Name: עשה ואל תעשה בהכנת השריר cryosections לניתוח היסטולוגית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: למד הכנת קריוסקשנים מביופסיות שריר תוך הימנעות מארטיפקטי הקפאה. השיטה כוללת הקפאה מהירה במתיל בוטאן, הטמעה ב-OCT וחיתוך לפרוסות בעובי שבע מיקרון. הטכניקה שומרת על מבנה הרקמה ומאפשרת הערכה היסטולוגית מדויקת של מחלות שריר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לאלכס מילר על תיקוני כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המחקר שהוענקו ל-M.G. מ-Cure CMD, Fight Against Muscular Dystrophy (SAM) ו-Muscular Dystrophy Association (218938).

1. רקמות קציר והקפאת רקמות שריר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם מנת יתר של isoflurane (2-כלורו-2- (difluoromethoxy) -1,1,1-trifluoro-אתאן). לבצע שלב זה במנדף ולהשתמש בשיטת בלימה משנית כגון ייבוש או צנצנת פעמון המכילה מקלון צמר גפן הטבול בisoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר מוות על ידי תקיפות לוחצים שודד דרכים. להשתמש בשיטה משנית של המתת חסד כגון נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את הפרווה עם אלכוהול 70% כדי לצמצם את דבק של קווצות שיער רופפות על השרירים. לקלף את העור מהאיבר באמצעות מלקחיים עדינים כגון מס &#39;5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להפריד את השריר של עניין (tibialis קדמי (ת&quot;א) במקרה זה) מהעצמות מתחת, החל מהגיד ולהסיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו השריר, לכסות אותו באוקטובר (מתחם טמפרטורה אופטימלי חיתוך), ולהניח אותה שטוח על תבנית הקפאה חד פעמית שכותרת. ודא שהשרירים הוא בה נטייה פיזיולוגית נורמלית (ועד ראש טאייב) ללא מתיחה. לחלופין, להקפיא את השריר על ריבועי קלקר קטנים ולהצמיד אותו באמצעות סיכות חרקים כדי להבטיח את האורך הנכון של השרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל 2-methylbutane (איזופנטאן) בכוס פלדה באמצעות חנקן נוזלי. זה לוקח על 3 ממוצעת - 5 דקות. שמור ערבוב לסירוגין עד משקעים לבנים מתחילים טופס בתחתית והקירות של הכוס. הערה: כאשר זה קורה, הגיע איזופנטאן טמפרטורת הקפאה אופטימלית (-150 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את התבניות המכילות שרירים ב2-methylbutane המצונן. להקפיא את השרירים קטנים כגון longus digitorum הסרעפת והפושטים (אדי) במשך 6 - 12 שניות ושרירים גדולים יותר כמו soleus הגסטרוקנמיוס (GS) והיד אחורית במשך 15 - 20 שניות. אין להקפיא את השרירים במשך זמן רב מדי שכן הדבר עלול להוביל לפיצוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הרקמות הקפואות בקרח יבש וללתת להתאדות איזופנטאן (שים לב שתהליך זה לוקח בממוצע כ -15 - 20 דקות). לעטוף את הרקמות ברדיד אלומיניום ולאחסן אותם בuטמפרטורת ltra נמוכה (C -70 ° C עד -80 °) עד חתך. </li></ol> 2. Embedding הרקמות ב אוקטובר להכין בלוק רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות תחבורה על קרח יבש לcyrostat כדי למנוע הפשרה. העברת רקמות לcryostat קאמרית (שנקבע ב -20 ל-24 מעלות צלזיוס, כדי למנוע הפשרה מלאה של רקמות) ולתת להם לאזן במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מפרץ פלטייה קירור ב. אם cryostat אין קירור זה, להשתמש בתרסיס קירור תרסיס להקפיא במהירות OCT. אל תתנו להפשרת שרירים בכל נקודה במהלך ההטבעה כמו זה יכול לגרום לנזק הקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף שכבה דקה אחידה של אוקטובר בדיסק הדגימה ולתת לו מגניב. כאשר רוב OCT קפוא בתחתית ועדיין נוזליים על גבי, הכנס את הרקמה בכיוון הנכון (בניצב לאוקטובר לסעיפים ומקביל רוחביים לאוקטובר לסעיפים אורך). להשתמש בתרסיס קירור תרסיס להקפיא במהירות אוקטובר לגעת בחלק unembeded של הרקמות עם שלוחה חוםractor ולחכות 45 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף עוד שכבה דקה של אוקטובר סביב השריר, לרסס עם תרסיס קירור תרסיסים ולחלץ את החום כמו בשלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על הוספת אוקטובר במרווחים קטנים ובמהירות להקפיא ב- OCT באמצעות שילוב של תרסיס ספריי קירור וחולץ חום עד שכל השריר מכוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים חולץ החום בחלק העליון של בלוק הרקמה ולחכות 5 דקות. </li></ol> 3. הכנת סעיפים וזיהוי הסעיפים מאזור אמצע בטן של השרירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הדגימה על ראש הדגימה. הדק את הידית כדי לאבטח את הדיסק. ודא שהדיסק הדגימה הוא במגע טוב עם ראש הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את טמפרטורת החדר לבין -21 ו-24 מעלות צלזיוס ולחכות עד שטמפרטורת הסט מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הגדרות העובי (7 מיקרומטר); חתוך את הבלוק על ידי קידום או חוזרים בי לחסום באמצעות הגדרות גסות ועדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את החלקיםבטרום חימם שקופיות מיקרוסקופ טעונות חיובי על ידי לחיצה על גבי השקופית על הסעיפים, באמצעות המשיכה בין מטענים המנוגדים כדי להקל על הדבקות של החלקים לחתוך לשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את החלקים באמצע הבטן-ידי מדידת שטח חתך (CSA) של החלקים. האם תוכנת הדמיה באמצעות זה במחשב שמחובר למיקרוסקופ. הערה: תמונות בניגוד השלב נלקחות והיקף של כל השריר נמדד באמצעות פונקצית מעקב על התוכנה. זו תניב שני CSA כמו גם קוטר חמוס מינימום (מדד לגודל חתך סיבים שמתבטא במרחק הקטן ביותר בין שני משיקים מקבילים בצדדים מנוגדים של חלקיק) מדידות. הערה: כאשר מדידות CSA וקוטר חמוס מינימום מתחילות רמה, כבר הגיעה באמצע הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאי וארכיון השקופיות ב -80 ° C לצביעת עתיד. הערה: Oct לא צריך להסיר לפני staininנהלי g. ברגע שקופיות coverslipped, הם מוכנים להיות מוכתמים באופן מיידי. </li></ol> 4. מכתים הערה: בעוד שניתן למצוא נהלי צעד-אחר-צעד מפורטים בגיליון הנתונים של המוצר וצריך להיות בעקבות הליכים מכתים, ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה אישי להשיג צביעה אופטימלית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגלל ההרכבה תקשורת (ראה טבלה) היא לא בליל עם מים, מייבשים שקופיות באמצעות ציונים גוברים של אלכוהול (2 דקות כל אחד ב -70%, 95%, ו 100% אתנול) ולנקות אותם עם קסילן (5 דקות) 100% על מנת להבטיח מגלשות לא להיות אטומות לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip סעיפים ולתת להם להתייבש. תמונה עם מיקרוסקופ מצויד בתוכנת הדמיה. </li></ol>

<ol><li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+disorders+%3A+NMD%22%5BJournal%5D)">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li>
<li>Caughey, J. E., Pachomov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diaphragm+in+dystrophia+myotonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The diaphragm in dystrophia myotonica.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).</li>
<li>Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophy.+I.+History%2C+clinical+status%2C+muscle+strength%2C+and+biopsy+findings%5BTitle%5D)+AND+%22AMA+J+Dis+Child%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings.</a> AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).</li>
<li>Platzer, A. C., Chase, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+Alterations+in+Preclinical+Mouse+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy.</a> The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).</li>
<li>Mercuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+magnetic+resonance+imaging+involvement+in+muscular+dystrophies+with+rigidity+of+the+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine.</a> Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).</li>
<li>Tasca, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+molecular+signatures+in+magnetic+resonance+imaging-staged+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles.</a> PloS one. 7, e38779(2012).</li>
<li>Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+apoptosis+improves+outcome+in+a+model+of+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy.</a> The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).</li>
<li>Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+1+improves+outcome+in+Lama2Dy-w+mice%2C+a+model+for+congenital+muscular+dystrophy+type+1A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A.</a> Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).</li>
<li>Mehuron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+matricellular+proteins+is+an+early+signature+of+pathology+in+laminin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+muscle%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy.</a> Skeletal muscle. 4, 14(2014).</li>
<li>Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+regeneration+and+tackling+apoptosis%3A+a+combinatorial+approach+to+treating+congenital+muscular+dystrophy+type+1+A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A.</a> Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).</li>
<li>Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+wax+embedded+muscle+is+suitable+for+the+diagnosis+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy.</a> Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li>
<li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li>
<li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+value+of+frozen+tissue+section+used+as+%27gold+standard%27+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry.</a> Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).</li>
<li>Turan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+frozen+sections+for+intraoperative+diagnosis+of+complex+atypical+endometrial+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pacific+journal+of+cancer+prevention+%3A+APJCP%22%5BJournal%5D)">Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia.</a> Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה שימשו ככלים מרכזיים בהבנת הביטוי וההתקדמות של פתולוגיה בהפרעות עצבית-שרירית שונות. קלסי, ביופסיות שריר היו קבועות ראשונה בפורמלין ולאחר מכן משובצות בשעוות פרפין. בעוד קיבעון פורמלדהיד שומר ארכיטקטורת רקמה ומאפשר אחסון והובלת רקמה ב RT, זה גם מנטרל אנזימים וחלבונים crosslinks המחייב צעדים נוספים להשגת immunostaining מדויק. בעיה זו בוטלה עם השימוש בחלקים קפואים אך שיטה זו מציבה אתגרים טכניים ייחודיים בהשגת תוצאות אופטימליות מכתימה ו14,15 פרשנו...

בדיקה של היסטולוגיה השריר משחקת תפקיד קריטי בהבנת סוגים שונים של הפרעות עצבית-שרירית של 1-4. בשילוב עם טכניקות אחרות, זה מאפשר לחוקרים לקבל מושג טוב יותר של הביטוי וההתקדמות של פתולוגיה וגם יכולים להיות חיוני כדי להעריך את היעילות של התערבות טיפולית 5-10. עם זאת, כדי להיות מדויק, הרקמות צריכה להישמר בצורה הנכונה על מנת לשמר את המצב הפיזיולוגי מייד לפני הכריתה. זה דורש זהירות רבה במהלך ההסרה, שימור, חתך, וצביעה. ניתן להכין רקמות בשתי דרכים שונות למחקר מיקרוסקופי אור. השיטה, פרפין פורמלין הקבוע הראשון משובץ קטעים (FFPE), דורש רקמות להיות קבועים בפורמלין שנאגרו טבעי 10% לפני שמוטבעים בשעוות פרפין 11,12. צעד הקיבעון עוזר לשמר מורפולוגיה טובה יותר, אבל יחסי ציבור אנדוגני קישורים גם צולביםoteins לפיכך מחייב נהלים אחזור אנטיגן המורכב עבור immunostaining ומבטל את האפשרות של מכתים האנזימטית בסעיפים כגון 12. חלקים קפואים, לעומת זאת, לא צריכים להיות מראש קבועים או מעובד; לכן, חלבונים יכולים לשמור תצורות ביולוגיות יליד 13,14. יתר על כן, חלקים קפואים גם לאפשר לזמן אספקה ​​מהיר, שלעתים יש צורך, למשל באבחון תוך הניתוחי של סרקומות וביופסיות כירורגיות אחרות 15. עם זאת, אם לא נעשה כראוי, בשיטה זו היא נוטה להקפיא נזק, אשר מציג שינויים בארכיטקטורת שרירים מה שהופכים את החלקים שאינם ראויים לבדיקה היסטולוגית. מאמר זה מתאר את השיטה היעילה ביותר להכנת ביופסיות שריר על מנת להשיג צביעה אופטימלית לבדיקה נאותה.

<table><tbody><tr><td>Cryostat</td><td>Leica CM 1850</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>באפלו גרוב, אילינוי 60089 ארה"ב, טלפון משרדי 1-800-248-0123 אלטרנטיבה: ריצ'רד אלן סיינטיפיק</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., טלפון: 1-631-547-8500 אלטרנטיבה: אולימפוס</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונות</td><td>Nikon Imaging Software Basic Research</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, ארה"ב, טלפון: 1-631-547-8500 חלופות: Image J, Metamorph</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>14043-220-05</td><td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td><td>1923 West Peoria Avenue, פיניקס, אריזונה 85029 ארה"</td></tr>ב<tr><td>אוק</td><td>4583</td><td>סאקורה בע"מ</td><td>Torrence, CA 90501 U.S.A. מקור חלופי: Leica Microsystem</td></tr><tr><td>להקפיא את זה</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, קיימברידג', MA, 02139 U.S.A. מקור חלופי: VWR Scientific</td></tr><tr><td>תבנית רקמות חד פעמית</td><td>22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. מקור חלופי: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Colorfrost פלוס שקופיות</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. מקור חלופי: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. מקור חלופי: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>HC-1300-1GL</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. מקור חלופי: VWR Scientific</td></tr><tr><td>2-methyl butane</td><td>M 32631-SL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. מקור חלופי: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. מקור חלופי: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. מקור חלופי: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxylin Gill #3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, קיימברידג', MA 02139 ארה"ב מקור חלופי: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>6766007</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. מקור חלופי: VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

עשה ואל תעשה בהכנת השריר cryosections לניתוח היסטולוגית

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

הערכה היסטולוגית של ביופסיות שריר שימשה ככלי הכרחי בהבנה של ההתפתחות וההתקדמות של הפתולוגיה של הפרעות עצבית-שרירית. עם זאת, על מנת לעשות זאת, טיפול נכון צריך לקחת כאשר מוציא ושימור רקמות להשיג צביעה אופטימלית. אחת שיטות לשימור רקמות כרוכה תיקון רקמות בפורמלין ולאחר מכן הטבעתם בשעוות פרפין. שיטה זו שומרת מורפולוגיה היטב ומאפשרת לאחסון לטווח ארוך ב RT, אבל הוא מסורבל ודורשת טיפול בכימיקלים רעילים. יתר על כן, תוצאות קיבעון פורמלדהיד בקישור צולב אנטיגן, אשר מחייב פרוטוקולים אחזור אנטיגן לimmunostaining היעיל. להיפך, חתך קפוא אינו דורש קיבוע ובכך שומר על קונפורמציה אנטיגן ביולוגית. שיטה זו גם מספקת יתרון בולט בסיבוב מהיר סביב זמן, מה שהופך אותו לשימושי במיוחד במצבי צורך הערכה היסטולוגית מהירה כמו intraoperative ביופסיות כירורגיות. כאן אנו מתארים את השיטה היעילה ביותר להכנת ביופסיות שריר להדמיה עם כתמים היסטולוגית וחיסוניים שונים.

ההגדרה לקציר והקפאת רקמות שניתן לראות באיור 1. רקמות נכרת צריכה להיות מאוחסנות בגזה טבולה בPBS להימנע (איור 1 א) ייבוש. כאשר רקמות נבחרו לשמש לניתוח היסטולוגית הם צריכים להיות טבולים בOCT ומונחים על תבנית cryo בכיוון הנכון וקרוב לאורך פיסיולוגי ככל האפשר כדי להבטיח מורפולוגיה מדויקת (איור 1). תרחיף של איזופנטאן המתאים להקפאה רקמה יכול להיות מושגת על ידי קירור איזופנטאן בחנקן נוזלי וערבוב עד משקעים לבנים קטנים יופיעו בתחתית. בשלב ז...

כאן אנו מדגימים את השיטות היעילות ביותר להקפאה, הטמעה, הקפאה וצביעה של ביופסיות שריר כדי למנוע הקפאת חפצים.

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא למנוע כשלים בעת הכנת חתכים קפואים מביופסיות של שריר, כגון יצירת ארטיפקטים של הקפאה. דבר זה מושג תחילה על ידי הקפאה מהירה של השריר במתיל בוטאן שקולל בחנקן נוזלי. לאחר שהביופסיות של השריר מגיעות לשיווי משקל בקריוסטט, הן מוטמעות במדיום OPT (optimum cutting temperature) בטמפרטורת החדר במנות קטנות, תוך הקפאה מהירה באמצעות קירור באيروسול וסילוק חום.שבעה חתכים בני מיקרון נסרחים ומועברים לשקופיות זכוכית חמות וטעונות חיובית. השלב האחרון הוא צביעת חתכי הרקמה לפי הצורך כדי להעריך את ההיסטולוגיה של הרקמה. בסופו של דבר, ביופסיות שריר שהוכנו נכונה מביאות להיסטולוגיה של רקמה שנשמרה היטב ללא ארטיפקטים של הקפאה.אם כן, היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון חיתוך רקמות טבולות בפרפין, הוא שהיא מהירה מאוד ואינה משנה את המבנה או התפקוד של אנטיגנים אנדוגניים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לבריאות ולמחלות בביולוגיה של השריר, כגון גדילה, התחדשות, דלקת, פיברוזיס ונמק. ההשלכות של טכניקה זו חולשות לכיוון של טיפול או אבחון של הפרעות שריריות, מכיוון שהיא מאפשרת קביעה של מצב שריר בריא ושריר חולה.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי צורות שונות של דיסטרופיה שרירית, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון קשקשיה (cachexia) הקשורה לשלבים סופיים של סרטן ואיידס, ואובדן מסת שריר באוכלוסיות קשישים. התחל בהמתת עכבר באמצעות מינון יתר של isof fluorine תחת מנדף ובתוך רמה שנייה של הכלה, כגון צנצנת פעמון. ודא את מות בעל החיים על ידי לחיצה חזקה על כרית כף הרגל שלו.כעת, הרטב את הפרווה ב-70% alcohol. פעולה זו מונעת מחוטי שיער רופפים להידבק לשרירים. המשך בקילוף העור מהגפה באמצעות פינצטה עדינה מספר חמש.הפרידו בזהירות את השריר המבוקש מהעצם, החל מהגיד. במקרה זה, מבודד השריר tibias anterior. לאחר כריתת השריר, כסו אותו ב-OCT והניחו אותו בצורה שטוחה על תבנית הקפאה חד-פעמית מסומנת.OCT נוסף יתווסף מאוחר יותר לפני הפריסה. ודאו שהשריר נמצא באוריינטציה פיזיולוגית רגילה לאורך הציר מהראש לזנב ושהשריר אינו מתוח. כעת קיררו.השתמשו בכמות מסוימת של isop pentane בכלי זכוכית מפלדה בעזרת חנקן נוזלי. ערבבו את התמיסה לסירוגין במשך שלוש עד חמש דקות באמצעות שפכטל פלסטיק. כאשר נוצר משקף לבן, ה-isop pentane נמצא בטמפרטורה האופטימלית שלו; בנקודה זו, טבלו את התבניות הטעונות לתוך התמיסה.שרירים קטנים, כגון הסרעפת והשריר הפושט של האצבעות (extensor digitorum longus), דורשים בין 6 ל-12 שניות. שרירים גדולים יותר דורשים 15 עד 20 שניות, שכן הקפאה ממושכת מדי עלולה להוביל לסדקים. השלב הבא הוא הנחת הרקמות הקפואות על קרח יבש כדי לאפשר לאיסופנטאן השיורי להתאדות, תהליך שארך כ-15 עד 20 דקות.ברגע שהרקמה יבשה, עטפו אותה בנייר אלומיניום ואחסנו אותה במקפיא של 80- degrees Celsius עד לביצוע החיתוך. לפני החיתוך, העבירו את הרקמות הקפואות על קרח יבש לקריוסטט.העבר את הרקמה לתא קריוסטט המכוון לטמפרטורה שבין 20- ל-24- מעלות צלזיוס, והמת 30 דקות להגעה לשיווי משקל. הרקמות לא יפשירו באופן מלא בטמפרטורה זו. לאחר מכן, בצע תחילה הטמעה של הרקמה.אם זמין, הפעל את קירור ה-Peltier Bay. שנית, מרח שכבה דקה ואחידה של OCT על דיסק הדגימה והמתן לקירור. שלישית, לאחר שה-OCT קפא בתחתית אך עדיין נוזלי בחלקו העליון, הכנס את הרקמה, והנח אותה בניצב ל-OCT עבור חתכים רוחביים או במקביל ל-OCT עבור חתכים אורכיים.כעת השתמשו בתרסיס קירור אירוסול כדי להקפיא במהירות את ה-OCT. לאחר מכן, געו בחלק הבלתי מוכנס של הרקמה בעזרת מושך חום והחזיקו אותו על הרקמה למשך 45 שניות. אל תתנו לשריר להפשיר בשום שלב במהלך תהליך זה.אם לקריוסטט אין קירור Peltier bay, השתמשו בקירור אירוסול כדי להקפיא במהירות את ה-OCT מסביב לרקמה. כעת, הוסיפו שכבה דקה נוספת של OCT מסביב לשריר, רססו בתרסיס קירור אירוסול והוציאו את החום כפי שבוצע בשלב הקודם. המשיכו להוסיף OCT בכמויות קטנות והקפיאו אותו במהירות באמצעות שילוב של תרסיס קירור אירוסול ומחלץ חום, עד שכל השריר יהיה מכוסה.לאחר מכן, הניחו את השולף התרמי בחלקו העליון של גוש הרקמה והמתינו חמש דקות לפני תחילת החיתוך. הדגימה מוכנה כעת להרכבה על ראש הדגימה. ראשית, הדקו את הכפתור כדי להבטיח את קיבוע הדיסק.ודאו שדיסק הדגימה נמצא במגע טוב עם ראש הדגימה בזמן שהתא מגיע לטמפרטורה שבין 24- ל-20- מעלות צלזיוס. הגדירו את עובי הפרוסה לשבעה מיקרון כאשר התא נמצא בטמפרטורה הרצויה, והתחילו בקיצוץ הבלוק. השתמשו בכוונון הגס והעדין כדי להזיז את הבלוק.כאשר החתכים מוכנים לאיסוף, הצמידו את צדדיהם העליונים לשקופיות טעונות חיובית שחוממו באמצעות מנורה. אם ההקפאה בוצעה כהלכה, פני הרקמה צריכות להיות בצבע לבן גיר. עם זאת, רקמה שהוקפאה באופן לא תקין או שהפשירה במהלך תהליך ההעברה תיראה בצבע אדום עד ורוד.ניתן לאחסן את השקופיות במקפיא עמוק לצורך ניתוח עתידי. ניתן לזהות את החלק המרכזי של הבטן של הרקמה על ידי מדידת שטח החתך הרוחבי מתמונות בניגודיות פאזה (phase contrast), באמצעות פונקציית העקיבה של חבילת תוכנה לעיבוד תמונות. ניתוח זה מספק מדידות הן של השטח והן של קוטר הפרט (ferret diameter) המינימלי.כאשר מדידות אלו מתחילות להגיע למישור (plateau), סימן שהגענו למרכז הבטן. בעוד שיצרנים מספקים הוראות שלב-אחרי-שלב עבור רוב פרוטוקולי הצביעה, ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה אישית כדי להשיג עצימויות צביעה מיטביות. אין צורך להסיר את ה-OCT.לצורך צביעה, וכדי להשיג צביעה אימונו-היסטוכימית אופטימלית, יש להשתמש בתא לחות. על התא להיות מכוסה ב-perfil המונח על נייר סופג רטוב ואטום בתוך קופסה קטנה כדי למנוע ייבוש של החתכים. במהלך תהליך הצביעה עבור שקופיות להרכבה קבועה שאינן צבועות אימונו-היסטוכימית, ובהתאם לפרוטוקול הצביעה, יש לבצע דהידרטציה לשקופיות באמצעות סדרות של אלכוהול בריכוזים עולים.מכיוון שחומרי סגירה אינם נמסים במים, יש לנקות את השקופיות באמצעות טבילה של חמש דקות ב-100% xylene. פעולה זו מבטיחה שהשקופיות לא יהפכו עכורות עם הזמן. לאחר מכן, המשיכו לסגירה ולדימות של חתכים מאזור מרכז הבטן של שרירי ה-tibials anterior שנצבעו.באמצעות צביעה ב-hematoxylin ו-eosin. לסמנש (sections) שעברו עיבוד תקין תהיה מורפולוגיה עקבית וצביעה אחידה, בעוד ששרירים שעברו עיבוד לקוי עקב נזקי הקפאה או הפשרה מוקדמת ייראו כבעלי שברים מרובים במורפולוגיה ויזכירו במראהם דגני חיטה גרוסים.בנוסף, בוצע אימונוהיסטוכימיה על חתכים אלה. צביעות אלו היו מספקות. פיברונקטין נצבע בירוק ו-dappy נראה בכחול.לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להגיע להבנה מעמיקה של אופן הכנת נתח קפוא תקין מביופסיות של שריר לצורך הערכה של ארכיטקטורת השריר. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך ארבע עד חמש שעות בקירוב, במידה וכל השלבים מבוצעים כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור למנוע את הפשרת השרירים לאחר סיום התהליך.ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון צביעה אימונוהיסטוכימית והיברידיזציה באתר (in situ hybridization), על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לצמיחה ולהתחדשות.

do-s-don-ts-preparation-muscle-cryosections-for-histological

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הפגינו וידאו זו הן טכניקות פלאש מקפיא חתך ברקמת המוח העובריים של העכבר. טיפים שימושיים לשימוש cryostat מקבלים, כולל שיטות לפתרון בעיות שניתן להשתמש בהם בעת חיתוך על מנת להבטיח כי הסעיפים רקמות כתוצאה חופשיים של סדקים ועיוותים אחרים.

פלאש מקפיא Cryosectioning E12.5 מוח עכבר

סרטון זה מתאר את הליך הקפאת רקמת השריר והשגת החלקים הדקים שלה. הטכניקה יכולה לסייע בחקר קכקסיה הקשורה לסרטן במודלים של עכברים לסרטן המעי הגס.

הקפאה מהירה של רקמת שריר לצורך חיתוך: פרוטוקול להשגת מקטעים דקים במיוחד של רקמת שריר מורין שהוקפאה במהירות

ניתוח רקמות שריר השלד לקביעת תכונות מבניות, תפקודיות וביוכימיות מקל מאוד על ידי הכנה מתאימה.  פרוטוקול זה מתאר שיטות מתאימות להכנת רקמת שריר השלד למגוון רחב של מחקרי פנוטיפ.

Triage רקמות ומקפיאים למודלים של מחלות שרירי שלד

בכתב יד זה, אנו מציגים פלטפורמת קריוהיסטולוגיה אוטומטית למחצה בעלת תפוקה גבוהה להפקת תמונות מרוכבות מיושרות של מדדי תגובה מרובים ממספר סבבים של הדמיה פלואורסצנטית על חלקים קפואים של רקמות מינרליות.

תפוקה גבוהה, Multi-תמונה Cryohistology של רקמות Mineralized

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט להניע התחדשות שרירי שלד חריפה בעכברים בוגרים ומניפולציות הבאות של השרירים, כגון לנתיחה, מקפיא, חיתוך, מכתים שיגרתי, וניתוח שטח החתך myofiber.

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

קריו-סעיפים רצופים נאספים כדי לאפשר יישומים היסטולוגית והעשרה של RNA למדידות ביטוי גנים באמצעות אזורים סמוכים מתוך שרירי שלד יחיד עכבר. RNA באיכות גבוהה מתקבל מ 20 - 30 מ"ג של cryosections ומדידות ונקווה מושווים ישירות בין יישומים.

Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית

פרוטוקול זה מתאר הליך להקפיא רקמות שרירות על ידי ותקע אותם ישירות לתוך חנקן נוזלי. פרוטוקול זה גם מדגיש cryovial חדש שיכול למנוע את "אפקט השמיכה" של גז חנקן כאשר מגעי חנקן נוזליים על פני שטח הרקמות של דגימה.

מבטל Multi-חור cryovial הקפאת חפצים כאשר השרירים שקועים ישירות בחנקן נוזלי

Autophagy פעיל קשורה התחדשות שריר פרודוקטיבי, אשר חיוני עבור תא גזע שריר (MuSC) ההפעלה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לזיהוי באתרה של LC3, סמן autophagy ב MyocS חיובי Myocs של קטעים רקמות שריר מן שליטה ועכברים שנפגעו.

ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

שמתואר כאן הוא פרוטוקול עבור חיסונית ישירה של מיותטיות של מיוכי שרירים סעיפים. התאים הנקרוסטיים הם חדירות לחלבונים בסרום, לרבות חיסוני G (IgG). חשיפת ספיגת IgG על ידי מיותסיבים מאפשר זיהוי וקוונפיקציה של מיותסיבים שעוברים נמק ללא קשר למצב שריר.

אימונוולבלינג מיוכי ניוון שרירים ביופסיות

פרוטוקול זה מתאר שיטות המשמשות להכנת קפלי קול חולדה למחקר נוירו-שרירי היסטוכימי.

הכנת קפל קול חולדה עבור ניתוחים עצביים שריריים

עדויות הולכות וגוברות מצביעות על כך שחדירה מוגזמת של שומנים בתוך שרירי השלד גורמת לליפטוקסיות ולסוכרת. כאן אנו מציגים פרוטוקול שלם, כולל עיבוד רקמות, צביעה עם Bodipy, רכישת תמונה וניתוח, כדי לכמת את הגודל, הצפיפות וההתפלגות התת-תאית של טיפות שומנים באופן ספציפי מסוג סיבים.

סוג הסיבים וניתוח ספציפי תת-תאי של תכולת טיפות השומנים בשרירי השלד

למד הכנת קריוסקשנים מביופסיות שריר תוך הימנעות מארטיפקטי הקפאה. השיטה כוללת הקפאה מהירה במתיל בוטאן, הטמעה ב-OCT וחיתוך לפרוסות בעובי שבע מיקרון. הטכניקה שומרת על מבנה הרקמה ומאפשרת הערכה היסטולוגית מדויקת של מחלות שריר.

עשה ואל תעשה בהכנת השריר cryosections לניתוח היסטולוגית

גלה סרטונים נוספים