Name: טכניקת העשרה אופטימלית עבור הבידוד של Arthrobacter Bacteriophage מינים מדגימת הקרקע מבודדת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: למד פרוטוקול העשרה לבידוד בקטריופאג'ים של Arthrobacter מדגימות קרקע. השיטה מאפשרת בידוד מהיר ושחזור של פאג'ים לחקר מיקרוביולוגיה ווירולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון לפיתוח פרוטוקול זה מסופק על ידי דרום מזרח פנסילבניה Consortium להשכלה גבוהה וCabrini מכללת המחלקה למדע. מימון ותמיכה נוספים הגיעו מאוניברסיטת ארקדיה והאוניברסיטה של ​​תמה. תודה מיוחדת לד&quot;ר קארן Snetselaar באוניברסיטת סנט ג&#39;וזף לחביבות לוקח את תמונות אלקטרון המיקרוסקופיות של פאגים המבודדים שלנו. תמיכה נוספת מסופק על ידי ציידי המכון הרפואי הווארד יוז Alliance החינוך המדעי הפאג קידום Genomics ותכנית (SEA-פאגים) אבולוציונית מדע.

1. הכנת תאי Arthobacter לבידוד הפאג <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> sp Arthrobacter התרבות. KY3901 מושבות מפוספסות על צלחת לוריא Bertaini (LB) אגר טופחה על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. פיק מושבה ולהשתמש בלולאת סטרילי כדי להוסיף אותו ל -250 מיליליטר של מרק LB בבקבוק תרבות מבולבל ודגירה בחממה רועדת ב 225 סל&quot;ד ב 30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר כ 24 שעות של צמיחה להשיג תאים מאוחר מעריכי / תחילת נייחות שלב ניסויי זיהום הפאג. לפקח על המצב של התפתחות חיידקים באופן הדוק כדי למנוע מתאים מלהיכנס לאמצע למצב צמיחה נייח מאוחר. הערה: צמיחת תא צריכה להיות מורכבת של OD צפיפות אופטי 600 בין 0.5-.0.7 לנהלי בידוד הפאג וטיהור / השלבים מתוארים להלן. </li></ul> 2. אוסף של הפאג מדגימות קרקע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 200-400 גרם של אדמה ממקום רצוי. הערה: מאחר שחיידקים בArthrobaסוג cter הם חיידקי קרקע משותפים להם וניתן למצוא פאגים המדביקים אותם ובמחלחלים ברוב סוגי הקרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לפחות 400 מיליליטר של הפאג הצפת (PB) [68 מ&quot;מ NaCl, 10 מ&quot;מ MgSO 4, 10 מ&quot;מ טריס-CL (pH 7.5)] לאדמה ולערבב בבקבוק מספיק גדול כדי שלפחות 200 מיליליטר של PB הוא בsupernatant והוא מסוגל לחלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי ערבוב או מתערבלים עד הקרקע מושעה ולאפשר משקעי האדמה להתיישב, בדרך כלל 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את &quot;תמצית האדמה&quot; דרך נייר סינון על ידי סינון כוח משיכה כדי להסיר שאריות משקעים אדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אבקת LB ולערבב כדי להפוך את פתרון 2% (4 אבקת g LB ב200 מיליליטר תמצית אדמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר על ידי סינון ואקום להשיג תסנין סטרילי. במידת האפשר, להמשיך לשלב 2.7 באופן מיידי. אם יהיה צורך, חנות מסוננת דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לפני שתמשיך, עם זאת, מספרם של חלקיקי phage קיימאיהיה קטן יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר Aliquot 50 מיליליטר מנות של תערובת תמצית LB / אדמה מעוקרת מסנן לתוך 250 מיליליטר בודד המעוקרות רועדים תרבות צלוחיות מבולבלות תוך שימוש בטכניקות aseptic. הוסף פתרון 2 M CaCl סטרילי 2.0 לריכוזים הרצויים הסופיים (0-50 מ&quot;מ) מאז פאגים Arthrobacter שונים לגדול בצורה אופטימלית תחת CaCl 2 תנאים שונים. הערה: אנו מוצאים כי הרוב המכריע של פאגים Arthrobacter המזוהים על ידינו הוא בטווח של 1 מ&quot;מ 2.5 מ&quot;מ CaCl 2. עם זאת, כמה מפאגים המבודדים גדלו על ידינו באופן בלעדי ב0 מ&quot;מ CaCl .or 2 בCaCl 2 ריכוזים גבוהים מאוד. פנה מייד לשלב 3.1. </li></ol> בידוד 3. הפאג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1-2.5 מיליליטר של תרבות מעריכי / תחילת סוף נייחת חיידקי שלב לכל אחד מהצלוחיות. לOD 600 0.5-0.7, להשתמש 1 מיליליטר של תאים. לOD 600 גבוה מOD של 0.7 להשתמש 2.5 מיליליטר שלתאים. הערה: תאים בגידול שלב מעריכי בדרך כלל תשואה יותר פאגים וtiters גבוה יותר מאשר תאים בגידול שלב נייח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake צלוחיות ב 250 סל&quot;ד ב 30 מעלות צלזיוס למשך כ 24 שעות בתוך חממה רועדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת דגירה 24 שעות להסיר את צלוחיות העשרה מן החממה הרועדת ולדלל את דגימות ההעשרה פי עשרה במאגר הפאג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת צינורות תרבות עם 0.5 מיליליטר של תרבות מעריכי / תחילת סוף נייחת חיידקי שלב ולהוסיף כמויות שונות של תרבות ההעשרה (5 μl 500 μl של דילול 10 -1 בPB) לצינורות התרבות. הערה: מומלץ לבדוק מגוון רחב של ריכוזים מאז כל דגימת קרקע יוצרת titers הפאג שונה לאחר העשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף CaCl 2 לצינורות תרבות כדי להפוך את ריכוז סופי שווה להווה הריכוז בבקבוק ההעשרה המקורי. השתמש במגוון של CaCl 2 ריכוזים שונים כדי לבחור לפאגים רבים wה- i משתנה CaCl 2 תלות. הערה: רוב פאגים יהיו מבודדים בטווח של 1-2.5 CaCl 2 מ&quot;מ אבל יש פאגים המבודדים ביותר בצורה אופטימלית בכל מקום 0-50 CaCl 2 ריכוזי מ&quot;מ. בגלל זה הוא הטוב ביותר לבדוק מגוון של CaCl 2 ריכוזים כדי למקסם את מספר פאגים Arthrobacter המבודדים ייחודיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 4.5 מיליליטר של אגר העליון LB בצינור התרבות ויוצקים את התערובת על צלחת אגר LB. מערבולת בעדינות כדי לפזר באופן שווה על פני הצלחת ולאפשר לאגרת עליון כדי לחזק למשך כ 15 דקות. הערה: Top אגר יכול להיות מוכן בקבוצות גדולות יותר (250 מיליליטר) ואגרתי עליון נוסף יכול להיות מאוחסן על RT ושימוש חוזר בניסויים הבאים לשבועות לפחות. אמנם יש נוסחות שונות המשמשות לייצור אגר עליון, אנו עושים העליונים אגר באמצעות 7G / L של אגר מעורבב עם קילו אגר עליון מקום באמבט המים C ° 60 כדי לשמר את המצב הנוזלי במהלך ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך tהוא צלחת דגירה בטמפרטורה רצויה (טמפרטורה עד 30 מעלות צלזיוס) O / N 48 שעות. להשתנות בתנאים אלה כדי לייעל לפאגים הנוכחיים. פאגים המבודדים ביותר מגיעים מצלחות טופחו על 30 מעלות צלזיוס ב1-2.5 מ&quot;מ CaCl ריכוז 2 לאחר תקופת דגירה 24 שעות. </li></ol> 4. הפאג טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בדיקת דגירה 24 שעות להיווצרות הפלאק על צלחות. המשך דגירה של עד 72 שעות אם לא לוחות ניכרים או כדי לקבוע אם לוחות נוספים יופיעו. במידת צורך, צלחות חנות עם שלטים המשוערת לתקופה של עד שבוע ב 4 ° C לפני שתמשיך. הערה: אין זה נדיר למצוא מגוון רחב של מורפולוגיות שלט שונות בצלחת אחת. מציאת לוחות לאחר 3 ימים של דגירה אפשרית אך נדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר פאגים הרצויים מלוחות מבודדים באופן ברור בשיטת שלט פס. לגעת שלט עם מקל עץ סטרילי. Streak השלט על ידי הפעלת מקל עץ דרך להבה, allowing המקל להתקרר בקצרה, ולאחר מכן לשפשף את המקל על הצלחת אגר בתנועה העדינה, כפי שמוצג באיור 1. חזור על פעולה זו בעזרת מקל נקי לכל מעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, השתמש בassay כייל שלט המסורתי לבודד את הפלאק הפאג בודד. Assay כייל השלט דורש שימוש בחומרים כימיים יותר כגון אגר LB ואגר העליון LB וחומרים כגון צלחות פטרי לבידוד לוחית הפאג. יש לנו הצלחה רבה בשיטת שלט פס אבל זה יותר קל מבחינה טכנית לבודד את הפלאק בודד באמצעות assay כייל שלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהצלחת אגר LB היא מפוספסת לפחות שלוש פעמים, סמן את השטח עם הריכוז הנמוך ביותר של חלקיקי phage משוערים ועדינות להחיל 0.5 מיליליטר של Arthrobacter ו -4.5 מיליליטר של אגר העליון LB המותך (המכיל את אותו ריכוז של סידן כלורי כצלחת ההורה ) ולאפשר לו להתפשט באופן שווה על פני הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דגירה O צלחת / N. חזור על שלט הפסטכניקה לפחות שלוש חזרות כדי להבטיח מיני הפאג טהורים מבודדת. צלחות חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לפי צורך בין פסים ללא אובדן משמעותי של כדאיות הפאג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוחות רצויים ברגע שכבר גדלו ומבודדים על צלחת הפס הסופית, לגעת שלט אחד מבודד היטב עם טיפ micropipette מחדש להשעות ב 100 PB μl. סדרתי לדלל פתרון 10 0 זו לדילול 10 -8 על ידי העברת 20 μl של המדגם לμl 180 של PB הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של דילול כל 0.5 מיליליטר של Arthrobacter גדל בצינור תרבות במשך 5 עד 10 דקות ב RT וצלחת על ידי ערבוב החיידקים הנגועים עם 4.5 מיליליטר של אגר העליון מותך LB המכיל את אותו הריכוז של CaCl 2 משמש כדי לבודד את הפאג ממדגם הקרקע המקורי. שמור את כל דילולים נעשו על 4 מעלות צלזיוס עד ליום המחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את דילול סדרתי הפאג צריך לעשות תבנית אינטרנט באמצעות כייל השלט המסורתי כאומר. המטרה של assay כייל השלט היא לקבוע את כייל הפאג צריך להשיג צלחת דפוס אינטרנט. לזהות צלחת דפוס אינטרנט כבעיקר נטולת חיידקים אך מכילה שאריות של חיידקים שעדיין לא lysed ידי פאגים. הוסף 5 מיליליטר של תרבות Arthrobacter מאוחר מעריכי / תחילת נייחת לבקבוק תרבות 50 מיליליטר סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של הדילול (שנתן דפוס אינטרנט לתרבות Arthrobacter) בבקבוק התרבות 100 μl ולאפשר פאגים להדביק את תאי חיידקים במשך 5 עד 10 דקות ב RT. מערבבים עם אגר העליון מותך LB המכיל את אותו הריכוז של CaCl 2 כבתחילה כדי לזהות את הפאג וצלחת 5 מיליליטר של תערובת זו על גבי 10 לוחות LB טריים. לאפשר לביסוס ודגירת צלחות הפוכות ב 30 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להציף את צלחות דפוס האינטרנט עם 5 מיליליטר של PB וO חנות / N ב 4 ° C או 4 שעות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את lysate הפאג דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטרולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש מניות הפאג זה סופי לניסויים נוספים כגון תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של חלקיקי הפאג, בידוד הדנ&quot;א הגנומי הפאג לניתוח אנזים הגבלת DNA ורצף הגנומי באמצעות נהלים סטנדרטיים. לאחסון ארוך טווח של מניית הפאג, להוסיף כמות שווה של lysate הפאג לגליצרול סטרילי בבקבוקונים קטנים לאחסון בארכיון המניה ב -80 ° C. הערה: למי שלא חווה עם טכניקות הפאג אלה, משאב נהדר הוא אתר www.phagesdb.org הנגיש באינטרנט. </li></ol>

<ol><li>Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Catabolic+Pathways%3A+Genomic+Insights+into+Microbial+s-Triazine+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism.</a> J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).</li>
<li>Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Atrazine+Degrading+Arthrobacter+sp.+AD26+and+Use+of+this+Strain+in+Bioremediation+of+Contaminated+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil.</a> J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).</li>
<li>Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+an+Arthrobacter+sp.+Strain+HB-5+that+Transforms+Atrazine%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Geochem+Hlth%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine.</a> Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).</li>
<li>Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identities+of+Arthrobacter+spp.+And+Arthrobacter-Like+Bacteria+Encountered+in+Human+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens.</a> J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).</li>
<li>Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Arthrobacter+Bacteriophages+and+Their+Application+to+Phage+Typing+of+Soil+Arthrobacters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters.</a> Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).</li>
<li>Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+Gordonia+and+Nocardia+Stabilized+Foam+Formation+by+Using+Bacteriophage+GTE7%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).</li>
<li>Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Characterization+of+Site-specific+Integration+Functions+of+phi+AAU2+infecting+%E2%80%9CArthrobacter+aureus%E2%80%9D+C70%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70.</a> J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).</li>
<li>Casida, L. E., Liu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthrobacter+globiformis+and+Its+Bacteriophage+in+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil.</a> J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).</li>
<li>Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+a+Bacteriophage+of+Arthrobacter+globiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis.</a> J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).</li>
<li>Twest, R., Kropinski, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+Enrichment+from+Soil+and+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage Enrichment from Soil and Water.</a> Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).</li>
<li>Fullner, K. J., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteriophage+L5+Infection+of+Mycobacterium+bovis+BCG%3A+Implications+for+Phage+Genetics+in+the+Slow-growing+Mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).</li>
<li>Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Growth+Characteristics+on+Stationary+Phase+Achromobacter+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells.</a> J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).</li>
<li>Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T4+Bacteriophage+Average+Burst+Size+Varies+with+Escherichia+coli+B23+Cell+Culture+Age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age.</a> Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).</li>
<li>MacWilliams, M. P., Liao, M. K. Luria Broth (LB) and Luria Agar, Media and Their Uses Protocol. ASM MicrobeLibrary. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli">http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli</a> (2013).</li>
</ol>

מחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

למרות ניסיונות רבים קודמים לבודד פאגים מסוגלים להדביק מארחי Arthrobacter, היו לנו הצלחה קטנה באמצעות הליכי העשרה סטנדרטיים. השיטה הכללית של העשרת חיידקים פיתחה והתאימה על ידי ואן Twest וKropinski 10 להעשיר פאגים מדגימות סביבתיות הוא הבסיס למרבית הליכי העשרה. ראיות ממחקרים קודמים מצביעות על כך ששיטות של ציפוי ישיר הפיקו לוחות זיהוי על זנים של Arthrobacter אם כי בשיעורי הצלחה נמוכים מאוד של בידוד 5. בשיטת הציפוי הישירה, פאגים מופקים מדגימות קר...

המצאות בכל מקום של מיני Arthrobacter בסביבות אדמה מציעה מספר ומגוון עצומים של פאגים מסוגלים להיות מבודד ממין זה של חיידקי מארח. חברי חיידקים ממשפחת Acintobacteriaceae הם בולטים ביותר למסלולי קטבולי של משפיל תרכובות סוררות כמו אטרזין וחומרי הדברה שונות ו1,2,3 קוטלי עשבים. למרות שרוב המחקר שנעשה באמצעות זנים סביבתיים של Arthrobacter, מבודדים קליני של הסוג הזה נמצא בדם, שתן, עיניים, ומקורות רבים אחרים אדם כולו מוצגות ההטרוגניות פילוגנטי 4. אמנם יש גוף נרחב למדי של מחקר על חיידקי Arthrobacter, רק מעט מחקרים לדווח על פאגים מסוגלים להדביק בני מין מגוון זו. מעניין אם כי, שנעשתה בעבר על Arthrobacter עבודת פאגים נגיעות בכמה נושאים שונים מפתח כגון ההקלדה של אדמה &lt;em&gt; מיני Arthrobacter 5 שימושים תעשייתיים, במטרה להפחית את הקצף מזיק במפעלים לטיפול בבוצה משופעלת 6, ועבודה המדגישה רקומבינציה ספציפית באתר וגני אינטגראז 7. פרוטוקולי טכניקת העשרה שונים נוצלו כדי ליצור טהור הפאג מבודד במינים Arthrobacter. נהלים מוקדמים כוללים incubations של אדמה עם סוכנים רעילים הוסיפו כמו מלחי ניקוטין לתקופות של למעלה משנת 8 עלייה נותנת לפאגים מסוגלים א מדביק רק globiformis. מחקרים שנעשו באמצעות אדמה חלחלו עם אורגניים יציב הופיע לייצר פאגים לזיהוי באמצעות טכניקות assay פלאק, השמטת תקופות דגירה ארוכה 8. מעניין אם כי, טכניקה הדומה ציפוי ישיר שימשה בעבר והוליד כמה פאגים בעוד שיש עדיין שיעור הצלחה נמוך במיוחד על-ידי החוקרים 5, בצטטו מחקרים האחרונים עם אחוזי הצלחה נמוכות <sעד&gt; 8. בסך הכל, טכניקות הבידוד שימשו בעבר היו ראויות לציון על כך שיעילות קטנה בפועל למרות סוג Arthrobacter המייצג את האדמה האירובית השכיחה ביותר לבודד בטבע 4,9,, ואן Twest וKropinski 10 שיטות העשרה הנוכחיות לבידוד פאגים ממים ואדמה מותאם מטכניקות קודם לכן משמשות להעשרה מבודדת חיידקים סביבתיים, אלא טכניקות העשרה אלה הוכיחו יעילים בבידוד פאגים Arthrobacter. מטרת השיטה המתוארת כאן היא להראות &quot;הוכחה של מושג&quot; שניתן להתאים את שיטות ההעשרה המוקדמות בעקביות וביעילות כדי לבודד פאגים Arthrobacter, להתגבר על אתגרים טכניים קודמים הקשורים לבידוד פאגים מסוג חיידקים זה.

<table><tbody><tr><td>אבקת מרק LB</td><td>פישר</td><td>BP9722-2</td><td>עדיף להזמין אותם בכמויות גדולות.</td></tr><tr><td>אגר פישר מגורען</td><td></td><td>BP1423-2</td><td>עדיף להזמין אותם בכמויות גדולות.</td></tr><tr><td>מסנני מזרק 0.22 אום</td><td>פישר</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>0.22 מסנני בוכנר אום</td><td>פישר</td><td>430320</td><td>ניתן להשיג יותר מ-50 מ"ל נוזל על ידי החלפה בזהירות של צינור הקבלה.</td></tr><tr><td>צינורות אפנדורף</td><td>פישר</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפטים בודדים</td><td>פישר</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>פישר</td><td>76002844</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>פישר</td><td>76002845</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטים בודדים</td><td>פישר</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל פיפטים בודדים</td><td>פישר</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון איכותי של ווטמן</td><td>פישר</td><td>1001-824</td><td></td></tr></tbody></table>

טכניקת העשרה אופטימלית עבור הבידוד של<em&gt; arthrobacter</em&gt; bacteriophage מינים מדגימת הקרקע מבודדת

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

בידוד בקטריופאג'ים מדגימות סביבתיות מבוצע במשך עשרות שנים תוך שימוש בעקרונות שנקבעו על ידי חלוצים במיקרוביולוגיה. הבידוד של פאג'ים המדביקים מארחי Arthrobacter היה מוגבל, אולי בשל שיעור ההצלחה הנמוך של טכניקות בידוד קודמות רבות, וכתוצאה מכך קבוצה לא מיוצגת של פאג'ים Arthrobacter זמינה למחקר. טכניקת ההעשרה המתוארת כאן, בניגוד לרבים אחרים, משתמשת בתמצית מסוננת ללא חיידקים מזהמים כבסיס לצמיחת חיידקי אינדיקטורים, Arthrobactersp. KY3901, באופן ספציפי. על ידי הסרת חיידקי הקרקע הראשונים, פאג'י המטרה אינם מונעים על ידי תחרות עם חיידקי קרקע מקומיים הנמצאים בדגימות קרקע ראשוניות. שיטת העשרה זו הביאה לעשרות פאג'ים ייחודיים מכמה סוגי קרקע שונים ואף ייצרה סוגים שונים של פאג'ים מאותו מבודד דגימת קרקע מועשר. ניתן להרחיב את השימוש בהליך זה לרוב המדיה האירובית העשירה בחומרים מזינים לבידוד פאג'ים במגוון עצום של חיידקים מארחים מעניינים.

כדי להדגים שחזור של טכניקת ההעשרה משופרת לפאגים Arthrobacter, 30 דגימות קרקע שונות שמשו בזמנים ובמקומות שונים באביב ובקיץ של שנת 2014 של דגימות קרקע 30 אלה פאגים Arthrobacter ייחודיים התקבלו משל 22 דגימות קרקע שנאספו באמצעות העשרה זו הליך. הליך ההעשרה הסטנדרטי הניב פאגים ייחודיים משל 3 אותו דגימות הקרקע. דגימות ההעשרה יכולה להיות כייל הפאג גבוה מאוד הזקוק לדילול ראשוני לבודד את לוחות או כייל הפאג נמוך יחסית הדורש נפח גדול יותר של Arthrobacter מועשר לזיהו...

אנו מציגים פרוטוקול העשרה לבידוד בקטריופאג'ים המדביקים חיידקים בסוג Arthrobacter. פרוטוקול העשרה זה מייצר תוצאות מהירות וניתנות לשחזור עבור בידוד והגברה של פאג'ים Arthrobacter מבודדי קרקע.

טכניקת העשרה אופטימלית עבור הבידוד של<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bacteriophage מינים מדגימת הקרקע מבודדת

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד פאגים של חיידקי arthrobacter מדגימות קרקע באמצעות פרוטוקול העשרה. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף דגימות קרקע ובידוד חלקיקי פאגים חיוניים ממיקרואורגניזמים מזוהמים בקרקע. השלב השני הוא הדבקת תאי חיידקי arthrobacter מאכסן עם חלקיקי הפאגים המבודדים.בשלב הבא, תאים בקטריאליים מזוהמים נזרעים על צלחות אגר כדי לזהות פאג'ים, כפי שבא לידי ביטוי ביצירת פלאקים. השלב הסופי הוא טיהור הפאג'ים הרצויים מפלאקים מבודדים בבירור באמצעות שיטת זריעה במריחה. בסופו של דבר, טכניקת העשרה זו מותאמת לבידוד קל יחסית של פאג'ים של arthrobacter ממין arthrobacter KY 3 9 0 1.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות העשרה קיימות הוא הוספת דגימת קרקע שעברה סינון עדין לתרבית טהורה של חיידקי המאחסן, כדי למנוע צמיחה של חיידקים מתחרים. אף ששיטה זו הוכחה כיעילה לבידוד של פאג'ים של arthrobacter, היא אמורה להיות ישימה לבידוד של פאג'ים מחיידקי מאחסן אחרים. הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר למדנו שחוקרים אחרים נתקלים בקושי במציאת פאג'ים של arthrobacter.בעזרת טכניקות העשרה מסורתיות, תלמידיי ידגימו את השיטות המשמשות לבידוד מוצלח של פאג'ים של arthrobacter. תאי arthrobacter גודליםB מקולוניות שנמרחו על צלחת LB auger, המודגסות בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים עד שלושה ימים.השתמש בלולאה סטרילית כדי לבודד מו

an-optimized-enrichment-technique-for-isolation-arthrobacter

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

מקור: ווטסון, די.סי., et.al. בידוד וטיהור ניתנים להרחבה של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את הבידוד והריכוז של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שמקורן בקרום החיצוני של חיידקים מהונדסים גנטית. התהליך כולל גידול החיידקים לשחרור EVs, ואחריו צנטריפוגה עוקבת ושלבי סינון להסרת תאים ופסולת. לבסוף, אולטרה-סינון משמש לריכוז הרכבים החשמליים לניתוח במורד הזרם.

בידוד והעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בקרום החיצוני מחיידקים

מקור: Cross, T., ואחרים, טכניקת העשרה אופטימלית לבידוד מיני חיידקי ארתרובקטר מבודדי דגימות קרקע. J. Vis. Exp.(2015)הסרטון הזה מדגים את הכנת תרבית חיידקים לייצור חיידקים. הוא עוסק בשלבים של חיסון חיידק קרקע לתוך בקבוק מכוסה, קידום צמיחה אחידה באמצעות אוורור וניעור, ומעקב אחר צפיפות התאים באמצעות מדידות צפיפות אופטית. כאשר התרבית מגיעה לשלב הצמיחה האופטימלי, היא מוכנה לייצור בקטריופאג' יעיל.

הכנת תרבית חיידקים בקרקע לזיהום בקטריופאג'

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp.(2015)This video demonstrates the isolation of bacteriophages from a soil sample. A soil sample is collected and suspended in a phage buffer and allowed to settle the sediment. The extract is filtered, and nutrients are added. A vacuum filtration is done to remove microbial contaminants. The filtrate with phages is aliquoted into flasks, and...

Isolation of Bacteriophages from a Soil Sample

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the isolation of Arthrobacter bacteriophages from a soil sample using enrichment and plaque assay techniques. It highlights the infection, amplification, and visualization of phages as clear lysis zones formed on a bacterial lawn.

Isolation of Arthrobacter Bacteriophages from a Soil Sample

פותחה שיטת מיצוי DNA היברידית אוטומטית למחצה לשימוש עם דגימות ייצור עופות סביבתיות והדגימה שיפורים על פני שיטת מיצוי מכנית ואנזימטית נפוצה מבחינת ההערכות הכמותיות והאיכותיות של כלל קהילות החיידקים.

הפקת DNA שיטה היברידית להערכה איכותית וכמותית של הקהילות בקטריאלי מדוגמאות ייצור עופות

חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

מושבות פטרייתיות אנטומופתוגניות מבודדות מדגימות קרקע טרופיות באמצעות פיתיון טנבריו , פיתיון גלריה , כמו גם מדיום מלאכותי סלקטיבי, כלומר, אגר דקסטרוז תפוחי אדמה מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלוראמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד (מדיום CTC).

השוואה בין שיטות לבידוד פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע

הבידוד של מיקרובים עמידים למתכות כבדות ממעיינות גיאותרמיים הוא נושא חם לפיתוח מערכות ביולוגיות וניטור סביבתי. מחקר זה מספק גישה מתודולוגית לבידוד וזיהוי של חיידקים עמידים למתכות כבדות ממעיינות חמים.

ביו-פרוספקציה של מיקרואורגניזמים אקסטרמופיליים לטיפול בזיהום סביבתי

כאן, אנו מציגים טכניקה פשוטה להערכת עמידות אנטי-מיקרוביאלית סביבתית (AMR) על-ידי שיפור שיעור הדנ"א החוץ תאי בעל משקל מולקולרי נמוך. טיפול קודם עם 20%-30% PEG ו-1.2 M NaCl מאפשר זיהוי של גנים AMR גנומיים ואופקיים. הפרוטוקול משאיל את עצמו לתהליך ללא ערכה עם אופטימיזציה נוספת.

מיצוי משופר של DNA במשקל מולקולרי נמוך משפכים להערכה מקיפה של עמידות מיקרוביאלית 

כאן, אנו מתארים שיטות דגימה מהאזורים האופוטיים של מערכות אקולוגיות ימיות ומים מתוקים כדי לבודד ציאנופגים (והמארחים שלהם) ותהליכים שלאחר הדגימה המעשירים גנוטיפים בודדים ומאפיינים את דינמיקת האינטראקציה בין וירוס למארח.

דגימה סביבתית של מיקרובים פוטוסינתטיים ווירוסיהם: מהשדה למעבדה

למד פרוטוקול העשרה לבידוד בקטריופאג'ים של Arthrobacter מדגימות קרקע. השיטה מאפשרת בידוד מהיר ושחזור של פאג'ים לחקר מיקרוביולוגיה ווירולוגיה.

טכניקת העשרה אופטימלית עבור הבידוד של

גלה סרטונים נוספים