיות מועסק לאחר תקופה של אחסון קר. זלוף המכונה Subnormothermic מציע חלופה לאחסון קונבנציונלי קר, וכן דרכי זלוף המכונה היפותרמיה וnormothermic. מערכות שונות קיימות; כולם מציעים יתרונות וחסרונות שונים 3,9,20. SNMP מאפשר לזלוף ללא ספק חמצן, כדרישות חמצן מטבולים בגיל 21 מעלות צלזיוס הם נפגשו על ידי חמצון פעיל של perfusate. למרות מופחת בתנאי subnormothermic, חילוף חומרים הוא משמעותי ודורש התמיכה של פתרון זלוף עשיר בחומרים מזינים. פתרונות זלוף מסורתיים, כגון פתרון זלוף המכונה בלזר, הם בדרך כלל מינימאליים בהרכב ומיועדים לזלוף הקר. &#39;וויליאמס בינוני E שמשה כמדיום תרבות hepatocyte במשך שנים רבות, והוא מכיל גomponents שהם אוניברסליים לתמיכה בפונקציה סלולרית, בפרט בתנאים חמים vivo לשעבר. מדידות שנעשו במהלך זלוף מכונה הם שיקוף של הפונקציה של האיבר. פרמטרים ישירות נצפים כגון ייצור מיצי מרה וספיגת חמצן הם מדידות בזמן אמת, שניתן להשתמש כדי להעריך את הכבד לפני ההשתלה. באופן דומה, סמנים של פגיעה ואיסכמיה (K +, שחרור חומצת החלב) סלולריות ניתן למדוד באופן ישיר בפתרון זלוף ועשויה להצביע על תפקוד איבר 20. ככל שטכנולוגיה מתפתחת זלוף מכונה נוספת ומשיגה יישום קליני נרחב יותר, מתאמים מדויקים בין פונקצית vivo לשעבר ותוצאה קלינית יכולים להתבצע ופרמטרי זלוף יהיו שימושיים בסיוע להחלטות להשתלת כבד או לדחות שולית באיכות. יתר על כן, כנקודה-התקדמות כלים אנליטיים טיפול, ניתוח מתוחכם יותר יהיה זמין ישירות במכונת perfuשיאון 21. בעבודה זו אנו מראים כי יכולים להיות נתמכים על כבדים במערכת SNMP עם פגיעה מינימאלית בכבד, המשתקפים בהיסטולוגיה ושחרורו של ALT. התאוששות תפקודית של הכבד מתבטאת הטובה ביותר על ידי ATP, אשר נמצאה במיתאם לכדאיות כבד והוא מאוד מרמז על הצלחת השתלה במודלים של בעלי חיים 22. Ex vivo והתאוששות לפני השתלה של שתלי כבד יאפשר הרחבה משמעותית של התורם בריכה כבד, תיקון הפער בין ההיצע והביקוש של כבדי תורם בהשתלה.

השתלה כבד היא הטיפול המרפא רק לעשרות אלפי חולים הסובלים ממחלת כבד סופנית. כדי להקל על השתלה מוצלחת, שימור אופטימלי של הכבד מרגע שהוא רכש מן התורם עד למועד זה הוא מושתל במקבל הוא הכרחי על מנת למנוע הידרדרות מהירה של השתל. הסטנדרטי לשימור כבד הנוכחי נקרא &quot;קירור סטטי &#39;: הכבד הוא מקורר בפתרון שימור קר כקרח, ובכך להפחית את חילוף החומרים של הכבד ולהאט את ההשפעות המזיקות של איסכמיה. למרות שטכניקת אחסון קרה זו אפשרה להשתלה מוצלחת, איברים של איכות שולית כגון איברי DCD נפגעו איסכמיה החמה או חולה נחות תכנית steatosis תוצאות 1. ישנו גוף המתרחב במהירות של ראיות שזלוף המכונה vivo לשעבר של שתלי כבד כשיטת שימור חלופית עלולים imלהוכיח תוצאות עבור איברים השוליים אלה 2,3. השתלה כבד הפכה לקורבן של ההצלחה שלה. הרבה יותר חולים מופנים להשתלה ממה שיש כבדים זמינים, ואלפים מתו ברשימת ההמתנה בארצות הברית בכל שנה. בהתחשב במציאות של המחסור הכבד תורם וניצול הגובר של שתלי כבד של איכות לא טובה למקבלי נזקקים, הוא מוחזק באופן נרחב שזלוף המכונה vivo לשעבר של שתלי כבד לפני ההשתלה מקיים את ההבטחה של שינוי פרדיגמה בהשתלת כבד. חל עלייה ניכרה בעניין מחקרי בנושא זה בשנים האחרונות 4-8. במרכזים באירופה ובצפון אמריקה שונים זלוף מכונה היפותרמיה הפך לאחרונה זלוף מכונה קליני הקדמת 8 וnormothermic בטמפרטורות פיסיולוגיות הוחל כבדים אנושיים שהושלכו והוא מתורגם לשימוש קליני, כמו גם 9.פיתוח נרחב שהוביל לפיתוח של פרוטוקולים שונים, תוך אופטימיזציה מתמדת מזהה את זלוף האופטימלי פרמטרי 10-12. שימוש בשתלים שולית באיכות גדל יותר פי 10 בעשור האחרון 13. בהשוואה לתקן הנוכחי לשימור כבד (אחסון קר סטטית), זלוף המכונה vivo לשעבר מספק יתרונות פוטנציאליים רבים, אשר כולם לגרום לנחוצה הרחבת בריכת האיברים ועלולים להיות ירידה בשכיחות של סיבוכים לאחר ההשתלה. בפרט, סיבוכי המרה שסובלים כיום שתלי כבד הכי מוצלחת באיכות לאחר ההשתלה יישארו בעיה משמעותית 14-18. זלוף מכונת בתנאי subnormothermic מספק חלון זמן כדי להעריך את תפקוד שתל באופן אובייקטיבי לעניין התאמה להשתלה 19. שני perfusate בעוד הכבד הוא להיות perfused במעגל vivo לשעבר,nd ניתן לדגום המרה המיוצרת במהלך זלוף למדידת סמנים של תפקוד איבר. בדרך זו &quot;קשה התפשר&quot; כבדים שמושלכים להשתלה תחת הקריטריונים הנוכחיים ניתן להעריך באופן אובייקטיבי כלהתאמתם להשתלה. הערכת כדאיות פוטנציאלית מאפשרת לרבים מאיברים אלה כדי להיות מנוצלים לצורך ההשתלה. יתרון חזק באותה מידה של זלוף מכונה הוא תיקון ושיפור של כבדים שניזוקו על ידי איסכמיה החמה / קרה. ATP מתרוקן בקצב מהיר מאוד באיסכמיה הקרה חמה ולאחר מכן וניתן repleted בתקופה של זלוף מכונה לפני ההשתלה של הכבד 20. הכבד, עם מאגרי האנרגיה שלה ומצב מטבולים מתחדש, הוא preconditioned ומוכן יותר להשפעות המזיקות של פגיעת reperfusion לאחר ההשתלה בנמען. עבודה זו מתארת ​​שיטה של זלוף המכונה vivo לשעבר של גרף כבד אנושיts במעבדה, אשר תהיה שימושי לחוקרים המבקשים ללמוד גם את הטכניקה והשפעות מיטיבות של vivo לשעבר זלוף מכונה. אנו עושים שימוש בכבדי תורם אנושיים שנדחו להשתלה ולאחר מכן הוקצו למטרות מחקר. טכניקת רכש כבד סטנדרטית כרוכה בסומק עורקים באתרו של הכבד הבא הידוק צולב אב העורקים בתורמי המוח מתים (DBD) או לאחר מעצר דם בתורמי דם מוות (DCD), תיארו בפירוט רב יותר במקום אחר 20. בנוסף, הכבד הוא מקורר במהלך הרכש על ידי מילוי חלל הבטן של התורם עם קרח. העדפות פתרון סומק להשתנות בין האזורים, עם רוב הרכישות באמצעות אוניברסיטת ויסקונסין או פתרון היסטידין טריפטופן-ketoglutarate (HTK). שטיפה-שולחן נוספת של וריד השער משפרת את שטיפת דם שייר. כבד לעתים קרובות נרכשים עוזב sur קטע של אב העורקיםעיגול תא מטען צליאק. כיס המרה היא חרות, מרה היא aspirated, ואת צינור המרה הוא הסמיק. הכבדים ארוזים בשקיות סטרילית המכילות פתרון שימור קר כקרח ומועברים בקופסות או קירור ייעודיים. לקבלת תוצאות נציג זמן איסכמיה החמה וקר צריך להיות מוגבל ל 60 דקות ושעה 12, בהתאמה. למרות הקרנה סרולוגיות שגרתית לפתוגנים transmissible, יש לנקוט באמצעי זהירות סטנדרטי בעת מסירת איברים אנושיים, דגימות שהתקבלו מאיברים אנושיים, וכל חומרי פסולת. הפרוטוקול כאן מתאר זלוף המכונה subnormothermic באמצעות מכשיר זלוף הכבד זמין מסחרי. שימוש במכשיר כזה מאפשר לתרגום מהיר יותר להגדרה הקלינית ואימות צולבת של פרוטוקולים שונים והגדרות מכשיר בין קבוצות מחקר ומרכזי השתלות.

<table><tbody><tr><td>מכשיר הזלוף Liver Assist</td><td>Organ Assist B.V.</td>סט חד פעמי <td>של Liver Assist</td><td></td></tr><tr><td>Liver Assist</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>Liver Assist חד פעמי</td><td></td></tr><tr><td>וויליאמס בינוני E</td><td>סיגמא</td><td>W1878&ndash; 6x500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>אלי לילי & Co</td><td>Humulin R U-100</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין 5,000 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Invitrogen</td><td>25030-156</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>MGH בית מרקחת</td><td>7750500</td><td></td></tr><tr><td>מיכל גז קרבוגן 95% O2/5% CO2</td><td>Airgas</td><td>ZO2OX9522000043</td><td></td></tr><tr><td>ווסת גז מיוחד</td><td>Airgas</td><td>Y11244D580</td><td></td></tr><tr><td>Lactated Ringer' s פתרון</td><td>Baxter</td><td>2B2324X</td><td></td></tr><tr><td>10% ניטרלי מאגר פורמלין</td><td>Fischer Scientific</td><td>316-155</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עם שיניים אדסון</td><td>Roboz</td><td>RS-5234</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לרקמות Debakey, 7.75 אינץ', 2.25 מ"מ</td><td>Roboz</td><td>RS-7562</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מצנבאום 7 אינץ' מעוקל SureCut טונגסטן</td><td>Roboz</td><td>RS-6965SC</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט Castroviejo 5.5&ndash; 7 אינץ'</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>0 תפרי משי קלועים שחורים</td><td>Ethicon</td><td>SA66G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 תפר ניילון, Nurolon RB1</td><td>Ethicon</td><td>C554D</td><td></td></tr><tr><td>מכונת ניתוח גזי דם</td><td>סימנס</td><td>RapidPoint 500</td><td></td></tr><tr><td>סולם איזון</td><td>קול פארמר</td><td>EW-10000-12</td><td></td></tr><tr><td>תיבת תצוגת לחץ</td><td>מדטרוניק</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>ערכות תצוגת לחץ חד פעמיות</td><td>Medtronic</td><td>61000</td><td></td></tr><tr><td>מדחום צמד תרמי כף יד ובדיקה</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-91500-04 ו-EW-08516-55</td><td></td></tr><tr><td>צינורית כלי עם קצה בלוטים, 4 מ"מ</td><td>Medtronic</td><td>30005</td><td></td></tr><tr><td>סט השקיה צינורות הדחה</td><td>Hospira</td><td>06543-01</td><td></td></tr><tr><td>קערת ערבוב, 4 ליטר</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07300-40</td><td></td></tr></tbody></table>

אדם תפקודי כבד שימור ושחזור על ידי אמצעי subnormothermic מכונת זלוף

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

כיום יש מחסור חמור בשתלי כבד זמינים להשתלה. יש צורך בטכניקות חדשות לשימור איברים כדי להרחיב את מאגר הכבדים התורמים. זלוף מכונה של שתלי כבד מתורם הוא חלופה לאחסון קר מסורתי של כבד וטומן בחובו הבטחה רבה כשיטה להרחבת מאגר האיברים התורמים. לאחרונה תיארנו את התועלת הפוטנציאלית של זלוף מכונה תת-נורמותרמית של כבד אנושי. כבדים שחדרו במכונה הראו שיפור בתפקוד ושיקום רמות ה-ATP של הרקמות. בנוסף, זלוף מכונה של שתלי כבד בטמפרטורות תת-נורמותרמיות מאפשר הערכה אובייקטיבית של הפונקציונליות וההתאמה של כבד להשתלה. בדרכים אלה ניתן להציל כבדים רבים שהושלכו בעבר בשל איכותם הלא אופטימלית באמצעות ההשפעות המשקמות של זלוף מכונה ולהשתמש בהם להשתלה. כאן אנו מתארים בפירוט טכניקה זו של זלוף מכונה תת-נורמותרמית. שתלי כבד אנושיים שהוקצו למחקר מוחדרים דרך עורק הכבד ווריד הפורטל עם פרפוזה מחומצנת תאית ב-21 מעלות צלזיוס.

מספר התצפיות והניתוחים יכול להתבצע על הכבד במהלך זלוף, כולל תצפיות בזמן אמת ישירות, כגון שיעורי זרימה וייצור מיצי מרה; מדידות בזמן אמת, כגון ניתוח גז של perfusate, ומדידות הפוסט הוק-שנעשות לאחר איסוף הדגימה כוללים ניתוח ביוכימי של perfusate ורקמות וניתוח היסטולוגית. תוצאות שהוזכרו כאן הן מ -22 כבדים אנושיים perfused. כבד נדחו להשתלת מסיבות שונות, כולל גיל תורם, זמן איסכמי החם מוגזם, תוצאות ביופסיה (steatosis, דלקת, פיברוזיס) ומסיבות לוגיסטיות. 18 כבדים היו רכש לאחר מוות לבבי, ו- 4 הבאים מוות מוחי. בשני המקרים, תורמים טופלו קודם לכן ב30,000 יחידות של הפרין וסמוק באתר ועל השולחן בחזרה עם פתרון UW. זמן ממוצע איסכמי הקר היה 531 ± 237 דקות (SD) ואת זמן איסכמי החם הממוצע היה 27 ± 10 דקות (SD), נמדד מנסיגה של חייםתמיכה לסומק קר. תצפיות בזמן אמת ומדידות ניתן להשתמש כדי להעריך את הכבד במהלך זלוף, ואילו מדידות פוסט הוק-מתגלות לאחר זלוף. תצפיות בזמן אמת זרימה דרך כבד מתחילה נמוכה משיעורי זרימת היעד, כתוצאה מהתנגדות גבוהה יותר בכבד הקר. שימוש בלחץ של 3 מ&quot;מ כספית על PV ו -30 מ&quot;מ כספית בHA בדרך כלל ניתן להשיג תזרים היעד פעם הכבד התחמם עד 21 &#160; ° C לאחר 60 דקות של זלוף (איור 1 א). זרימת מרה בדרך כלל ניתן להבחין בתוך 10 דקות של זלוף והוא מיוצר בהתמדה במהלך זלוף (איור 1). כמות מרה תלויה באיכות של הכבד ונעה בין 0.3 מיליליטר / שעה / כבד קילוגרם ל -18 מיליליטר / דקה / קילוגרם. בכבדים עם זמן איסכמי חם יותר, זרימת מרה נוטה לרדת, ואילו תוצאות קצרות יותר חמות איסכמי זמן ביותר יציב או אפילו הגדלתייצור מיצי מרה. מדידות בזמן אמת מדידה ישירה ותכופה של perfusate על ידי ניתוח גז דם בחיוני הן למטרות הניסוי, כמו גם תנאי זלוף נאותים שמירה, חשוב חמצון וpH. לחץ חלקי של חמצן מומס צריך להיות גדול מ -700 מ&quot;מ כספית על יבוא של שני PV וHA. לחץ יצוא חמצן, שנמדד בווריד הנבוב, בדרך כלל יורד עם זלוף יותר, המשקף ספיגת חמצן גוברת. ניתן לחשב שיעורי ספיגת חמצן כפי שתוארו לעיל 13 ונעו 0.5-2.2 2 / min / קילוגרם O מיליליטר בתחילת זלוף ל2.4-9.7 2 / min / קילוגרם O מיליליטר ב t = 3 שעות (איור 1 ג). ירידה בpH הוא ציין ב30 דקות הראשונות (1D איור), כתוצאה משחרור חומצת החלב בperfusate בעיקר. זה יכול להיות נתמך על ידי תוספת של 8.4% bicarbo נתרןנייט ולאחר כ -90 דקות pH נופל חזרה לטווח נורמלי. בדרך כלל, 30-50 מיליליטר של 8.4% סודיום ביקרבונט נדרש. עליות חומצת החלב ריכוז במהירות בדקות 15-30 הראשונות, אבל מתחילה פטירה אחרי השעה הראשונה (איור 1E). מדידות פוסט-הוק transaminases כבד כגון ALT ניתן למדוד בperfusate. ב -30 דקות הראשונות עלייה גדולה של ALT בדרך כלל נצפתה המשקפת את כישלון של ALT ששוחרר במהלך איסכמיה (איור 1F). ALT הוצגו לתאם גם עם זמן איסכמי חם 13. זלוף מכונת מוגבר תוכן ATP 2.8 לקפל, המשקף מצב התאוששות אנרגיה (איור 1G). ניתוח היסטולוגית H &amp; E מגלה שום פגיעה נוספת נגרמה במהלך זלוף מכונה (איור 1H, I). יש לציין כי משטר הביופסיה שהוצע בפרוטוקול זה הוא למילמטרות וearch לא יכולות להיות ישימות למטרות קליניות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> איור 1:. הערכה של כבדים אנושיים במהלך זלוף מכונה לזרום דרך PV וHA במהלך SNMP (), ייצור מיצי מרה, לכמת לשעה של זלוף (B), שיעור uprate חמצן (שלנו), מחושב על פי הפרש ביבוא (PV + HA) ויצוא (וריד נבוב), הפסיק את הקווים להראות לחצים חלקיים של חמצן בin-והיצוא במהלך זלוף (C), pH וחומצת חלב במהלך זלוף (D, E), שחרורו של ALT לperfusate (F), ATP תוכן שנמדד ברקמות מביופסיות לשעה (G) וכתמי H &amp; E של הכבד (DCD 54 שנה ישנה, ​​איסכמיה החמה 19 דקות, איסכמיה הקרה 559 דקות) לפני וזלוף (H) לאחר (I). תוצאות מוצגות כממוצע ± SEM. <ahref = היעד &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אנו מתארים שיטה של זלוף המכונה vivo לשעבר של שתלי כבד אנושיים בטמפרטורת subnormothermic (21 מעלות צלזיוס).

אדם תפקודי כבד שימור ושחזור על ידי אמצעי Subnormothermic מכונת זלוף

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ביצוע פרפוזיה של כבד אנושי באמצעות מכונת תמיכה תרמית בתנאים סוב-נורמליים, לצורך שימור, התאוששות והערכה של האיבר. במסגרת מחקר פרה-קליני, הדבר מושג תחילה על ידי הכנת הכבד לחיבור למכשיר. בשלב השני, מערכת הפרפוזיה המכנית מועמסת בנוזל (primed), והכבד מחובר אליה, ובשלב הסופי מתחילה הפרפוזיה.הכבד שעבר פרפוזיה במכונה יהפוך לפעיל תפקודית במצב תרמי תת-נורמלי, ויפיק מיץ מרה. בסופו של דבר, ניתן לנתח דגימות שנאספו מהכבד במהלך הפרפוזיה כדי לחקור את ההתאוששות המטבולית ואת התפקוד של האיבר. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות שימור קיימות, כגון פרפוזיה קרה ופרפוזיה בטמפרטורה נורמלית, הוא שפרפוזיה במכונה בטמפרטורה תת-נורמלית מאפשרת התאוששות תפקודית והערכה של חיוניות הכבד, מבלי להזדקק למענה לדרישות המטבוליות הגבוהות של פרפוזיה בטמפרטורת הגוף.היבטים רבים של טכניקה זו דורשים ניסיון או הדגמה לצורך ביצוע מוצלח. לדוגמה, הדגמה של אופן ביצוע ההכנה של הכבד על שולחן העורף (back table preparation), הכוללת את נתיחת העורק, הווריד ותעלת המגוף, עשויה לסייע לחוקרים ללא הכשרה כירורגית מוקדמת. עם קבלת הכבד, הניחו קערת איברים מלאה בקרח על משטח סטרילי מכוסה, והוציאו את הכבד מקופסת ההובלה, כאשר הוא נותר טבול ברובו בשק של תמיסת שימור קרה. לאחר מכן, השתמשו במספרי Metzenbaum כדי לחשוף את הענפים השונים לאורך האספקה העורקית לכבד, מהאאורטה ועד לעורק הכבדי הנ właści (proper hepatic artery).לאחר מכן, נתחו בזהירות את שאר העורק כדי למנוע חיתוך של כלי דם המספקים דם לכבד, ללא חיתוך או קשירה של ענפים שסופם אינו גלוי. כאשר העורק בודד, השתמשו בתפרי משי בגודל 0 עד 4/0 כדי לקשור את כל הענפים העורקיים שאינם מספקים דם לכבד. קשרו וחתכו את עורקי הטחול והקיבה קרוב למקורם בעורק הצליאקי (celiac trunk).גזרו טלאי אאורטלי סביב גזע הצליאק. לאחר מכן, השתמשו בקנולה לפרפוזיה עורקית כדי לבצע קנולציה של גזע הצליאק. כעת, בצעו דיסקציה לשחרור הווריד הפורטלי, תוך קשירה של כל ענף או תפירה של חורים בווריד, ובצעו קנולציה באמצעות קנולה לפרפוזיה של הווריד הפורטלי.הסר מקטעים מהסרעפת מה-supra hepatic vena cava מבלי לחתוך את הווריד עצמו. לאחר מכן, גזור שתי דגימות רקמה בעלות היקף מלא ובאורך של 2 עד 3 מילימטרים מקצה צינור המרה המשותף (common bile duct). יש לטפל בדגימות בעדינות.בצע הקפאה מהירה (Snap freeze) לדגימה אחת בחנקן נוזלי לאחסון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס, ואת הדגימה השנייה אחסן ב-10% buffered formin. לאחר מכן, בצע קנולציה של צינור המרה המשותף (common bile duct) באמצעות קנולה לכלי דם וחבר צינור ניקוז העשוי מצינורית בעלת קוטר קטן. לבסוף, קשור את צינור כיס המרה (cystic duct) באמצעות קשירת משי בגודל 0.חברו את ערכת צינורות השטיפה לשקיות קרות של תמיסת Lactated Ringer ובצעו הזרמה ראשונית (priming) של הצינורות כדי להוציא את האוויר. כוון את ווסת הזרימה בצינור השטיפה לטפטוף איטי וחסמו את הווריד הפורטלי ב-hilum כדי להוציא אוויר מהכלי. כעת מלאו את הקנולה בווריד בתמיסת השטיפה כדי להוציא את האוויר מהווריד הפורטלי, תוך הקפדה לא להגביה את השקית יותר מ-20 centimeters מעל גובה הכבד כדי למנוע לחץ מופרז על הווריד.לאחר מכן, שטפו את הכבד באמצעות שני ליטרים של תמיסת lactated ringer קרה בטמפרטורת קרח (ICEC). במהלך השטיפה, חסמו לזמן קצר את הווריד הפורטלי בנקודה הנמוכה ביותר כדי לבדוק דליפות, ולאחר מכן חזרו על השטיפה עבור העורק הכבדי עם ליטר אחד של תמיסה כפי שהודגם כעת. בזמן שטיפת הכבד, הכינו את מערכת הפרפוזיה על ידי הוספת שני ליטרים של profuse eight בטמפרטורת החדר לקערת האיברים והפעילו את המכשיר כדי למלא את הצינורות. הגדירו את הטמפרטורה ל-21 degrees Celsius.לאחר מכן, הגדרו לחץ של 3 mm Hg בווריד הפורטלי ו-30 mm Hg בעורק הכבדי. פתחו את מיכל גז הקרבוגן והגדירו אותו לספיקה של 3 L/min. לאחר מכן, שאבו דגימת גזי דם מנקודות הדגימה של זרימת הכניסה לווריד הפורטלי ולעורק הכבדי, והריצו את הדגימות במכשיר לניתוח גזי דם בהתאם להוראות היצרן כדי לאשר חמצון ו-pH תקינים.השתמש בנתרן ביקרבונט או במימן כלורי כדי לתקן את ה-pH לפי הצורך. לאחר מכן, לפני חיבור הכבד, אסוף דגימה של 1 mL מהפרפוזט כמדידת זמן אפס ושמור אותה בטמפרטורה של 80°C- . השתמש בלהב פלדה בעל שם אחת כדי לגזור שני ביופסיות בצורת טריז של כ-250 mg כל אחת מהכבד גם בשלב זה.הקפאה מהירה (Snap freezing) של דגימה אחת בחנקן נוזלי לאחסון בטמפרטורה של 80°C- וקיבוע של הדגימה השנייה בפורמלין מנוטרל בריכוז 10%. לפני תחילת הפרפוזיה, שקלו את הכבד, לאחר מכן העבירו את האיבר לתא האיברים של המכשיר והוציאו את האוויר מהקנולות. כפי שהודגם הרגע.לאחר שהקנולות הוכנסו, חברו את זרימות הכניסה של הווריד השער (portal vein) ועורק הכבד לקנולות המתאימות. התחילו בפרפוזיה וודאו שהכבד טבול בנוזל הפרפוזיה, וכסו כל משטח יבש, כולל כלי הכניסה, בגזה סטרילית לחה. כדי למנוע התייבשות, אפשרו לצינור המרה להתנקז אל מיכל איסוף.יש לוודא שפתח ניקוז המרה נמצא בגובה הכבד או נמוך ממנו כדי לאפשר למרה לזרום בחופשיות. ברגע שהכבד חומם ל-21 °C, יש לכוון את קצבי הזרימה ל-275 עד 325 ו-50 עד 100 milliliters per minute per kilogram עבור הווריד הפורטלי ועורק הכבד, בהתאמה. במהלך הפרפוזיה, יש לדגום את רקמת הכבד שעברה פרפוזיה ואת המרה בהתאם.המשיכו בפרפוזיה במשך שלוש שעות, תוך ניטור הלחץ, ה-pH והחמצון, והתאמת ה-pH באמצעות סודיום ביקרבונט לפי הצורך. בסיום הפרפוזיה, אספו את הדגימות הסופיות, נתקו את הכבד והוציאו את הקנולה מתוך צינור המרה. לבסוף, אספו שתי דגימות רקמה של צינור המרה לאחר הפרפוזיה כפי שהודגם כעת, והשליכו את הכבד האנושי.יש לפעול בהתאם להנחיות הפינוי של פסולת ביולוגית מסוכנת. הזרימה מתחילה ברמה נמוכה כתוצאה מהתנגדות גבוהה יותר בכבד קר, תוך שימוש בלחץ של 3 mmHg בווריד השער ו-30 mmHg בעורק הכבדי. ניתן בדרך כלל להגיע לספיקות היעד לאחר שהכבד התחמם ל-21 °C לאחר 60 דקות של פרפוזיה. מדידה תכופה של הפרפוזאט באמצעות אנליזה של גזי דם היא חיונית הן למטרות ניסיוניות והן לשמירה על תנאי פרפוזיה הולמים.לדוגמה, הלחץ הפרציאלי של חמצן מומס צריך להיות גבוה מ-700 millimeters mercury בזרימה הנכנסת הן לווריד הפורטלי והן לעורק הכבדי. לעומת זאת, לחץ החמצן בזרימה היוצאת הנמדד בווריד הנבוב (vena cava) אמור בדרך כלל לרדת ככל שמשך הפרפוזיה מתארך, מה שמשקף עלייה בספיגת החמצן. ניתן למדוד ב-PERFU eight גם טרנסאמינזות כבדיות, למשל.בדרך כלל נצפית עלייה ברמות ה-alanine transaminase או ה-LT ב-30 הדקות הראשונות של הפרפוזיה, עם עלייה מינימלית נוספת במהלך שאר זמן הפרפוזיה. הערכה נוספת של ייצור TP בכבדים שעברו פרפוזיה מכנית מעלה עלייה של פי 2.8 בתוכן ה-A TP של הכבד, המבטאת התאוששות של מצב האנרגיה. יתרה מכך, ניתוח היסטולוגי בשיטת h and e אינו מגלה פגיעות נוספות שנגרמו במהלך הפרוצדורה.מעקב אחר נוהל זה מאפשר ניתוח נרחב של הכבד המבודד ומספק תובנות ייחודיות לגבי פיזיולוגיה ופתולוגיה של הכבד. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לתחזק כבד אנושי במהלך פרפוזיה מכנית סוב-נורמלית (suberic machine perfusion) כדי לאפשר הערכה של תפקודו מחוץ לגוף.

functional-human-liver-preservation-recovery-means-subnormothermic

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

שתלי שוליים, כגון כבד שומני, שתלי מתורמים מבוגרים, או כבדים הוחזרו לאחר מוות לבבי (DCD) לסבול אחסון קונבנציונלי, קר סטטי רק בצורה גרועה. פיתחנו מודל חדשני של vivo לשעבר זלוף כבד subnormothermic לשימור, הערכה, ותיקון של שתלי כבד שוליים לפני ההשתלה.

טכניקה של Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הכבד זלוף לאחסון, ההערכה, ותיקון שתלי כבד שולי

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר זלוף מחומצן במכונה מחוץ למקום של שתלי כבד מתורם. מאמר זה מכיל פרוטוקול שלב אחר שלב לרכישה והכנת שתל הכבד לזלוף מכונה, הכנת נוזל הזלוף, הפעלת מכונת הזלוף וביצוע זלוף מכונה נורמותרמית מחומצנת של שתל הכבד.

באתרו לשעבר Normothermic מכונת זלוף של כבדים תורמים

שיש מחסור משמעותי לתורם כבד, הקריטריונים עבור התורמים הכבד שהורחבו. Normothermic ex-vivo הכבד זלוף (NEVLP) פותחה כדי להעריך ולשנות את תפקוד האיבר. מחקר זה מדגים מודל עכברוש של NEVLP, בדיקות היכולת של pegylated-קטלאז, להקל על פגיעה בכבד שימור.

מודל בעלי חיים קטנים של זלוף הכבד Normothermic Vivo לשעבר

המודל החזירי של זלוף מכונה נורמותרמית בכבד (NMP), המתואר כאן, יכול לשמש בהצלחה לחקר NMP כאסטרטגיית שימור, כלי להערכת כדאיות ופלטפורמה לתיקון איברים. הוא בעל ערך תרגומי גבוה, אולם הוא מאתגר מבחינה טכנית ודורש עבודה רבה.

חזיר נורמתרמי מבודד כבד פרפוזיה

מערכת זילוח כבד נורמותרמית ex vivo (NEVLP) נוצרה עבור כבדי עכברים. מערכת זו דורשת ניסיון במיקרו-כירורגיה אך מאפשרת תוצאות זילוח הניתנות לשחזור. היכולת להשתמש בכבדים של עכברים מאפשרת לחקור מסלולים מולקולריים לזיהוי תוספי פרבוסט חדשים ומאפשרת ביצוע ניסויים המתמקדים בתיקון איברים.

זילוח מכונת כבד Normothermic Ex Vivo בעכבר

פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה של הקמת מודל חזירי המשתמש בזילוח מכונה מבוקר טמפרטורה משתנה (MP) לשימור הכבד התורם, ואחריו השתלת כבד אורתוטופית (OLTx). מטרתו לקדם את שיעור ההצלחה של OLTx באמצעות תרומת תורם לאחר מוות במחזור הדם (DCD) כבד ולהקים מודל יציב.

שימור תרומת חזיר לאחר מוות במחזור הדם (DCD) כבד על ידי זילוח והשתלת כבד אורתוטופית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למערכת זלוף נורמותרמית ex vivo בקוד פתוח הניתנת לשינוי שנועדה להתגבר על העלות הגבוהה והגמישות המוגבלת של פלטפורמות קיימות, ולאפשר שימוש נגיש יותר, חסכוני ואיטרטיבי במחקר ביו-רפואי פרה-קליני.

מערכת זילוף נורמתרמית בקוד פתוח המיועדת למדעני מחקר

המטרה היא להציג שיטה חדשה, גירוי נשימה, שליטה חשמלי (BreEStim) לטיפול בכאב נוירופתי וספסטיות.

גירוי נשימה מבוקרת חשמל (BreEStim) לטיפול בכאב נוירופתי וספסטיות

המנגנונים מובילים להתפתחות של היפרפלזיה אינטימה (IH) וכישלון שתל וריד עדיין לא נחקרו מספיק. מחקר זה מתאר מערכת ex vivo לינקב ורידי אדם תחת זרימה ולחץ מבוקרים. יתר על כן היעילות של חיזוק רשת חיצוני כדי להגביל את פיתוחה של י.ה. הוערך.

נוהל saphenous אדם הוורידים Ex Vivo זלוף וחיצוני חיזוק

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כיצד לבצע זלוף כבד מבודד (IHP) עם מלפלן ואנו דנים גם ב-IHP כאופציה טיפולית לגרורות בכבד של מלנומה ענבית.

כבדית זלוף המבודד לטיפול בכבד גרורות של מלנומה של הענביה

למדו שיטת שימור כבד אנושי באמצעות מכונת זלוף בטמפרטורה תת-נורמותרמית של 21 מעלות צלזיוס. שיטה זו מאפשרת הערכת תפקוד ושחזור מטבולי של האיבר לפני השתלה.

אדם תפקודי כבד שימור ושחזור על ידי אמצעי Subnormothermic מכונת זלוף

גלה סרטונים נוספים