Name: אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: חקור אבלציה ספציפית של תאי כבד בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה. השיטה משתמשת בטיפול במטרונידזול בזחלים טרנסגניים ובדיקת גודל הכבד וסמנים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד"ר הוקרידה ולצאנג על הדיונים. מ.ק. נתמך על ידי מענק הכשרה של ה-NIH (T32EB001026). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מקרן הכבד האמריקאית, קרן מצעד הדימס (5-FY12-39) וה-NIH (DK101426) ל-D.S.

דג הזברה הועלתה וגדלה בהתאם לנוהל מקובל; ניסויים אושרו על ידי אוניברסיטת פיטסבורג מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה. 1. הכנת עוברים / זחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל הזדווגויות מתוזמן, זכר להגדיר מבוגר והנקבה Tg (fabp10a: CFP-NTR) O דגי hemizygous או הומוזיגוטים s931 / N ולמקם את מחיצה ביניהם. הסר מחיצה זו למחרת בבוקר כאשר ההזדווגות היא רצויה. איסוף עובר על ידי סינון המים באמצעות מסננת רשת פלסטיק דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המסננת הפוכה ולשטוף את משטח הרשת עם זרם עדין של מים ביצה לוותר מבקבוק לחיץ. העבר את 100 עוברים לצלחת פטרי 100 מ&quot;מ עם 25 מיליליטר של מים ביצה. לשמור על לא יותר מ -100 עובר לכל צלחת פטרי ולגדל אותם בגיל 28 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכב פיגמנטציה, להוסיף phenylthiourea (PTU) לתוך צלחות פטרי לפני 10 שעות לאחר ההפריה (hpf), ולהעלות את הדוארmbryos / זחלים עד 80 hpf. הריכוז הסופי של PTU הוא 0.2 מ&quot;מ. זהירות: PTU הוא רעיל. השתמש בבהתאם להנחיות טיפול מתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזחלים על ידי הוספת 3-אמינו אסתר benzoic אתיל החומצה (Tricaine), בריכוז סופי של 0.016%, לצלחות פטרי. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence, זחלי סוג CFP-חיוביים. השתמש זחלים עם גודל דומה כבד וזורקים אותם עם כבד קטן יותר או גדול יותר. הערה: כל זחלים CFP-חיובי, ללא קשר לעוצמת, ניתן להשתמש כי אין הבדל בין זחלי hemizygous והומוזיגוטים היקף אבלציה hepatocyte. זהירות: tricaine היא רעילה. השתמש בבהתאם להנחיות טיפול מתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המים ביצה המכילים Tricaine ולהוסיף מים ביצה בתוספת 0.2 מ&quot;מ PTU. שמור את העוברים / הזחלים ב 28 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. Mtz טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 10 מ&quot;מ Mtz טרי על ידי המסת .171 גרם של אבקת Mtz ב 1בתוספת מים ביצה 00 מיליליטר עם 0.2% מ&quot;מ PTU DMSO ו0.2. לפזר לגמרי Mtz, לערבב את הפתרון על RT עם ערבוב מהיר במשך 20-30 דקות. כדי לעזור solubilize Mtz וכדי לשפר את חלחול Mtz לזחלים, להוסיף DMSO בעת הכנת Mtz. זהירות: חשיפה ממושכת או ריכוז מוגבר של Mtz הוא רעילה. השתמש בבהתאם להנחיות טיפול מתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הזחלים לקבוצות שליטה והניסיון בהעברת מספר רצוי של זחלים לשני 100 שונים צלחת פטרי מ&quot;מ או צלחת רב גם. לקבוצת הניסוי, לשמור על הזחלים ב 10 מ&quot;מ פתרון Mtz; לקבוצת הביקורת, לשמור אותם במי ביצה המכילים 0.2% DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הצלחות או צלחות פטרי המכילות את פתרון Mtz בנייר אלומיניום כדי למנוע את צילום איון של Mtz, ולדגור על 28 מעלות צלזיוס. משך טיפול Mtz תלוי בשלב הזחל והקו המהונדס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתבונן אבלציה hepatocyte החמורה דומה ב <eמ &#39;&gt; Tg (fabp10a: CFP-NTR) קו, טיפול בזחלים עם פתרון Mtz משני 3.5 ימים לאחר ההפריה (DPF) (למשך 36 שעות) או מ -5 DPF (לתקופה של 24 שעות). </li></ol> 3. ניתוח של התחדשות כבד מונעת-מרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף תקופת אבלציה, להסיר את פתרון Mtz מהצלחות. שטוף את הזחלים שטופלו Mtz על ידי הוספת 25 מיליליטר של מים ביצה. מערבולת הצלחת 2-3 פעמים כדי לשטוף את הזחלים לפני השלכת המים הביצה. חזור שלוש פעמים ולאחר מכן לטבול את הזחלים פעם נוספת במי ביצה. כדי להימנע מבצקת לב ומות זחל בזחלים שטופלו Mtz, להוסיף ריכוז נמוך יותר של Tricaine, בריכוז סופי של 0.008%, כדי לשתק את הזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח בכבד, לבחון את הגודל הכבד של הזחלים שטופלו Mtz תחת מיקרוסקופ epifluorescence עם מסנן CFP. להעריך רמות אבלציה hepatocyte בהתבסס על הגודל הכבד יחסית: גדולים (לא מלוטשים; זחלי% 0-10), בינוני (ablated באופן חלקי; 10-20%), וקטנים מאוד (ablated באופן מלא; 80-90%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הזחלים עם כבדים שאינם ablated או ablated באופן חלקי. לשמור רק זחלים עם כבד זעיר, אשר מעיד על אבלציה hepatocyte החמורה. לניתוח בכבד בזמן שעות הנקודה (R0h) התחדשות 0, לקצור את הזחלים לאחר כישלון Mtz ומיון CFP. אחרת, לשמור על הזחלים מסודרים במי ביצה בתוספת 0.2 מ&quot;מ PTU עד מוכן לקציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הזחלים שנקטפו לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולהחליף מים ביצה עם פתרון הקיבעון של פורמלדהיד 3% במאגר PEM. דגירה הצינור על C ° O מסובבי / N ב 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את פתרון הקיבעון עם 1 מיליליטר של PBSDT ולסובב את הצינור המכיל את הזחלים על הכתף במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הזחלים הקבועים לצלחת פטרי 100 מ&quot;מ המכילים PBSDT ובאמצעות מלקחיים, להסיר באופן ידני סנפירי חלמון וחזה תחת מיקרוסקופ לנתח. העבר את TP 20 זחלים גזור לתוך צינור 1.5 מיליליטר. </li> &lt;li&gt; החלף פתרון PBSDT עם 1 מיליליטר של תמיסת חסימה ולטלטל את הצינור על הכתף ב RT עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף פתרון חסימה עם החסימה של תמיסה המכילה נוגדנים ראשוניים 100 μl. לאט רוק הצינור על C ° O מסובבי / N ב 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון הנוגדן הראשוני ולשטוף עם PBSDT 5 פעמים במשך 10 דקות בכל פעם. לאחר מכן להוסיף חסימת תמיסה המכילה נוגדנים משני ורוקו על הכתף ב RT עבור 2hr 100 ul. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5 פעמים עם PBSDT במשך 10 דקות בכל פעם ב RT על ידי נדנדה על הכתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוון את הזחלים רוחבי בשקופית מיקרוסקופ ולהוסיף טיפה של תקשורת הרכבה. לכסות בזהירות אותם עם מכסה זכוכית ולאטום את מכסה הזכוכית עם לטש מסמר. עכשיו, שהוא מוכן למיקרוסקופיה confocal. </li></ol>

<ol><li>Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroen+Hepatol%22%5BJournal%5D)">New concepts in liver regeneration.</a> J Gastroen Hepatol. 26, 203-212 (2011).</li>
<li>Fausto, N., Campbell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+hepatocytes+and+oval+cells+in+liver+regeneration+and+repopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation.</a> Mechanisms of Development. 120, 117-130 (2003).</li>
<li>Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+and+Liver+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Stem Cells and Liver Regeneration.</a> Gastroenterology. 137, 466-481 (2009).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+Alternative+epithelial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+B%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: Alternative epithelial pathways.</a> Int J Biochem Cell B. 43, 173-179 (2011).</li>
<li>Falkowski, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+hepatocyte+%27buds%27+in+cirrhosis+from+intrabiliary+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+hepatology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of hepatocyte 'buds' in cirrhosis from intrabiliary stem cells.</a> Journal of hepatology. 39, 357-364 (2003).</li>
<li>Yoon, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Cell+Adhesion+Molecule+%28EpCAM%29+Marks+Hepatocytes+Newly+Derived+from+Stem%2FProgenitor+Cells+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) Marks Hepatocytes Newly Derived from Stem/Progenitor Cells in Humans.</a> Hepatology. 53, 964-973 (2011).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> J Cell Physiol. 213, 286-300 (2007).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+Regeneration+after+Partial+Hepatectomy+Critical+Analysis+of+Mechanistic+Dilemmas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Liver Regeneration after Partial Hepatectomy Critical Analysis of Mechanistic Dilemmas.</a> Am J Pathol. 176, 2-13 (2010).</li>
<li>Yanger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+hepatocytes+are+generated+by+self-duplication+rather+than+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Adult hepatocytes are generated by self-duplication rather than stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 15, 340-349 (2014).</li>
<li>Schaub, J. R., Malato, Y., Gormond, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+against+a+Stem+Cell+Origin+of+New+Hepatocytes+in+a+Common+Mouse+Model+of+Chronic+Liver+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Evidence against a Stem Cell Origin of New Hepatocytes in a Common Mouse Model of Chronic Liver Injury.</a> Cell reports. 8, 933-939 (2014).</li>
<li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+alpha+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II alpha is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and cellular biology. 29, 3746-3753 (2009).</li>
<li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li>
<li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator%2C+uhrf1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator, uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li>
<li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-nitrosothiol+signaling+regulates+liver+development+and+improves+outcome+following+toxic+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">S-nitrosothiol signaling regulates liver development and improves outcome following toxic liver injury.</a> Cell reports. 6, 56-69 (2014).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGE2-regulated+wnt+signaling+and+N-acetylcysteine+are+synergistically+hepatoprotective+in+zebrafish+acetaminophen+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PGE2-regulated wnt signaling and N-acetylcysteine are synergistically hepatoprotective in zebrafish acetaminophen injury.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17315-17320 (2010).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+A+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236, 1025-1035 (2007).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li>
<li>Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+conversion+of+hepatic+biliary+epithelial+cells+to+hepatocytes+after+near+total+loss+of+hepatocytes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146, 776-788 (2014).</li>
<li>Huang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+interaction+between+Wnt+and+Notch+activity+modulates+the+regenerative+capacity+of+a+zebrafish+fibrotic+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model.</a> Hepatology. , (2014).</li>
<li>He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+liver+after+extreme+hepatocyte+loss+occurs+mainly+via+biliary+transdifferentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146, 789-800 (2014).</li>
<li>Sakaguchi, T. F., Sadler, K. C., Crosnier, C., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+signals+modulate+hepatocyte+apicobasal+polarization+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial signals modulate hepatocyte apicobasal polarization in zebrafish.</a> Curr Biol. 18, 1565-1571 (2008).</li>
<li>Ninov, N., Borius, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+Notch+signaling+regulate+quiescence%2C+renewal+and+differentiation+in+pancreatic+endocrine+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Different levels of Notch signaling regulate quiescence, renewal and differentiation in pancreatic endocrine progenitors.</a> Development. 139, 1557-1567 (2012).</li>
<li>Lorent, K., Moore, J. C., Siekmann, A. F., Lawson, N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reiterative+use+of+the+notch+signal+during+zebrafish+intrahepatic+biliary+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Reiterative use of the notch signal during zebrafish intrahepatic biliary development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 239, 855-864 (2010).</li>
<li>Itoh, T., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+Regeneration+by+Stem%2FProgenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver Regeneration by Stem/Progenitor Cells.</a> Hepatology. 59, 1617-1626 (2014).</li>
<li>Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+cell-specific+ablation+in+zebrafish+using+a+triple+mutant+of+Escherichia+coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase.</a> Zebrafish. 11, 85-97 (2014).</li>
<li>Stueck, A. E., Wanless, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+cirrhosis%3A+The+maturation+sequence+of+buds+arising+from+hepatocyte+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Regression of cirrhosis: The maturation sequence of buds arising from hepatocyte progenitor cells.</a> Hepatology. 58, 235A(2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

חמור, אבל לא קל, אבלציה hepatocyte מעוררת התחדשות כבד מונע מרה. לכן, לאחר טיפול Mtz וכישלון, חשוב לבחון את הגודל הכבד של הזחלים שטופלו Mtz, אשר ניתן להעריך על ידי הקרינה CFP מהותית מfabp10a: transgene CFP-NTR. מאז אחוז קטן של הזחלים שטופלו Mtz יציג הלא ablated (0-5%) או באופן חלקי ablated כבדים (10-20%), הוא חיוני כדי למיין את ורק לנתח את הזחלים עם כבד קטן מאוד, ש מעיד על אבלציה hepatocyte החמורה. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl...

הכבד הוא איבר משובי מאוד. במהלך התחדשות כבד, התחדשות hepatocytes, תאי parenchymal של הכבד, נגזרים מhepatocytes קיים מראש (התחדשות כבד מונע hepatocyte) או BECs (התחדשות כבד מונע מרה) 1,2. פגיעה בכבד בדרך כלל מעוררת את ההתפשטות של hepatocytes קיים מראש; עם זאת, כאשר התפשטות hepatocyte נפגעת, BECs יכולה לתרום לhepatocytes 2-4. שני מצבים אלה של התחדשות כבד הם משמעותיים מבחינה קלינית. לאחר ההסרה כירורגית של חלק מהכבד האנושי (למשל, בגלל גידולים בכבדים או תורמים כבד חיים), hepatocytes בכבד שנותר להתרבות כדי לשחזר את מסת כבד לאיבוד. לעומת זאת, בחולים עם מחלות כבד חמורות, התפשטות hepatocyte נפגעת מאוד, כך שBECs או תאי כבד (LPCs) מופיעות לתרום לhepatocytes התחדשות 5,6. מודל כריתה החלקי המכרסמים 2/3, שבhepatocytes להתרבות כדי לשחזר את המסה הכבד איבדה, תרם באופן משמעותי להבנה הנוכחית של התחדשות כבד מונע hepatocyte 7,8. עם זאת, אין מודל מכרסם בתוקף שבhepatocytes התחדשות נגזרים בעיקר מBECs. למרות שכמה דגמי רעלן כבד מכרסמים הובילו לזיהוי של התחדשות כבד מונע מרה 2-4, מחקרי שושלת ההתחקות אחרונים בעכברים מצביעים תרומה מינימאלית של BECs להתחדשות hepatocytes במודלים אלה 9,10. חלק מדגמי הפגיעה בכבד מכרסמים, כולל כריתה חלקית 11-13 ונזק כבד נגרם פרצטמול 14,15, יושמו לדג זברה והוביל לזיהוי של גנים חדשים או מסלולים מעורבים בהתחדשות כבד. עם זאת, המונע על ידי hepatocyte, אבל לא מונע-BEC, התחדשות כבד מתרחשת בדגמי פגיעה בכבד דג הזברה אלה. לכן, מודל פגיעה בכבד רומן שבי BECs הרחבה לתרום לregenerating hepatocytes נחוץ להבנה טובה יותר של התחדשות כבד מונעת-BEC. מטרות העל של מודל אבלציה hepatocyte מתואר כאן (1) כדי ליצור מודל פגיעה בכבד שבי BECs נרחבת תורם להתחדשות תאים כבדות, ו- (2) להבהיר את המנגנונים המולקולריים ותאיים שבבסיס התחדשות כבד מונעת-BEC. חוקרים שערנו כי חומרת פגיעה קובעת את המצב של התחדשות כבד; כך, אנו חוזים כי התחדשות כבד מונע מרה תיזום על פציעת hepatocyte חמורה. כדי לבדוק השערה זו, פיתחנו מודל פגיעה בכבד דג הזברה על ידי יצירת קו מהונדס, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, שמאוד מבטא Nitroreductase חיידקים (NTR) התמזגה עם חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) תחת fabp10a hepatocyte הספציפי אמרגן. מאז NTR ממיר את prodrug אינה רעילה, metronidazole (Mtz), לתרופה רעילה לתאים, זה ablates רק נועד NTR-לבטא בתאים 16-18, במקרה זה, hepatocytes. על ידי מניפולציה של משך טיפול Mtz, היקף אבלציה hepatocyte יכול להיות נשלט. שימוש במודל זה, שדיווחנו לאחרונה כי על אובדן hepatocyte חמור, BECs הרחבה להצמיח hepatocytes התחדשות 19, אשר אושר עוד יותר על ידי שני מחקרים עצמאיים אחרים 20,21. לכן, בהשוואה למכרסמים האמורים ודגמי פגיעה בכבד דג הזברה, מודל אבלציה hepatocyte שלנו הוא יתרון נוסף ללימוד התחדשות כבד מונעת-BEC. פרוטוקול זה מתאר את ההליך לביצוע ניסויי התחדשות כבד באמצעות מודל אבלציה hepatocyte דג הזברה. מודל זה יהיה מתאים לקביעת מנגנוני התחדשות כבד מונע מרה ולמסכים כימיים לזהות מולקולות קטנות שיכול להדחיק או להגדיל את ההתחדשות כבד.

<table><tbody><tr><td>3-אמינו חומצה בנזואית אבקת אתיל אסטר (טריקאין)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>הכינו 0.4% (15 מ"מ) מלאי טריקאין: הביאו 0.4 גרם טריקאין ל-100 מ"ל עם מי ביצים. התאם ל-pH 7.&nbsp;</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' D8418</td><td></td></tr><tr><td>מטרונידזול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M1547</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>סידן גופרתי דיהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C3771</td><td></td></tr><tr><td>N-פנילתיאוריאה (PTU)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>מדיית הרכבה (Vectashield)</td><td>מעבדות וקטור</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 100 x 15 מ"מ&nbsp;</td><td>דנוויל סיינטיפיק בע"מ</td><td>לק שקוף M5300</td><td></td></tr><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50949071</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Dumont #5&nbsp;</td></tr><tr><td>שקופית זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-540-A ו-12-542-A</td><td>18 x 18 מ"מ</td></tr><tr><td>zn-5 (עכבר אנטי-אלקאם)</td> <td>ZIRC</td><td>zn-5</td><td>1:10 דילול</td></tr><tr><td>עז אנטי-Hnf4a</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-6556 (C-19)</td><td>1:50 דילול</td></tr><tr><td>חולדה אנטי-RFP</td><td>אלל ביוטכנולוגיה</td><td>ACT-CM-MRRFP10</td><td>1:300 דילול</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L)</td><td>Jackson laboratories</td><td>705-605-147</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21240</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>Cy3 חמור נגד חולדות IgG</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>712-165-150</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205FA</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>מי</td><td></td><td></td> ביצים <td>0.3 גרם/ליטר מלחי ים ' אינסטנט אוקיינוס' ו-0.5 מ"מ CaSO<תת>4 </תת>במים מזוקקים. 
&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td></td><td></td><td>25.6 גרם Na2HPO4&middot; 7H2O, 80 גרם NaCl, 2 גרם KCl, 2 גרם KH2PO4.&nbsp; מביאים ל-1 ליטר עם מים מזוקקים.&nbsp; התאם את ה-pH 7.&nbsp; חיטוי למשך 20 דקות ב-121 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>1X PBSDT</td><td></td><td></td><td>0.2% Triton X-100 ו-0.2% DMSO ב-1 X PBS.</td></tr><tr><td>חוצץ</td><td></td><td></td> PEM <td>30.2 גרם צנרת, 761 מ"ג EGTA, 1 מ"מ MgSO4.&nbsp; מביאים ל-1 ליטר עם מים מזוקקים.&nbsp; התאם את ה-pH 7.</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> חסימה: <td>יש לערבב 1 מ"ל של סרום סוס מומת בחום עם 9 מ"ל של 1X PBSDT.</td></tr></tbody></table>

אבלציה hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

יש כבד קיבולת גדולה להתחדש. Hepatocytes, תאי parenchymal של הכבד, יכול להתחדש באחת משתי דרכים: התחדשות כבד hepatocyte- או מונע מרה. בהתחדשות כבד מונע hepatocyte, hepatocytes התחדשות נגזרים מhepatocytes preexisting, ואילו, בהתחדשות מונעת מרה, hepatocytes התחדשות נגזרים מתאי אפיתל מרה (BECs). להתחדשות כבד מונע hepatocyte, יש מודלים של מכרסמים מצוינים שתרמו באופן משמעותי להבנה הנוכחית של התחדשות כבד. עם זאת, אין מודל מכרסם כזה קיים להתחדשות כבד מונע מרה. אנחנו דיווחו לאחרונה על מודל פגיעה בכבד דג הזברה שבBECs הרחבה להצמיח hepatocytes על אובדן hepatocyte חמור. במודל זה, hepatocytes הם ablated במיוחד על ידי אמצעי pharmacogenetic. כאן אנו מציגים בפירוט את השיטות ללקטוע hepatocytes ולנתח את תהליך ההתחדשות הכבד מונע-BEC.מודל אבלציה hepatocyte ספציפי זה יכול לשמש נוסף כדי לגלות את המנגנונים מולקולריים ותאיים הבסיסיים של התחדשות כבד מונע מרה. יתר על כן, יכול להיות מיושמות בשיטות אלה למסכים כימיים לזהות מולקולות קטנות שלהגדיל או לדכא התחדשות כבד.

טיפול Mtz במשך 36 שעות (A36h, עומד לאבלציה) מגודל כבד 3.5 עד 5 DPF מופחת באופן דרמטי (איור 1). לאחר כישלון Mtz, נחשב כתחילת התחדשות כבד (R), fabp10a החזק: CFP-NTR וfabp10a: ביטוי dsRed הופיע בתוך 30 שעות (איור 1). רשת המרה intrahepatic, כפי שהוערך על ידי ביטוי של Alcam שנמצא בקרום של 22 BECs, תחילה התמוטט אך הוקם מחדש על 54 פוסט-סחף שעה (R54h) (איור 1 ג). נתונים אלה מצביעים על כך שהתחדשות כבד והתאוששות...

כדי לעזור להעריך את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התחדשות הכבד המונעת על ידי דג הזברה, הקמנו מודל פגיעה בכבד שבו הפטוציטים המבטאים ניטרורודוקטאז מבוטלים גנטית בטיפול במטרונידזול. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לתמרן במיומנות, לנטר ולנתח אבלציה של הפטוציטים והתחדשות כבד מונעת מרה.

אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשרות אבלציה של תאי כבד (hepatocytes) בדגי zebrafish לצורך ניתוח של התחדשות כבד המונעת על ידי מערכת המרה. דבר זה מושג תחילה על ידי חשיפת זחלים טרנסגניים המבטאים ניטרו-רדוקטאז בתאי הכבד שלהם למטרונידזול או MTZ. בשלב השני, רמת האבלציה של תאי הכבד מוערכת על סמך הגודל היחסי של הכבד.לאחר טיפול ב-MTZ בשלב הסופי, נאספות זחלים שבהם הושמד הכבד באמצעות bully, כאשר הכבד קטן מאוד. לבסוף, נמדדים גודל הכבד והביטוי של סממני כבד בכבד המתחדש באמצעות פלואורסצנציה אפיסקופית ומיקרוסקופיה קונפוקלית, בהתאמה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מודלים של הפעלת תאי אובל במכרסמים, הוא שבטכניקה זו, ההפטוציטים הרגנרטיביים נגזרים בעיקר מתאי אפיתל של דרכי המרה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום התחדשות הכבד, כגון כיצד תאים פרוגניטוריים של דרכי המרה או של הכבד תורמים להתחדשות הכבד. באופן כללי, מי שאינו מיומן בשיטה זו עשוי להתקשות, מכיוון שגודל הכבד בזחלים שבהם בוצע השמד והתחדשות הוא משתנה.לביצוע הזיווגים מתוזמנים, הניחו דגים בוגרים, זכרים ונקבות, המהמיזיגוטים או הומוזיגוטים, למשך לילה עם מחיצה ביניהם. הסירו את המחיצה בבוקר למחרת כאשר מעוניינים בהזיווג; השתמשו במסננת רשת פלסטית דקה לאסוף את העוברים, הפכו את המסננת והשתמשו בבקבוק לחיצה כדי לשטוף את פני השטח של הרשת בזרם דק של מי ביצים. לאחר מכן, העבירו עד 100 עוברים לצלחת פטרי בקוטר 100 millimeter המכילה 25 milliliters של מי ביצים, והניחו את הצלחת בטמפרטורה של 28 degrees Celsius כדי לעכב את הפיגמנטציה.הוסיפו PTU לתרבית למשך עד 10 שעות. לאחר הפרייה בגיל 80 שעות, לאחר תהליך הפרסונליזציה, הרדימו את הזחלים באמצעות trica והשתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנציה אפיפוסקופית כדי לאסוף את הזחלים החיוביים ל-CFP, תוך שמירה על בעלי חיים עם כבד בגודל דומה בלבד.לאחר מכן, החליפו את מי הביצים של ה-trica במי ביצים טריים המועשרים ב-PTU והחזירו את זחלי דגי הזברה החיוביים ל-CFP לדגירה בטמפרטורה של 28 degrees Celsius. כדי לטפל בזחלי דגי הזברה ב-MTZ, חלקו תחילה את מספר הזחלים המתאים לשני כלי תרבית שונים. השאירו את קבוצת הזחלים הניסויית בתמיסה של MTZ שהוכנה טרי, ואת קבוצת הביקורת במי ביצים.מועשר ב-DMSO. כסו את קבוצת הניסוי בנייר אלומיניום כדי למנוע אינאקטיבציה פוטוכימית של ה-MTZ, והדגירו את שתי קבוצות הזריקות של הזבובים בטמפרטורה של 28 °C בסיום תקופת האבלציה. הסירו את תמיסת ה-MTZ מהצלחות ושטפו את הזריקות שטופלו ב-MTZ פעמיים עד שלוש פעמים עם 25 milliliters של מי ביצים, תוך סיבוב והשלכת מי הביצים לאחר כל שטיפה.לאחר השטיפה האחרונה, קבע את הזחלים באמצעות מחצית מהריכוז של trica שנעשה בו שימוש קודם לכן, כדי למנוע בצקת בלב ומוות בזחלים שטופלו ב-MTZ. לאחר מכן, השתמש במסנן CFP במיקרוסקופ פלואורסצנציית epi כדי להעריך את רמות האבלציה של ההפטוציטים על בסיס גודל הכבד היחסי של הזחלים שטופלו ב-MTZ. דגי zebrafish עם כבד גדול המייצג 0% עד 5% מהזחלים ייחשבו ככאלה שלא עברו אבלציה.אלו עם כבדים בגודל בינוני, המהווים 10 עד 20% מהזחלים, ייחשבו כבעלי אבלציה חלקית, ואלו עם כבדים קטנים מאוד, המהווים 80 עד 90% מהזחלים, ייחשבו כבעלי אבלציה מלאה. לאחר סיווג כל בעלי החיים, זהו את הזחלים עם כבדים שלא עברו אבלציה או שעברו אבלציה חלקית, ושמור רק את דגי הזברה עם כבדים זעירים המעידים על אבלציה חמורה של התאי הכבדיים לצורך ניתוח הכבד. בנקודת הזמן של שעת אפס של הרגנרציה, העבר את הזחלים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter.מיד לאחר שטיפת ה-MTZ והסרת ה-CFP, החליפו את מי הביצים בבופר MPEM עם 3% formaldehyde לצורך קיבוע למשך לילה ברוטור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, החליפו את תמיסת הקיבוע במיליליטר אחד של P-B-S-D-T וסובבו את הלרוות למשך חמש דקות נוספות. לאחר מכן, העבירו את כל הלרוות המקובעות לצלחית פטרי של 100 מילימטר המכילה P-B-S-D-T טרי תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, והשתמשו בפינצטה כדי להסיר ידנית את החלמון והסנפירים החזיים לאחר שכל הלרוות נגזרו.העבירו עד 20 בעלי חיים למבחנה של 1.5 מיליליטר והחליפו את ה-P-B-S-D-T במיליליטר אחד של תמיסת חסימה. לאחר שעתיים על רטטור בטמפרטורת החדר, החליפו את תמיסת החסימה ב-100 מיקרוליטר של תערובת הנוגדנים הראשוניים להדגרה לילה שלם ב-4 מעלות צלזיוס. למחרת, תוך כדי נדנוד, הסירו את תמיסת הנוגדנים הראשוניים ושטפו את דגי הזברה ב-P-B-S-D-T בחמישה סבבי שטיפה של 10 דקות כל אחד.לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 100 µL מהנוגדן המשני לדגירה של שעתיים בטמפרטורת החדר תוך써 ניעור (rocking). לבסוף, שטפו את הזחלים חמש פעמים ב-P-B-S-D-T כפי שהודגם זה עתה. הניחו את הזחלים במנח צדי על זכוכית כיסוי של מיקרוסקופ והוסיפו טיפה של מדיום קיבוע (mounting media).לאחר מכן, כסו בזהירות כל דג זברה עם זכוכית כיסואית ואטמו את זכוכית הכיסוי באמצעות לק ציפורניים. טיפול ב-MTZ למשך 36 שעות, החל מהיום ה-3.5 ועד היום החמישי לאחר ההפריה, מקטין באופן דרסטי את גודל הכבד. לאחר שטיפת ה-MTZ, ביטוי חזק של CFP ואדום מופיע מחדש תוך 30 שעות, כפי שניתן להעריך על ידי ביטוי של LCAM בממברנה של תאי אפיתל דרכי המרה.הרשת המרה התוך-כבדית קורסת בתחילה, אך מוקמת מחדש כעבור 54 שעות לאחר השטיפה (washout), מה שמעיד על התחדשות והחלמה מהירה של הכבד. בתמונות אלו מוצגים הפטוציטים בתהליך התחדשות, טרנסגניים לחלבון פלואורסצנטי אדום גרעיני המבטא באופן בלעדי בתאי אפיתל מרה של הכבד; רוב תאי ה-H2B-mCherry החיוביים בכבד המתחדש מבטאים HNF4α בשעה 0 של ההתחדשות ובשעה 48 של ההתחדשות. ההפטוציטים החיוביים ל-CFP שטופלו ב-MTZ עדיין שומרים על ביטוי H2B-mCherry, מה שמעיד על המרה של תאי אפיתל מרה להפטוציטים בעקבות אובדן חמור של הפטוציטים.במהלך ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבחור בכירית מלאה לאחר הטיפול ב-MTT עבור התחדשות הכבד העוקבת בעקבות פעולת הליזיס לאחר התפתחותה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום התחדשות הכבד לחקור את המנגנוים העומדים בבסיס התחדשות הכבד המונעת על ידי תאי פרוגניטור של הכבד. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להשתמש במודל פעולה ספציפי זה של hepatocyte למחקרים של דגנרציה של הכבד המונעת על ידי bilio.

hepatocyte-specific-ablation-zebrafish-to-study-biliary-driven-liver

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

המאמר מתאר אבלציה ממוקדת בכבד, שיטה לגרימת מוות של הפטוציטים עם מטרונידזול בזחלי דגי זברה טרנסגניים. פרוטוקול הדגימה מתאר את התהליך ליצירה, מניפולציה והערכה של אבלציה ממוקדת בכבד בדגי זברה.

אבלציה ממוקדת בכבד: גרימת מוות של הפטוציטים עם מטרונידזול בזחלי דגי זברה טרנסגניים

פיברוזיס מתמשך עם שקיעה של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים מוגזמים מוביל לשחמת. שימוש לרעה באלכוהול הוא אחד הגורמים העיקריים למחלת כבד קשה. הקמנו מודל כבד פיברוטי המושרה על ידי אתנול כדי לחקור את המנגנונים והאסטרטגיות לקידום התחדשות הפטוציטים בעת פציעה הנגרמת על ידי אלכוהול.

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

פרוטוקול זה מתאר ניתוח היסטולוגית של הכבד מן הזחלים דג הזברה כי טופלו באתנול 2% עבור 24 שעות. טיפול כזה אתנול חריפה התוצאות סטאטוזיס כבד נפיחות של כלי הדם הכבד.

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

מתרגם הריבוכמה אהדה הזיקה (מלכודת) מאפשר בידוד מהיר ויעיל של סוג תא ספציפי לתרגם mRNA. כאן, אנו מדגימים שיטה המשלבת הזרקת זנב הידרודינמי במודל העכבר של אוכלוסיית הכבד והמלכודת כדי לבחון את פרופיל הביטוי של אכלוס מחדש של hepatocytes.

סוג תא-ביטוי גנים ספציפי ליצירת פרופיל בכבד העכבר

כאן אנו להפגין שיטה לכמת את גודל הכבד בזחל zebrafish, מתן דרך להעריך את ההשפעות של מניפולציות גנטיות ופרמקולוגית על גידול בכבד ופיתוח.

בדיקת גודל הכבד בזחל זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להסרת האונה הגחונית של הכבד בדגי זברה בוגרים כדי לאפשר את המחקר של התחדשות הכבד.

כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה למבוגרים

במאמר זה אנו מציגים כיצד ליצור מודל של דגי זברה הקשורים למחלת כבד שומני שאינו אלכוהולי (NAFLD) כדי לחקור את ההשפעה של עודף כולסטרול על המיקרו-סביבה של הכבד ועל הנוף של תאי מערכת החיסון.

ניתוח של מיקרו-סביבה של הכבד במהלך התקדמות מוקדמת של קרצינומה הפטוצלולרית שאינה אלכוהולית הקשורה למחלת הכבד השומני בדגי זברה

כאן אנו מציגים שיטה אמינה לחקר התחדשות כליות במבוגרים על ידי גרימת פגיעה כלייתית חריפה על ידי הזרקת גנטמיצין. אנו מראים כי הפציעה תלויה במינון הגנטמיצין ובטמפרטורת הסביבה באמצעות הכלאה באתרה כדי לתייג lhx1a+ מפתח נפרונים חדשים.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

כאן אנו מתארים את זרימת העבודה לשימוש במערכת TetON להשגת ביטוי גנים ספציפי לרקמה בסנפיר הזנב המתחדש של דג הזברה הבוגר.

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

פרוטוקול זה מראה כיצד שיחתוך עיני planarian בעקביות (כוסות אופטיות) מבלי להפריע רקמות סובבות. באמצעות מחט אינסולין במזרק, או אחת או בשתי העיניים יכול להיות מלוטשים על מנת להקל על חקירת מנגנוני ויסות התחדשות העין, את האבולוציה של התחדשות ויזואלית, ואת הבסיס העצבי של התנהגות האור המושרה.

אבלציה כירורגית Assay עבור לימוד Regeneration Eye ב Planarians

חקור אבלציה ספציפית של תאי כבד בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה. השיטה משתמשת בטיפול במטרונידזול בזחלים טרנסגניים ובדיקת גודל הכבד וסמנים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

גלה סרטונים נוספים