טכניקת העשרה אופטימלית עבור הבידוד של Arthrobacter Bacteriophage מינים מדגימת הקרקע מבודדת

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד שלבי חיידקי ארתרובקטר מדגימות קרקע באמצעות פרוטוקול העשרה. זה מושג תחילה על ידי איסוף דגימות קרקע ובידוד חלקיקי פאג'ים ברי קיימא ממיקרואורגניזמים מזהמים באדמה. השלב השני הוא להדביק את תאי חיידקי הארתרובקטר המארח בחלקיקי הפאג'ים המבודדים.

לאחר מכן, תאי חיידקים נגועים מצופים על לוחות מקדחים כדי לזהות פאג'ים כפי שמעידים היווצרות פלאק. השלב האחרון הוא טיהור הפאג'ים הרצויים מפלאקים מבודדים בבירור בשיטת צלחת הפסים. בסופו של דבר, טכניקת העשרה זו מותאמת לבידוד קל יחסית של פאג'ים ארתרובקטרים ממיני ארתרובקטר KY 3 9 0 1.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות העשרה קיימות הוא הוספת דגימת קרקע מסוננת דק לתרבית טהורה של חיידקים פונדקאים כדי למנוע צמיחה של חיידקים מתחרים. למרות ששיטה זו הוכחה כיעילה לבידוד של פאג'ים ארתרובקטר, היא צריכה להיות ישימה לבידוד של פאג'ים ממארחי חיידקים אחרים. הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשגילינו שחוקרים אחרים מתקשים למצוא פאג'ים ארתרובקטרים.

בטכניקות העשרה מסורתיות. התלמידים שלי ידגימו את הטכניקות המשמשות לבידוד מוצלח של פאג'ים ארתרובקטר. תאי Arthrobacter מתורבתים ממושבות מפוספסות על צלחת מקדחה LB, מודגרות ב-30 מעלות צלזיוס למשך יומיים-שלושה.

השתמש בלולאה סטרילית כדי לבחור מושבה ולהוסיף אותה ל -50 מיליליטר מרק פאונד. בתרבית מבולבלת, בקבוק דוגר על הבקבוק באינקובטור רועד ב-225 סל"ד ב-30 מעלות צלזיוס למשך כ-24 שעות. להשיג תאי פאזה אקספוננציאלית או נייחים מוקדמים לניסויי זיהום פאג'ים.

עקוב מקרוב אחר מצב צמיחת החיידקים כדי למנוע כניסת תאים לצמיחה נייחת אמצעית עד מאוחרת. מצב. ה-OD 600 האידיאלי לבידוד פאג'ים הוא בין 0.5 ל-0.7. מאחר שחיידקים בסוג arthrobacter הם חיידקי אדמה נפוצים, הם והפאג'ים שמדביקים אותם יכולים להימצא ברוב סוגי האדמה.

אוספים 200 עד 400 גרם אדמה מהמיקום הרצוי. הוסף לפחות 400 מיליליטר של מאגר פאג'ים לאדמה בכוסות גדולות מספיק כך שלפחות 200 מיליליטר של מאגר פאג'ים יהיו בסופרנטנט וניתן לחלץ אותם מעורבבים על ידי ערבוב עדין או מערבולת עד שהאדמה תלויה ומאפשרים למשקעי האדמה להתיישב בדרך כלל למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסר פסולת משקעי קרקע על ידי העברת תמצית האדמה דרך נייר סינון על ידי סינון ואקום.

מוסיפים ארבעה גרם אבקת LB ל-200 מיליליטר מתמצית האדמה המסוננת ומערבבים ליצירת תמיסה של 2%. העבירו את התמיסה דרך מסנן 0.22 מיקרון על ידי סינון ואקום לקבלת תסנין סטרילי. במידת האפשר, המשך מיד לשלב הבא.

עם זאת, במידת הצורך, ניתן לאחסן את הדגימות המסוננות בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע לפני שתמשיך. עם זאת, מספר חלקיקי הפאג'ים הברי קיימא יופחת באמצעות טכניקות ספיגה המכילות חלקים מרובים של 50 מיליליטר מתערובת תמצית האדמה המעוקרת של המסנן ל-250 מיליליטר בודדים. צלוחיות תרבית מעוקרות ומבולבלות מוסיפות תמיסת סידן כלוריד סטרילית 2.0 מולרית לריכוזים הרצויים הסופיים.

מכיוון שפאג'ים שונים של ארתרובקטר גדלים בצורה אופטימלית בתנאי סידן כלוריד שונים, התחל בהליך זה על ידי הוספת אחד עד 2.5 מיליליטר של תרבית חיידקים מאוחרת אקספוננציאלית או נייחת מוקדמת לכל אחת מהצלוחיות המכילות תערובת תמצית אדמה מעוקרת LB מסננת. אם ה- OD 600 של התרבות הוא 0.5 עד 0.7, השתמש במיליליטר אחד. אם ה-OD 600 גבוה מ-0.7, השתמש ב-2.5 מיליליטר.

יש לנער את הצלוחיות ב-250 סל"ד ב-30 מעלות צלזיוס למשך כ-24 שעות באינקובטור רועד. לאחר תקופת הדגירה של 24 שעות, הסר את צלוחיות ההעשרה מהחממה הרועדת. לדלל את דגימות ההעשרה פי עשרה במאגר פאג'ים.

הגדר צינורות תרבית עם 0.5 מיליליטר של אקספוננציאלי מאוחר או נייח מוקדם. תרבית חיידקים פאזה. הוסף כמויות שונות מחמישה מיקרוליטר ל -500 מיקרוליטר של תרבית ההעשרה המדוללת לצינורות התרבות.

הוסף סידן כלורי לצינורות התרבות כדי ליצור ריכוז סופי בחמישה מיליליטר השווה לריכוז הקיים בבקבוק ההעשרה המקורי. השתמש במגוון של ריכוזים שונים של סידן כלורי כדי לבחור עבור פאג'ים רבים עם תלות משתנה בסידן כלורי. הוסף 4.5 מיליליטר מקדחה עליונה LB לכל צינור תרבית, ושפך את התערובת על צלחת מקדחה LB.

מערבבים בעדינות כדי לפזר באופן שווה על פני הצלחת ומאפשרים למקדחה העליונה להתמצק למשך כ-15 דקות. הופכים את הצלחות ודוגרים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה עד 48 שעות. שנה את זמני הדגירה כדי לייעל את הפאג'ים הקיימים לאחר בדיקת דגירה של 24 שעות להיווצרות פלאק על הצלחות.

רוב הפאג'ים המבודדים מגיעים מצלחות שהודגרו ב-30 מעלות צלזיוס בריכוז סידן כלורי של 1 עד 2.5 מילי-מולרי לאחר תקופת דגירה של 24 שעות, טיהור פאג'ים רצויים מפלאקים מבודדים בבירור באמצעות מקל עץ כחלק המאתגר ביותר בהליך זה. נדרשת מומחיות טכנית כדי לפזר בעדינות את הפלאק על פני לוחית המקדחה כדי לייצר לוחית פס אחידה. עקרו מקל עץ על ידי העברתו דרך להבה ואפשרו לו להתקרר.

גע בקצרה בלוח עם מקל העץ הסטרילי ושפשף את המקל על צלחת המקדחה בתנועה עדינה כפי שמוצג. חזור על פעולה זו באמצעות מקל נקי לכל מעבר. לאחר שלוחית המקדחה LB מפוספסת לפחות שלוש פעמים, סמן את האזור עם הריכוז הנמוך ביותר של חלקיקי פאג'ים משוערים.

מרחו בעדינות 0.5 מיליליטר ארתרובקטר ו -4.5 מיליליטר מקדחה עליונה LB מותכת על האזור המסומן, ואפשרו לו להתפשט באופן שווה על פני הצלחת. הניחו למקדחה העליונה להתמצק לפחות שעה כאשר הצלחת התמצקה, היפוך ודגירה למשך הלילה. חזור על טכניקת רובד הפסים במשך שלוש חזרות לפחות כדי להבטיח בידוד של מין פאג'ים טהור.

ניתן לאחסן צלחות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שבוע לפי הצורך בין הפסים ללא אובדן משמעותי של כדאיות הפאג'ים. לאחר שהפלאק הרצוי גדל ובודד על צלחת הפס הסופית, גע בלוח אחד מבודד היטב עם קצה מיקרו פיפטה והשהה מחדש ב-100 מיקרוליטר של מאגר פאג'ים באופן סדרתי דלל את התמיסה הזו עד לדילול של 10 עד מינוס שמיני על ידי העברת 20 מיקרוליטר מהדגימה ל-180 מיקרוליטר של מאגר פאג'ים טרי. הוסף 10 מיקרוליטר מכל דילול ל -0.5 מיליליטר של ארתרובקטר גדל בצינור תרבית למשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן צלחת על ידי ערבוב החיידקים הנגועים עם 4.5 מיליליטר של מקדחה עליונה LB מותכת המכילה את אותו ריכוז של סידן כלורי המשמש לבידוד הפאג' מדגימת האדמה המקורית. דגרו את הצלחות למשך הלילה. שמור את כל הדילול שנעשה בארבע מעלות צלזיוס עד למחרת.

קבע את דילול דגני הפאג'ים הדרוש ליצירת דפוס רשת באמצעות בדיקת טיטר הפלאק המסורתית. זהה לוחית דפוס רשת כנטולת חיידקים ברובה אך מכילה שאריות של חיידקים שעדיין לא חוברו על ידי פאג'ים. הוסף חמישה מיליליטר של תרבית ארתרובקטר מאוחרת או נייחת מוקדמת לבקבוק תרבית סטרילי של 50 מיליליטר.

הוסיפו 100 מיקרוליטר מהדילול שנתן דפוס רשת לתרבית הארתרובקטר ואפשרו לפאג'ים להדביק את תאי החיידקים למשך חמש עד 10 דקות. בטמפרטורת החדר, הוסף למקדחה העליונה של הבקבוק המותך lb המכיל את אותו ריכוז של סידן כלורי המשמש לזיהוי ראשוני של צלחת הפאג'. חמישה מיליליטר מהתערובת הזו על כל אחת מ-10 צלחות LB טריות.

לאחר שאפשרתם למקדחה העליונה להתמצק, להפוך ולדגור את הלוחות ב-30 מעלות צלזיוס למשך הלילה למחרת, הציפו את לוחות דפוס הרשת בחמישה מיליליטר של מאגר פאג'ים לצלחת ואחסנו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. מסננים את הפאג'ים ליזאט דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרון. אחסן את מלאי הפאג'ים הסופי הזה בארבע מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.

הוסף כמות שווה של ליזאט הפאג'ים לגליצרול סטרילי בבקבוקונים קטנים לארכיון מלאי במינוס 80 מעלות צלזיוס בהליך ההעשרה המודגם בסרטון זה, שיטת פס הפלאק לבידוד אוכלוסיות פאג'ים טהורים לאחר העשרה ראשונית וציפוי על מקדחת LB המוצגת הן תוצאות מייצגות מבידוד פלאק לפאג DI בטמפרטורת החדר, 30 מעלות צלזיוס ו-37 מעלות צלזיוס. העיגולים האדומים על שניים מהלוחות מקיפים לוחות מבודדים בבירור. פאג' דילן מייצר פלאקים דומים בשלוש טמפרטורות שונות.

לחלופין, ניתן להשתמש בבדיקת טיטר רובד סטנדרטית מסורתית כדי לבודד פאג'ים מבודדים טהורים. בדיקה זו שימשה כאן כדי לקבוע באופן אמפירי את מספרי טיטר הפאג'ים ואת מספר היחידות היוצרות פלאק ליצירת תבנית רצועה על צלחת. קבוצה של דילול סדרתי עבור בננת פאג' מוצגת עם דוגמה לאיך דפוס אינטרנט טוב צריך להיראות.

אלו הן תמונות מיקרוגרפיות אלקטרוניות של 20 פאג'ים ארתרובקטרים שבודדו בטכניקת העשרה. מתוך 25 הפאג'ים המבודדים כיום, 23 מהם הם נגיפי cifo עם זנב ארוך למדי. שניים מהפאג'ים המבודדים הם נגיפי מיו המכילים קוטר ראש דומה באורכו לזה של זנבותיהם.

לאחר השליטה, ציפוי ההעשרה אמור לאפשר בידוד מוצלח של פאג'ים ארתרובקטרים ממגוון דגימות קרקע. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטהר את הפאג' משמש בשיטת צבע הפסים מדגימת אדמה סביבתית.